一株对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于环保技术领域，具体涉及一种对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌重组菌株的及其构建方法与环保领域上的应用。

背景技术：

五氯苯酚(pentachlorophenol,pcp)，又名五氯酚；常含一分子结晶水，稍热有极强辛辣臭味。五氯苯酚能阻止真菌生长、抑制细菌，长期以来被用做除草剂、杀虫、杀菌剂、防霉剂等。然而，pcp在所有酚类中毒性物质中的毒性最大，具有很强的“三致”(致癌、致畸、致突变)效应。1970年代，美国环境保护局已将其纳入优先污染物名单(waterres.，2004，38：663-672)，在我国，pcp被列为水环境优先控制的68种污染物名单。五氯苯酚不易被氧化，也难于水解，有蓄积作用，它能够在生物中大量富集，并且浓度远远超过它在水中的浓度。pcp在土壤或积淀物上，具有很高的吸附性，能被植物吸收，通过生物富集进入食物链(trendsinbiotehcnolgoy,20:243-248.)。pcp的生物危害性在自然环境中的迁移、转化及其降解，一直是业界研究和关注的热点。

五氯苯酚的处理方法，主要物理法，化学法和生物法三种。物理法主要包括吸附法、丫射线法、超声波法等。化学法主要包括电化学、fenton试剂法、零价金属还原法、二氧化锰法等。生物法中包含很多种微生物，不同种类的微生物由于其降解污染物的生化机制不同，使得pcp的降解途径多样化，但降解过程均为先脱氯转化为低氯代化合物后再开环得到降解或矿化。pcp的生物降解过程中最重要的限制步骤是氯取代基的去除，pcp的生物脱氯主要有氧化脱氯机制和厌氧还原脱氯机制(appliedandenvironmentalmicrobiology,75:5910-5918.)。其中，厌氧还原脱氯机制是最常见和有效的降解方法。

生物法具有成本低、效率高、无二次污染、不破坏环境等优点，将在pcp治理过程中有广阔的应用前景。厌氧还原脱氯过程中，一些fe(iii)还原菌bacillus、geobacter、pesudomonas和clostridium等起到极其重要的作用(scienceofthetotalenvironment,473:215-223.)。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一株经过二型内含子基因插入失活技术得到的对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述拜氏梭菌在对五氯苯酚脱氯方面的应用，以提高生物法降解pcp的效率。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌，在拜氏梭菌中失活cbei_3304基因，使该基因在拜氏梭菌中不能正常表达。cbei_3304基因编码一种疑似膜蛋白，此膜蛋白的功能缺失，能够提高胞内一些物质的交换与流动性，进而提升拜氏梭菌对五氯苯酚的脱氯效率。

其中，所述cbei_3304基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

其中，所述拜氏梭菌为拜氏梭菌ncimb8052。

上述对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将内含子序列构建到二型内含子基因敲除质粒中，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒转化拜氏梭菌，筛选得到cbei_3304基因失活的菌株，既得到五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌。

优选地，所述内含子序列的核苷酸序列如seqidno：2所示，内含子序列的插入位点为seqidno：1中第335bp和第336bp之间。

优选地，所述二型内含子基因敲除质粒为pwj质粒。

上述对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌的构建方法，所述拜氏梭菌为拜氏梭菌ncimb8052。

上述对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌的构建方法构建得到的拜氏梭菌在本发明发保护范围之内。

上述拜氏梭菌在对五氯苯酚高效脱氯还原中的应用在本发明的保护范围之内。该菌株可以用于土壤、水体中五氯苯酚的脱除。

本发明的有益效果是：

本发明将拜氏梭菌中编码膜蛋白的cbei_3304基因进行插入失活后，使得此基因不能正常表达，获得cbei_3304基因插入失活的重组菌株，既重组菌株m-3304，在含有3.0mg/l的五氯苯酚、0.15g/l甲基紫精(mv)和6.44g/l柠檬酸铁甲的模拟废水中，60小时内，五氯苯酚的还原脱氯率达到90％；在同等条件下，而出发菌株拜氏梭菌ncimb8052对五氯苯酚的还原脱氯率只有40％；拜氏梭菌重组菌m-3304对五氯苯酚的还原脱氯效率，是出发菌株的2.25倍。本发明得到的重组菌是一株适用于五氯苯酚还原脱氯的优良菌种，可广泛应用于水、固体垃圾、固体废弃物和土壤中五氯苯酚的降解，本发明属于环保领域。

附图说明

图1为本发明插入失活载体pwj的质粒图谱；

图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图；

图3为转化子菌落pcr电泳图；泳道1、泳道2、泳道4为野生型菌株ncimb8052的cbei_3304基因片段大小，泳道3为插入失活突变株m-3304的cbei_3304基因片段大小，泳道5为marker；

图4为本发明拜氏梭菌m-3304和初始菌株ncimb8052在模拟废水中，对五氯苯酚的脱氯实验结果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：拜氏梭菌cbei_3304基因插入失活突变株的构建。

构建拜氏梭菌cbei_3304基因插入失活突变株的原理如图2所示，具体构建过程包括以下步骤：

(1)cbei_3304插入失活载体的构建

1)设计内含子

根据ncbi数据库收录的拜氏梭菌的cbei_3304基因序列(如seqidno：1所示)，借助软件设计合适的插入基因位点(http://www.clostron.com)，选择插入在第101～102个碱基之间，并生成内含子序列，合成内含子序列s-304(其序列如seqidno：2所示)，并设计以下引物。

克隆引物：

pwj-osc-304-s：5’-ggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttacacttcgcc-3’，其序列如seqidno：3所示；

pwj-osc-304-a：5’-ggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataag-3’，其序列如seqidno：4所示。

验证引物：

cbei-3304-t-s：5’-taaattacctacagcaaaactgtg-3’，序列如seqidno：5所示；

cbei-3304-t-a：5’-ggaattaagaaccttgaatctatc-3’，序列如seqidno：6所示。

引物pwj-osc-304-s引入xhoⅰ酶切位点(下划线部分)，引物pwj-osc-304-a引入bsrgⅰ酶切位点(下划线部分)。

2)cbei_3304-pwj-304重组载体构建

用xhoⅰ和bsrgⅰ双酶切载体pwj，pwj质粒图谱如图1所示，其序列如seqidno：7所示。酶切产物经纯化试剂盒(takara)纯化后，与内含子序列s-304通过一步克隆(clonexpress)连接。将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌e.colidh5a，涂布到含有50μg/ml氨苄霉素抗性lb平板，37℃培养12～16h，挑取转化子，接到液体含有50μg/ml氨苄霉素lb培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒(axygen)，测序验证，获得cbei_3304-pwj-304重组载体。

3)cbei_3304-pwj-304重组载体的甲基化

制备e.colitop10/pan2的化学感受态，将测序成功的cbei_3304-pwj-304重组载体转化到大肠杆菌e.colitop10，由于pan2质粒具有四环素抗性，故涂布到含有50μg/ml氨苄霉素和10μg/ml四环素双抗性lb平板，37℃培养12～16h，挑取转化子，接到液体含有50μg/ml氨苄霉素和10μg/ml四环素lb培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取甲基化的cbei_3304-pwj-304重组载体(pan2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)，即cbei_3304插入失活载体。

(2)cbei_3304插入失活载体转化拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)

1)将clostridiumbeijerinckiincimb8052接种至yps培养基(酵母粉3g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖1g/l，乙酸铵2g/l，氯化钠3g/l，七水合硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钾1g/l，七水合硫酸亚铁0.1g/l，ph＝6。)37℃过夜培养，次日以5％比例接种到yps培养基，37℃培养6-8h，以10％接种到2×ytg培养基(酵母粉16g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖5g/l，氯化钠5g/l)37℃培养3h，od600nm＝1；

2)取50ml拜氏梭菌菌液，5000rpm，4℃离心10min，弃上清。在以etm缓冲液(270mm蔗糖，0.6mmna2hpo4，4.4mmna2hpo4，10mmmgcl2)重悬；同上离心，去上清，再次以etm缓冲液重悬，同上离心，彻底取上清；

3)以1mlet缓冲液(270mm蔗糖，0.6mmna2hpo4，4.4mmnah2po4重悬，取200μl，加入1ugcbei_3304插入失活载体，加入0.2cm预冷的电转杯，轻轻混匀；

4)使用micropulsertm电转仪电转，条件为电压1.8kv，电阻200ω，电容2.5μf，电击后立刻加入1ml2×ytg培养基，转移到无菌离心管中复苏2～3h；

5)取200μl上述菌液，涂布到含有10μg/ml红霉素的yps固体培养基，培养2～3天。

(3)cbei_3304插入失活突变株的筛选

挑取上述步骤5)中培养2～3天的转化子，使用引物cbei-3304-t-s和cbei-3304-t-a对转化子进行菌落pcr验证，筛选出内含子插入基因组的突变株(插入后，pcr扩增出基因条带电泳图上比野生型大约1kbp)，如图3所示，将正确插入的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的yps固体培养基上，筛选出敲除质粒丢失的突变株(在红霉素抗性平板上不能生长的突变株)。

实施例2：拜氏梭菌在模拟废水中对五氯苯酚的脱氯实验。

(1)培养基配方：

yps培养基：酵母粉3g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖1g/l，乙酸铵2g/l，氯化钠3g/l，七水合硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钾1g/l，七水合硫酸亚铁0.1g/l，ph＝6。

模拟废水：葡萄糖2g/l，氯化钾0.9g/l，氯化铵1.0g/l，一水合磷酸二氢钠0.6g/l，一水合氯化钙0.02g/l，酵母膏0.05g/l，电子介体(mv)0.15g/l，柠檬酸铁6.44g/l,五氯苯酚3mg/l和微量元素(h3bo33g/l，znso4·7h2o0.9g/l,mncl2·2h2o2.4g/l,cuso4·5h2o0.6g/l,cocl2·6h2o3g/l,(nh4)6mo7o24·2h2o0.02g/l,nicl2·6h2o0.1g/l)5ml/l。

(2)在yps培养基中活化拜氏梭菌组菌m-3304和初始菌株ncimb8052，培养温度37℃，厌氧培养时间12h。然后取40ml菌液，10000rpm离心5min，倒掉上清，将菌体转接入20ml的模拟废水中，通入n25分钟，排出氧气，迅速密封，培养温度30℃，150rpm摇床培养。拜氏梭菌对模拟废水中五氯苯酚的还原脱氯效果，如图4所示。

可以看出，在60h时，拜氏梭菌重组菌m-3304对五氯苯酚的还原脱氯率达到了90％，同等条件下，而出发菌株ncimb8052对五氯苯酚的还原脱氯率只有40％左右。拜氏梭菌重组菌m-3304对五氯苯酚的还原脱氯效率，是出发菌株的2.25倍。

sequencelisting

<110>南京中泰生物科技有限公司

<120>一株对五氯苯酚高效脱氯的拜氏梭菌及其构建方法与应用

<130>sg20170613

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>723

<212>dna

<213>cbei_3304基因

<400>1

atgacaaaggttaataaattacctacagcaaaactgtggaatccgaaatcatttattata60

ttttccgtatttttctcatttctgccagctggaatcatgtgtgctttgaattatggacga120

tctggaagtcaaaaaaagaagtggatatttcttttagcaagcatcttagtgtttatagca180

cttatagcacttctgcctatattatcaattaatacttctatcatatttttcagtattaat240

atagctttaggcataattcttatgtttacacagttaaagctgtataatgaacatattcaa300

aatggcgggcaaagtgcttcgtatttatttcctataatcatagggcttttgattttttca360

ttgtcagctgcttcaattctatactcaatttacgtgccaaaaaatgctcttgattatggc420

gaaaatcacttattttatactaataagataacagaatcccaagcgaaaaaacttggagat480

tatttaaattcagaaggatacttcactcctagttcaaaagtggacgttaagattgataaa540

caagatacactctatattttatctctcgttgtagaaggtgactataaaagtgatacaagc600

tatgtagaacctatgaaagcaatatcaaaagagatttcaaaaaatgtttttgaaaataat660

aaagttagaatagatttatgcaatgatagattcaaggttcttaattccatcaatgttgat720

taa723

<210>2

<211>344

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>内含子序列s-304

<400>2

ctcgagataattatccttacacttcgcccgcgtgcgcccagatagggtgttaagtcaagt60

agtttaaggtactactctgtaagataacacagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaa120

agctgatacgggaacagagcacggttggaaagcgatgagttacctaaagacaatcgggta180

cgactgagtcgcaatgttaatcagatataaggtataagttgtgtttactgaacgcaagtt240

tctaatttcggttaagtgtcgatagaggaaagtgtctgaaacctctagtacaaagaaagg300

taagttatggcgggcgacttatctgttatcaccacatttgtaca344

<210>3

<211>43

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pwj-osc-304-s

<400>3

ggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttacacttcgcc43

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pwj-osc-304-a

<400>4

ggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataag42

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cbei-3304-t-s

<400>5

taaattacctacagcaaaactgtg24

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cbei-3304-t-a

<400>6

ggaattaagaaccttgaatctatc24

<210>7

<211>8601

<212>dna

<213>载体pwj

<400>7

tacagaggaagaacagaaaaaagaacgtacatgcattaaatattatgcaaggagctttaa60

aaaagctcatgtaaagaagagtaaaaagaaaaaataatttatttattaatttaatattga120

gagtgccgacacagtatgcactaaaaaatatatctgtggtgtagtgagccgatacaaaag180

gatagtcactcgcattttcataatacatcttatgttatgattatgtgtcggtgggacttc240

acgacgaaaacccacaataaaaaaagagttcggggtagggttaagcatagttgaggcaac300

taaacaatcaagctaggatatgcagtagcagaccgtaaggtcgttgtttaggtgtgttgt360

aatacatacgctattaagatgtaaaaatacggataccaatgaagggaaaagtataatttt420

tggatgtagtttgtttgttcatctatgggcaaactacgtccaaagccgtttccaaatctg480

ctaaaaagtatatcctttctaaaatcaaagtcaagtatgaaatcataaataaagtttaat540

tttgaagttattatgatattatgtttttctattaaaataaattaagtatatagaatagtt600

taataatagtatatacttaatgtgctgcagtataaaatataaataattttctaaaaaact660

taacttcatgtgaaaagtttgttaaaatataaatgagcacgttaatcatttaacatagat720

aattaaatagtaaaagggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttaaaggacgtag780

atgtgcgcccagatagggtgttaagtcaagtagtttaaggtactactctgtaagataaca840

cagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaagctgatacgggaacagagcacggttgga900

aagcgatgagttacctaaagacaatcgggtacgactgagtcgcaatgttaatcagatata960

aggtataagttgtgtttactgaacgcaagtttctaatttcggtttccttccgatagagga1020

aagtgtctgaaacctctagtacaaagaaaggtaagttaacatctacgacttatctgttat1080

caccacatttgtacaatctgtaggagaacctatgggaacgaaacgaaagcgatgccgaga1140

atctgaatttaccaagacttaacactaactggggataccctaaacaagaatgcctaatag1200

aaaggaggaaaaaggctatagcactagagcttgaaaatcttgcaagggtacggagtactc1260

gtagtagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggtacagttattgtgtact1320

aaaattaaaaattgattagggaggaaaacctcaaaatgaaaccaacaatggcaattttag1380

aaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatatagacgaagtttttacaagactttatcgtt1440

atcttttacgtccagatatttattacgtggcgacgcgttgggaaatggcaatgatagcga1500

aacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcattgtcatcgtcacgtgattcataaacaca1560

agtgaatgtcgacagtgaatttttacgaacgaacaataacagagccgtatactccgagag1620

gggtacgtacggttcccgaagagggtggtgcaaaccagtcacagtaatgtgaacaaggcg1680

gtacctccctacttcaccatatcattttctgcagccccctagaaataattttgtttaact1740

ttaagaaggagatatacatatatggctagatcgtccattccgacagcatcgccagtcact1800

atggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcactcgtagtagtctga1860

gaagggtaacgccctttacatggcaaaggggtacagttattgtgtactaaaattaaaaat1920

tgattagggaggaaaacctcaaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaagaatcagta1980

aaaattcacaagaaaatatagacgaagtttttacaagactttatcgttatcttttacgtc2040

cagatatttattacgtggcgtatcaaaatttatattccaataaaggagcttccacaaaag2100

gaatattagatgatacagcggatggctttagtgaagaaaaaataaaaaagattattcaat2160

ctttaaaagacggaacttactatcctcaacctgtacgaagaatgtatattgcaaaaaaga2220

attctaaaaagatgagacctttaggaattccaactttcacagataaattgatccaagaag2280

ctgtgagaataattcttgaatctatctatgaaccggtattcgaagatgtgtctcacggtt2340

ttagacctcaacgaagctgtcacacagctttgaaaacaatcaaaagagagtttggcggcg2400

caagatggtttgtggagggagatataaaaggctgcttcgataatatagaccacgttacac2460

tcattggactcatcaatcttaaaatcaaagatatgaaaatgagccaattgatttataaat2520

ttctaaaagcaggttatctggaaaactggcagtatcacaaaacttacagcggaacacctc2580

aaggtggaattctatctcctcttttggccaacatctatcttcatgaattggataagtttg2640

ttttacaactcaaaatgaagtttgaccgagaaagtccagaaagaataacacctgaatatc2700

gggagctccacaatgagataaaaagaatttctcaccgtctcaagaagttggagggtgaag2760

aaaaagctaaagttcttttagaatatcaagaaaaacgtaaaagattacccacactcccct2820

gtacctcacagacaaataaagtattgaaatacgtccggtatgcggacgacttcattatct2880

ctgttaaaggaagcaaagaggactgtcaatggataaaagaacaattaaaactttttattc2940

ataacaagctaaaaatggaattgagtgaagaaaaaacactcatcacacatagcagtcaac3000

ccgctcgttttctgggatatgatatacgagtaaggagatctggaacgataaaacgatctg3060

gtaaagtcaaaaagagaacactcaatgggagtgtagaactccttattcctcttcaagaca3120

aaattcgtcaatttatttttgacaagaaaatagctatccaaaagaaagatagctcatggt3180

ttccagttcacaggaaatatcttattcgttcaacagacttagaaatcatcacaatttata3240

attctgaactccgcgggatttgtaattactacggtctagcaagtaattttaaccagctca3300

attattttgcttatcttatggaatacagctgtctaaaaacgatagcctccaaacataagg3360

gaacactttcaaaaaccatttccatgtttaaagatggaagtggttcgtgggggatcccgt3420

atgagataaagcaaggtaagcagcgccgttattttgcaaattttagtgaatgtaaatccc3480

cttatcaatttacggatgagataagtcaagctcctgtattgtatggctatgcccggaata3540

ctcttgaaaacaggttaaaagctaaatgttgtgaattatgtgggacgtctgatgaaaata3600

cttcctatgaaattcaccatgtcaataaggtcaaaaatcttaaaggcaaagaaaaatggg3660

aaatggcaatgatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcattgtcatcgtc3720

acgtgattcataaacacaagtgaatgtcgagcacccgttctcggagcactgtccgaccgc3780

tttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatc3840

atggcgaccacacccgtcctgtggatcgccaagccgccgatggtagtgtggggtctcccc3900

atgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgg3960

gcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccg4020

ggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgcca4080

taaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgttt4140

ctacaaactcttcctgtcgtcatatctacaagcatatggtgcactctcagtacaatctgc4200

tctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctga4260

cgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgc4320

atgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgata4380

cgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcact4440

tttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatg4500

tatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagt4560

atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct4620

gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca4680

cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc4740

gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc4800

cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg4860

gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta4920

tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc4980

ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt5040

gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg5100

cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct5160

tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc5220

tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct5280

cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac5340

acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc5400

tcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgat5460

ttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatg5520

accaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatc5580

aaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaa5640

ccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaag5700

gtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagtta5760

ggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgtta5820

ccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatag5880

ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttg5940

gagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacg6000

cttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagag6060

cgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgc6120

cacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaa6180

aacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatg6240

ttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagct6300

gataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaa6360

gagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgg6420

cacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttag6480

ctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtgga6540

attgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctt6600

tggctaacacacacgccattccaaccaatagttttctcggcataaagccatgctctgacg6660

cttaaatgcactaatgccttaaaaaaacattaaagtctaacacactagacttatttactt6720

cgtaattaagtcgttaaaccgtgtgctctacgaccaaaagtataaaacctttaagaactt6780

tcttttttcttgtaaaaaaagaaactagataaatctctcatatcttttattcaataatcg6840

catcagattgcagtataaatttaacgatcactcatcatgttcatatttatcagagctcgt6900

gctataattatactaattttataaggaggaaaaaataaagagggttataatgaacgagaa6960

aaatataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataatatagataaaataatgac7020

aaatataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggctcaggaaaagggcattt7080

tacccttgaattagtacagaggtgtaatttcgtaactgccattgaaatagaccataaatt7140

atgcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttccaagttttaaacaagga7200

tatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatatttggtaatatacctta7260

taacataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagtatagctgatgagattta7320

tttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcatt7380

atttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttccaagagaatattttca7440

tcctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaaatagaaaaaaatcaagaatatc7500

acacaaagataaacagaagtataattatttcgttatgaaatgggttaacaaagaatacaa7560

gaaaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgattt7620

aaacaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagctataaattatttaataa7680

gtaagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttcgtgtacctattttttg7740

tgaatcgataatttacagaaaagaaaattatagaatttagtatgattaattatactcatt7800

tatgaatgtttaattgaatacaaaaaaaaatacttgttatgtattcaattacgggttaaa7860

atatagacaagttgaaaaatttaataaaaaaataagtcctcagctcttatatattaagct7920

accaacttagtatataagccaaaacttaaatgtgctaccaacacatcaagccgttagaga7980

actctatctatagcaatatttcaaatgtaccgacatacaagagaaacattaactatatat8040

attcaatttatgagattatcttaacagatataaatgtaaattgcaataagtaagatttag8100

aagtttatagcctttgtgtattggaagcagtacgcaaaggcttttttatttgataaaaat8160

tagaagtatatttattttttcataattaatttatgaaaatgaaagggggtgagcaaagtg8220

acagaggaaagcagtatcttatcaaataacaaggtattagcaatatcattattgacttta8280

gcagtaaacattatgacttttatagtgcttgtagctaagtagtacgaaagggggagcttt8340

aaaaagctccttggaatacatagaattcataaattaatttatgaaaagaagggcgtatat8400

gaaaacttgtaaaaattgcaaagagtttattaaagatactgaaatatgcaaaatacattc8460

gttgatgattcatgataaaacagtagcaacctattgcagtaaatacaatgagtcaagatg8520

tttacataaagggaaagtccaatgtattaattgttcaaagatgaaccgatatggatggtg8580

tgccataaaaatgagatgttt8601