本发明涉及生物领域，具体涉及一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法。
背景技术：
大鲵，又名娃娃鱼，属两栖纲有尾目，素有软黄金之称，含有丰富的蛋白质和微量元素，以及少量的脂肪，其中8种氨基酸为人体的必需氨基酸，不但营养价值高，而且还能预防多种疾病，改善人体的免疫力和细胞代谢水平,同时，大鲵在食品和药用方面都具有较高的运用价值，比如：美容养颜、预防心血管疾病、延缓衰老、抗癌等作用，是一种很好的保健食品,近年来随着人们对大鲵的认识，国内外对大鲵的研究也越来越多，为了能更好的利用大鲵的营养价值和药用价值，需要将其作为食用性水产品来养殖，但是，大鲵是我国特有的珍稀野生动物，被列为国家二级保护动物不得食用、不得捕杀，因此，大鲵的人工养殖技术得到了广泛的研究，随着科学技术的发展，大鲵的人工养殖技术也越来越成熟，成功培育了大鲵子二代食用性水产品，也有相关的数据显示大鲵肌肉中的一般营养成分的比重，其中人工养殖大鲵子二代的脂肪、蛋白质和灰分的比重分别为：9.63％、94.50％和3.62％，而野生大鲵的脂肪、蛋白质和灰分的比重分别为：14.25％、79.50％和4.18％，通过国内外对大鲵肌肉营养成分的研究表明，人工养殖大鲵子二代营养价值和野生大鲵的营养价值十分接近，实现了大鲵的人工养殖，随着大鲵子二代养殖技术的不断成熟，使大鲵子二代的量不断增加。
胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白含有丰富的氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸总量的15.78％，蛋白质营养价值高，胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增加，因此胶原蛋白的提取工艺越来越受到关注；大鲵中富含胶原蛋白，目前从大鲵中提取胶原蛋白的方法也已取得一定的成效，如申请号201410630235.9《一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法》公开了一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法，目的在于解决目前大鲵在生产过程中，所蜕的皮白白浪费掉，造成资源严重浪费的问题。该方法包括如下步骤：预处理、粗提取、脱腥、提取、胶原蛋白提纯。本发明通过对人工养殖大鲵的蜕皮进行处理、酶解、过滤、浓缩、喷雾干燥等步骤，最后得到胶原蛋白，其分子量在3000道尔顿以下但是在胶原蛋白备受关注的当下，提取方法也是多种多样，由于提取方法的多样性以及不合理性，导致后期对胶原蛋白提纯率与纯度较低，严重影响其应用价值，也浪费了资源，因此如何在传统大鲵提取方法的基础上进行改进来达到提高胶原蛋白的提取率和纯度就显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明为解决上述技术问题，提供了一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)杀菌处理：将大鲵原料经过预处理后，加入大鲵原料质量的0.8～1.2倍量的杀菌液，调节磁力搅拌器的温度为36～38℃，搅拌40～50min，过滤，用去离子水洗涤滤渣3～5次；
(2)将步骤(1)处理后的大鲵原料与去离子水按1：1.3～1.8的质量比混合，在60～80℃下搅拌30～40min，过滤得浆液和浆料，再按以下步骤进行提取：
a、酸浸：将浆料和浓度为0.45～0.55mol/l的酸溶液按1：0.8～1.2的质量比混合，搅拌40～50min，离心得酸溶性胶原蛋白和滤渣；
b、水洗：用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为6.5～7即可；
c、碱浸：将水洗后的滤渣和浓度为0.04～0.06mol/l的碱溶液按1：0.8～1.2的质量比混合，搅拌1～2h，离心得碱溶性胶原蛋白和滤渣；
d、二次水洗：用去离子水将步骤c中的滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为7～7.5即可；
e、盐浸：将二次水洗后的滤渣和浓度为3.5～4.5％的盐溶液按1：0.8～1.2的质量比混合，搅拌1～2h，离心得盐溶性胶原蛋白和滤渣；
f、酶解：将盐浸后的滤渣和含量为50～60％的复合酶液按1：0.8～1.2的质量比混合，搅拌20～24h，离心得酶促溶性胶原蛋白和滤渣；
(3)纯化：将浆液、酸溶性胶原蛋白、碱溶性胶原蛋白、盐溶性胶原蛋白和酶促溶性胶原蛋白中分别加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，分别收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，分别得到胶原蛋白溶液，将得到的五份胶原蛋白溶液混合，用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品。
所述的大鲵原料，是由大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨按1：0.2～0.3：0.4～0.5的质量比混合。
所述的预处理，是将大鲵原料去除杂质后，烘干粉碎，与正己烷、固醇酶按1.8～2.2：0.3～0.5：0.1～0.2的质量比混合，加入去离子水，调和成含量为50～60％的溶液，加热至38～42℃，搅拌100～120min，过滤取滤渣，即可。
所述的杀菌液，是将蒲公英和艾草按等质量混合，加水熬煮30～40min，过滤，将滤液浓缩至一半体积，加入浓缩液质量的10～20％的乙醇，拌匀即可。
所述的酸浸，其反应温度为18～22℃，其中所述的酸溶液，是柠檬酸、苹果酸、盐酸、磷酸、甲酸、乙酸中的一种。
所述的碱浸，其反应温度为4～6℃，其中所述的碱溶液，是氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钠和碳酸钾中的一种。
所述的盐浸，其反应温度为15～20℃，其中所述的盐溶液，是盐酸-三羟甲基胺基甲烷、氯化钠、柠檬酸盐中的一种。
所述的酶解，其反应温度为33～35℃。
所述的复合酶，是将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按1.2～1.8：0.3～0.5：0.8～1.2的质量比混合制得。
所述的离心，频率为2200～2500r/min，离心时间为6～12min。
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明利用大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨混合作为原料提取胶原蛋白，充分利用大鲵资源，通过杀菌处理、酸浸、水洗、碱浸、二次水洗、盐浸、酶解、纯化的操作步骤，有效的提高了大鲵胶原蛋白的提取率和纯度，经测定，本发明的提取率高达75.2％，纯度高达97.8％，有效的满足了目前市场对胶原蛋白的量以及品质的追求，提高了胶原蛋白的市场应用价值。
其中，本发明首先从原料上进行优化，通过大鲵皮、肌肉、骨的科学混合，最大限度的提高了胶原蛋白的收率，为胶原蛋白的高提取率提供保障，通过对大鲵原料的进行酶和有机物的预处理，使得其中的油脂、多种矿物质和其他杂质得到有效的清除，为制备的胶原蛋白的高纯度提供了保障；由于采用的原料来源于动物体，难免会有一些病原菌以及病毒残留，本发明首次将中药的杀菌机理运用到胶原蛋白的提取中，实践证明，杀菌效果显著，且对胶原蛋白活性没有影响，有效的灭杀了病原菌，保证了胶原蛋白的安全性；分别通过对溶剂的浓度、反应时间、反应温度进行合理的选取，分别通过酸浸、碱浸、盐浸、酶解制得酸溶性胶原蛋白、碱溶性胶原蛋白、盐溶性胶原蛋白和酶促溶性胶原蛋白，最大限度的对大鲵中的胶原蛋白进行提取，为获得高收率的胶原蛋白提供基础。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)杀菌处理：将大鲵原料经过预处理后，加入大鲵原料质量的0.8倍量的杀菌液，调节磁力搅拌器的温度为36℃，搅拌40min，过滤，用去离子水洗涤滤渣3～5次；
所述的大鲵原料，是由大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨按1：0.2：0.4的质量比混合；
所述的预处理，是将大鲵原料去除杂质后，烘干粉碎，与正己烷、固醇酶按1.8：0.3：0.1的质量比混合，加入去离子水，调和成含量为50％的溶液，加热至38℃，搅拌100min，过滤取滤渣，即可；
所述的杀菌液，是将蒲公英和艾草按等质量混合，加水熬煮30min，过滤，将滤液浓缩至一半体积，加入浓缩液质量的10％的乙醇，拌匀即可；
(2)将步骤(1)处理后的大鲵原料与去离子水按1：1.3的质量比混合，在60℃下搅拌30min，过滤得浆液和浆料，再按以下步骤进行提取：
a、酸浸：将浆料和浓度为0.45mol/l的柠檬酸溶液按1：0.8的质量比混合，在18℃的温度下搅拌40min，离心得酸溶性胶原蛋白和滤渣；
b、水洗：用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为6.5～7即可；
c、碱浸：将水洗后的滤渣和浓度为0.04mol/l的氢氧化钠溶液按1：0.8的质量比混合，在4℃的温度下搅拌1h，离心得碱溶性胶原蛋白和滤渣；
d、二次水洗：用去离子水将步骤c中的滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为7～7.5即可；
e、盐浸：将二次水洗后的滤渣和浓度为3.5％的盐酸-三羟甲基胺基甲烷溶液按1：0.8的质量比混合，在15℃的温度下搅拌搅拌1h，离心得盐溶性胶原蛋白和滤渣；
f、酶解：将盐浸后的滤渣和含量为50％的复合酶液按1：0.8的质量比混合，在33℃的温度下搅拌20h，离心得酶促溶性胶原蛋白和滤渣；
所述的复合酶，是将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按1.2：0.3：0.8的质量比混合制得；
(3)纯化：将浆液、酸溶性胶原蛋白、碱溶性胶原蛋白、盐溶性胶原蛋白和酶促溶性胶原蛋白中分别加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，分别收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，分别得到胶原蛋白溶液，将得到的五份胶原蛋白溶液混合，用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品；
所述的离心，频率为2200r/min，离心时间为6min。
实施例2
一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)杀菌处理：将大鲵原料经过预处理后，加入大鲵原料质量的1.2倍量的杀菌液，调节磁力搅拌器的温度为38℃，搅拌50min，过滤，用去离子水洗涤滤渣3～5次；
所述的大鲵原料，是由大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨按1：0.3：0.5的质量比混合；
所述的预处理，是将大鲵原料去除杂质后，烘干粉碎，与正己烷、固醇酶按2.2：0.5：0.2的质量比混合，加入去离子水，调和成含量为60％的溶液，加热至42℃，搅拌120min，过滤取滤渣，即可；
所述的杀菌液，是将蒲公英和艾草按等质量混合，加水熬煮40min，过滤，将滤液浓缩至一半体积，加入浓缩液质量的20％的乙醇，拌匀即可；
(2)将步骤(1)处理后的大鲵原料与去离子水按1：1.8的质量比混合，在80℃下搅拌40min，过滤得浆液和浆料，再按以下步骤进行提取：
a、酸浸：将浆料和浓度为0.55mol/l的苹果酸溶液按1：1.2的质量比混合，在22℃的温度下搅拌50min，离心得酸溶性胶原蛋白和滤渣；
b、水洗：用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为6.5～7即可；
c、碱浸：将水洗后的滤渣和浓度为0.06mol/l的氢氧化钙溶液按1：1.2的质量比混合，在6℃的温度下搅拌2h，离心得碱溶性胶原蛋白和滤渣；
d、二次水洗：用去离子水将步骤c中的滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为7～7.5即可；
e、盐浸：将二次水洗后的滤渣和浓度为4.5％的氯化钠溶液按1：1.2的质量比混合，在20℃的温度下搅拌搅拌2h，离心得盐溶性胶原蛋白和滤渣；
f、酶解：将盐浸后的滤渣和含量为60％的复合酶液按1：1.2的质量比混合，在35℃的温度下搅拌24h，离心得酶促溶性胶原蛋白和滤渣；
所述的复合酶，是将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按1.8：0.5：1.2的质量比混合制得；
(3)纯化：将浆液、酸溶性胶原蛋白、碱溶性胶原蛋白、盐溶性胶原蛋白和酶促溶性胶原蛋白中分别加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，分别收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，分别得到胶原蛋白溶液，将得到的五份胶原蛋白溶液混合，用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品；
所述的离心，频率为2500r/min，离心时间为12min。
实施例3
一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)杀菌处理：将大鲵原料经过预处理后，加入大鲵原料质量的1倍量的杀菌液，调节磁力搅拌器的温度为37℃，搅拌45min，过滤，用去离子水洗涤滤渣3～5次；
所述的大鲵原料，是由大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨按1：0.25：0.45的质量比混合；
所述的预处理，是将大鲵原料去除杂质后，烘干粉碎，与正己烷、固醇酶按2：0.4：0.15的质量比混合，加入去离子水，调和成含量为55％的溶液，加热至40℃，搅拌110min，过滤取滤渣，即可；
所述的杀菌液，是将蒲公英和艾草按等质量混合，加水熬煮35min，过滤，将滤液浓缩至一半体积，加入浓缩液质量的15％的乙醇，拌匀即可；
(2)将步骤(1)处理后的大鲵原料与去离子水按1：1.5的质量比混合，在70℃下搅拌35min，过滤得浆液和浆料，再按以下步骤进行提取：
a、酸浸：将浆料和浓度为0.5mol/l的盐酸溶液按1：1的质量比混合，在20℃的温度下搅拌45min，离心得酸溶性胶原蛋白和滤渣；
b、水洗：用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为6.5～7即可；
c、碱浸：将水洗后的滤渣和浓度为0.05mol/l的碳酸钠溶液按1：1的质量比混合，在5℃的温度下搅拌1.5h，离心得碱溶性胶原蛋白和滤渣；
d、二次水洗：用去离子水将步骤c中的滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为7～7.5即可；
e、盐浸：将二次水洗后的滤渣和浓度为4％的柠檬酸盐溶液按1：1的质量比混合，在18℃的温度下搅拌搅拌1.5h，离心得盐溶性胶原蛋白和滤渣；
f、酶解：将盐浸后的滤渣和含量为55％的复合酶液按1：1的质量比混合，在34℃的温度下搅拌22h，离心得酶促溶性胶原蛋白和滤渣；
所述的复合酶，是将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按1.5：0.4：1的质量比混合制得；
(3)纯化：将浆液、酸溶性胶原蛋白、碱溶性胶原蛋白、盐溶性胶原蛋白和酶促溶性胶原蛋白中分别加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，分别收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，分别得到胶原蛋白溶液，将得到的五份胶原蛋白溶液混合，用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品；
所述的离心，频率为2300r/min，离心时间为8min。
实施例4
一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)杀菌处理：将大鲵原料经过预处理后，加入大鲵原料质量的0.8倍量的杀菌液，调节磁力搅拌器的温度为38℃，搅拌40min，过滤，用去离子水洗涤滤渣3～5次；
所述的大鲵原料，是由大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨按1：0.3：0.4的质量比混合；
所述的预处理，是将大鲵原料去除杂质后，烘干粉碎，与正己烷、固醇酶按2.2：0.3：0.2的质量比混合，加入去离子水，调和成含量为60％的溶液，加热至38℃，搅拌120min，过滤取滤渣，即可；
所述的杀菌液，是将蒲公英和艾草按等质量混合，加水熬煮30min，过滤，将滤液浓缩至一半体积，加入浓缩液质量的20％的乙醇，拌匀即可；
(2)将步骤(1)处理后的大鲵原料与去离子水按1：1.3的质量比混合，在80℃下搅拌30min，过滤得浆液和浆料，再按以下步骤进行提取：
a、酸浸：将浆料和浓度为0.45mol/l的磷酸溶液按1：0.8的质量比混合，在22℃的温度下搅拌40min，离心得酸溶性胶原蛋白和滤渣；
b、水洗：用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为6.5～7即可；
c、碱浸：将水洗后的滤渣和浓度为0.06mol/l的碳酸钾溶液按1：0.8的质量比混合，在6℃的温度下搅拌1h，离心得碱溶性胶原蛋白和滤渣；
d、二次水洗：用去离子水将步骤c中的滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为7～7.5即可；
e、盐浸：将二次水洗后的滤渣和浓度为4.5％的氯化钠溶液按1：1.2的质量比混合，在15℃的温度下搅拌搅拌2h，离心得盐溶性胶原蛋白和滤渣；
f、酶解：将盐浸后的滤渣和含量为60％的复合酶液按1：0.8的质量比混合，在35℃的温度下搅拌20h，离心得酶促溶性胶原蛋白和滤渣；
所述的复合酶，是将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按1.8：0.3：0.8的质量比混合制得；
(3)纯化：将浆液、酸溶性胶原蛋白、碱溶性胶原蛋白、盐溶性胶原蛋白和酶促溶性胶原蛋白中分别加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，分别收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，分别得到胶原蛋白溶液，将得到的五份胶原蛋白溶液混合，用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品；
所述的离心，频率为2200r/min，离心时间为12min。
实施例5
一种从大鲵中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)杀菌处理：将大鲵原料经过预处理后，加入大鲵原料质量的0.8倍量的杀菌液，调节磁力搅拌器的温度为36℃，搅拌50min，过滤，用去离子水洗涤滤渣3～5次；
所述的大鲵原料，是由大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨按1：0.3：0.4的质量比混合；
所述的预处理，是将大鲵原料去除杂质后，烘干粉碎，与正己烷、固醇酶按1.8：0.5：0.2的质量比混合，加入去离子水，调和成含量为50％的溶液，加热至38℃，搅拌120min，过滤取滤渣，即可；
所述的杀菌液，是将蒲公英和艾草按等质量混合，加水熬煮30min，过滤，将滤液浓缩至一半体积，加入浓缩液质量的10％的乙醇，拌匀即可；
(2)将步骤(1)处理后的大鲵原料与去离子水按1：1.8的质量比混合，在80℃下搅拌30min，过滤得浆液和浆料，再按以下步骤进行提取：
a、酸浸：将浆料和浓度为0.45mol/l的柠檬酸溶液按1：0.8的质量比混合，在22℃的温度下搅拌50min，离心得酸溶性胶原蛋白和滤渣；
b、水洗：用去离子水将滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为6.5～7即可；
c、碱浸：将水洗后的滤渣和浓度为0.04mol/l的氢氧化钠溶液按1：0.8的质量比混合，在6℃的温度下搅拌2h，离心得碱溶性胶原蛋白和滤渣；
d、二次水洗：用去离子水将步骤c中的滤渣进行清洗，水洗至滤渣水溶液ph值为7～7.5即可；
e、盐浸：将二次水洗后的滤渣和浓度为4.5％的氯化钠溶液按1：1.2的质量比混合，在15℃的温度下搅拌搅拌1h，离心得盐溶性胶原蛋白和滤渣；
f、酶解：将盐浸后的滤渣和含量为60％的复合酶液按1：0.8的质量比混合，在33℃的温度下搅拌24h，离心得酶促溶性胶原蛋白和滤渣；
所述的复合酶，是将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶按1.8：0.3：0.8的质量比混合制得；
(3)纯化：将浆液、酸溶性胶原蛋白、碱溶性胶原蛋白、盐溶性胶原蛋白和酶促溶性胶原蛋白中分别加入氯盐进行盐析，盐析后进行离心，分别收集沉淀，将沉淀用乙酸溶解，分别得到胶原蛋白溶液，将得到的五份胶原蛋白溶液混合，用纯化水透析后，得到胶原蛋白提取液，冷冻、干燥，即得成品；
所述的离心，频率为2200r/min，离心时间为6min。
实施例6
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例采用大鲵原料，是由大鲵皮、大鲵肌肉、大鲵骨中的任意一种。
实施例7
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例没有将大鲵原料经过预处理。
实施例8
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，只经过酸浸处理。
实施例9
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，只经过碱浸处理。
实施例10
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，只经过盐浸处理。
实施例11
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，只经过酶解处理。
实施例12
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过酸浸和碱浸处理。
实施例13
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过酸浸和盐浸处理。
实施例14
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过酸浸和酶解处理。
实施例15
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过碱浸和盐浸处理。
实施例16
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过碱浸和酶解处理。
实施例17
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过盐浸和酶解处理。
实施例18
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过酸浸、碱浸和盐浸处理。
实施例19
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过酸浸、碱浸和酶解处理。
实施例20
操作方法参照实施例1的方法，不同之处在于，本实施例在提取步骤时，本实施例在提取步骤时，只经过碱浸、盐浸和酶解处理。
对本发明的实施例1～20的胶原蛋白的提取率和纯度进行统计，以申请号201410630235.9《一种利用大鲵的蜕皮提取胶原蛋白的方法》公开的提取方法作为对照，结果如表1所示：
表1