一种天然利那洛肽的结晶方法与流程

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一种天然利那洛肽的结晶方法与流程

本发明涉及一种天然利那洛肽的结晶方法,属于药物制备技术领域。



背景技术:

利那洛肽(linaclotide)由14个氨基酸组成,其氨基酸序列为cceyccnpactgcy,其中的第1位与第6位半胱氨酸、第2位与第10位半胱氨酸和第5位与第13位半胱氨酸分别形成二硫键,三对二硫键发挥着稳定其空间构型的作用。利那洛肽是鸟苷酸环化酶c(以下简称gc-c)的激动剂,可以通过结合肠道上皮的gc-c受体进而促进肠道内液体分泌的增多以及肠道蠕动的增加,也有助于降低痛觉神经的灵敏度。2012年美国fda批准了利那洛肽(商品名:linzess;公司:ironwood)用于治疗成人的慢性特发性便秘(cic)及便秘型肠易激综合征(ibs-c)。

以疾病相关的蛋白/多肽三维空间结构为基础进行药物设计与筛选的方法,具有目标明确,开发周期短的优点。因此,获得蛋白/多肽晶体具有重要意义。

专利(wo2010/059733a;wo2014/118180a)报道了在酸性溶液或有机溶剂的条件下,获得利那洛肽晶体的方法。该方法结晶条件较为苛刻,难于操作。因此本领域中仍然需要简单高效的方法来获得利那洛肽的晶体。



技术实现要素:

本发明的目的是提出一种天然利那洛肽的结晶方法,运用多肽固相合成方法,获得镜像利那洛肽,并以镜像利那洛肽作为辅助手段,促进天然利那洛肽的结晶。

本发明提出的天然利那洛肽的结晶方法,包括以下步骤:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)在树脂中加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量,将4倍量的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯和8倍量的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸;

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液,室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)将上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中,使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取相同质量的天然利那洛肽和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为5-40毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入结晶溶液,利用蛋白结晶筛选方法,在温度为4℃-18℃,结晶时间为1-14天,得到天然利那洛肽的晶体。

本发明提出的天然利那洛肽的结晶方法,其特点和优点是:

本发明方法以树脂作为固相载体,依照固相多肽合成的方法依次缩合具有n-芴甲氧羰基(fmoc)保护的d型氨基酸;待氨基酸缩合结束后,使用切割液进行侧链保护基团的脱除以及多肽与树脂的分离,通过乙醚沉淀切割液得到镜像利那洛肽的粗肽,再通过高效液相色谱分离、冻干,得到纯化后的还原态利那洛肽;最后,通过复性折叠实现二硫键的正确配对,即可得到具有正确空间构型的镜像利那洛肽;添加等浓度的镜像利那洛肽至天然利那洛肽的中性缓冲液中,充分混匀后,通过运用蛋白结晶筛选方法,采用不同的结晶溶液、特定温度及时间,实现镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽的结晶。本发明方法通过利用镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽结晶,具有条件温和,易于出晶的优点。

附图说明

图1是还原态镜像利那洛肽的高效液相色谱图。

图2是镜像利那洛肽的高效液相色谱图。

图3是还原态镜像利那洛肽的质谱图。

图4是镜像利那洛肽的质谱图。

图5是天然和镜像利那洛肽的晶体结构图。

具体实施方式

本发明提出的天然利那洛肽的结晶方法,包括以下步骤:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)在树脂中加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量,将4倍量的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸;

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液,室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)将上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中,使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取相同质量的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为5-40毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入结晶溶液,利用蛋白结晶筛选方法,在温度为4℃-18℃,结晶时间为1-14天,得到天然利那洛肽的晶体。

上述天然利那洛肽的结晶方法中,所述的树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂(2-cl-trit-clresin)、n-芴甲氧羰基氨基树脂(rinkamide-amresin)或王树脂(wangresin)。

上述天然利那洛肽的结晶方法中,所述的切割液为三氟乙酸、乙二硫醇、苯酚、茴香硫醚、水和三异丙基硅烷的混合物,体积百分比为:三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=(70-100%):(0-10%):(0-10%):(0-10%):(0-10%):(0-10%)。优选为:三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水=80%:5%:5%:5%:5%。

上述天然利那洛肽的结晶方法中,所述的复性缓冲液为还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸和胱氨酸中的一种或多种以任何比例相混合的混合液。优选为:复性缓冲液由摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷、摩尔浓度为100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和摩尔浓度为10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5的混合液。

上述天然利那洛肽的结晶方法中,所述的相同质量的天然利那洛肽和镜像利那洛肽溶于ph为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升。

上述天然利那洛肽的结晶方法中,所述的结晶溶液为结晶筛选试剂盒。

上述天然利那洛肽的结晶方法中,所述的结晶筛选方法为座滴法或悬滴法。

为了便于理解本发明,下面结合具体实施范例对本发明实施过程作进一步说明,这些描述只是为进一步说明本发明的特征及优点,而不是对发明权利要求的限制。

实施例1:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=80%:5%:5%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽。如图1所示为还原态镜像利那洛肽的高效液相色谱图,表明合成的还原态镜像利那洛肽具有均一的性质;如图3所示为还原态镜像利那洛肽的质谱图,表明合成的还原态镜像利那洛肽具有正确的分子量。;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽。如图2所示为镜像利那洛肽的高效液相色谱图,表明合成的镜像利那洛肽具有均一的性质;如图4所示为镜像利那洛肽的质谱图,表明合成的镜像利那洛肽具有正确的分子量;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。图5所示为天然和镜像利那洛肽的晶体结构图,表明镜像利那洛肽确实起到了辅助天然利那洛肽结晶的作用。

实施例2:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,0.1倍量(0.01毫摩尔,1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=80%:5%:5%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液中,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例3:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=80%:5%:5%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、8毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和1毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例4:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,0.1倍量(0.01毫摩尔,1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=80%:5%:5%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、8毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和1毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例5:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,0.1倍量(0.01毫摩尔,1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=85%:0%:5%:0%:5%:5%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例6:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=85%:0%:5%:0%:5%:5%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例7:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=85%:5%:0%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例8:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,0.1倍量(0.01毫摩尔,1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=85%:5%:0%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例9:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=80%:5%:5%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各10毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为10毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

实施例10:

(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:

(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内,加入n,n-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:n,n-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔),将4倍量(0.4毫摩尔,183.8毫克)的n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺,0.1倍量(0.01毫摩尔,1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;

(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔,234.2毫克)的n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸溶于5毫升的n,n-二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量(0.36毫摩尔,136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)和8倍量(0.8毫摩尔,132微升)的n,n-二异丙基乙胺(diea),充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行n-芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到c端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1-3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:n-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔,118.9毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-苏氨酸(0.4毫摩尔,158.9毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰酰基-d-丙氨酸(0.4毫摩尔,124.5毫克)、n-芴甲氧羰基-d-脯氨酸(0.4毫摩尔,134.9毫克)、n-芴甲氧羰基-n'-三苯甲基-d-天冬酰胺(0.4毫摩尔,238.6毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)、n-芴甲氧羰基-o-叔丁基-d-酪氨酸(0.4毫摩尔,183.8毫克)、n-芴甲氧羰基-d-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔,170.1毫克)、n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克)和n-芴甲氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸(0.4毫摩尔,234.2毫克);

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷=80%:5%:5%:5%:5%:0%),室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;

(1-6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;

(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的ph值为7.5),使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调ph值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;

(2)称取各10毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于ph值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为10毫克/毫升;

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入hampton结晶溶液,利用座滴法,在温度为16℃,结晶时间为5天,得到天然利那洛肽的晶体。

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,也不因各实施例之间的前后次序对本发明造成任何限制,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭示的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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