玉屏风药渣发酵产物的用途的制作方法

本发明涉及药渣发酵技术领域，特别是涉及玉屏风药渣发酵产物的用途。

背景技术：

随着中医药事业的不断发展，中药制剂的需求量也越来越大，中药渣的排放量也随之增加。调查统计显示，目前我国约有1500家中医药企业，中药渣每年排放量已达1200万吨。中药渣主要来源于中药加工与炮制，中成药以及其他中药相关产品的加工过程，其中中成药所产生的药渣最多，约占药渣总量的70％。在过去的中药产业发展过程中剩余药渣大多数通过堆放，填埋焚烧等方式进行废弃处理，然而中药渣一般含水量较高，极易腐败，对周围的环境(尤其是水质或土壤)会造成严重污染，同时企业也会投入一定资金作为排污处理费，因此药渣排放和处理问题成为目前困扰广大中药制药企业的难题之一。

为了避免中药渣直接废弃造成的环境污染问题，同时有效利用中药渣资源，目前对中药渣直接利用主要有以下几种方式：(1)中药渣作为有机肥料用于果蔬种植；(2)利用一些中药渣的吸附能力进行污水处理和净化；(3)中药渣制成动物饲料应用于养殖中。其中将中药渣直接作为饲料添加剂使用也是目前较为广泛的利用方式。

由于中药渣被提取后虽然存在一定的营养价值和药用成分，但是含量不是很高，却富含粗纤维，目前有研究者也提出直接将药渣作为饲料添加剂可能会不利于动物吸收其有效成分，从而造成过大的添加量来达到药效目的，这将导致饲料配比不当，药渣质量方面也无法得到控制。

中药提取后会剩余很多药渣，而药渣处理不当会造成环境污染。在中药渣成分分析利用研究中表明，中药渣尚存在部分活性物质及营养物质。玉屏风药渣是中成药玉屏风口服液、颗粒、胶囊等提取后剩余的药渣，玉屏风口服液是1990版药典收载的新剂型，由于疗效好因此年产量大，然而产生的药渣尚未被有效利用。药渣粗纤维含量高，直接使用会使植物细胞壁阻碍机体对活性成分的吸收和利用。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种玉屏风药渣发酵产物的用途。

本发明的技术方案为：

玉屏风药渣发酵产物在制备促生长添加剂的应用，其特征在于：所述的玉屏风药渣发酵产物的制备方法为，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵。

所述应用是指增重，降低料肉比。

所述的菌种为黑曲霉。

所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱28—32℃培养2-4d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱28—32℃，120—170r/min振荡培养20-26h，即可用于接种发酵。

优选的,所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵。

优选的,所述的固定培养基为马铃薯固体培养基；所述的无菌水为无菌超纯水。

将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×10⁷个/ml，转接于100ml液体培养基中。

菌液接种到药渣中的时间60—85h，接种量8—18％，含水量30—50％。

优选的,菌液接种到药渣中的时间68—75h，接种量10—15％，含水量35—45％。

优选的,菌液接种到药渣中的时间72h，接种量12％，含水量40％。

本发明的有益效果为：

1、本发明利用固态发酵技术，采用黑曲霉发酵玉屏风口服液药渣实现降解粗纤维的目的，对药渣进行生物转化，技术简单，节约能源，保护环境。

2、本发明以纤维素酶活为指标，采用单因素和正交试验研究黑曲霉发酵玉屏风口服液药渣的最佳发酵条件，结果显示最佳发酵条件为时间72h，接种量12％，含水量40％，纤维素酶活为3.94iu/g。

3、本发明采用高效液相色谱分析水提和醇提方式提取于最佳发酵条件下发酵玉屏风药渣前后成分的变化。结果显示未发酵药渣水提物和醇提物几乎没有含量高的成分。发酵药渣水提物出现了比未发酵含量高的相似保留时间峰，差异倍数约为5倍，但整体峰高低于口服液。发酵醇提物水溶后出现了两个含量较高的峰，峰面积约为未发酵相似保留时间两处峰的20倍和50倍。

4本发明考察发酵玉屏风药渣醇提物对小鼠的促生长作用。结果显示发酵玉屏风药渣醇提物与未发酵和空白组相比可显著提高小鼠增重，且料肉比低于未发酵和空白组，差值在1～2之间；发酵药渣醇提物对小鼠脏器没有毒性作用。

5本发明采用高效液相色谱考察发酵药渣醇提物两个特征性成分色谱方法学可靠性，成分可能来源因素以及不同批次发酵物的稳定性。色谱方法学考察结果显示成分1和成分2线性关系，重复性，稳定性均良好；由成分来源的可能因素(黑曲霉菌液，纤维素酶以及黑曲霉常用发酵基质麦麸发酵产物)指纹图谱得知，通过保留时间对比发现三个因素均没有这两个成分；对不同批次的发酵药渣醇提物进行两个成分比较，发现两个成分保留时间基本一致，但是含量有所差异。

结论：黑曲霉固态发酵玉屏风口服液药渣醇提物与未发酵相比出现了两个含量较高的成分；发酵药渣醇提物可提高小鼠增重，降低料肉比，说明发酵药渣醇提物对小鼠有一定的促生长的作用。

附图说明：

图1：玉屏风口服液药渣固体发酵工艺路线；

图2：葡萄糖标准曲线；

图3：时间对产纤维素酶活的影响；

图4：接种量对产纤维素酶活的影响；

图5：初始含水量对产纤维素酶活的影响；

图6：为正交试验酶活变化趋势图；

图7：yolr、未发酵yolrs和发酵yolrs水提物的hplc色谱图(左为3d图,右为2d图)a.yolr；b.未发酵yolrs水提物；c.发酵yolrs水提物；

图8：yolr、未发酵yolrs和发酵yolrs水提物保留时间相近色谱峰的峰面积比较图；

图9：水、未发酵yolrs和发酵yolrs醇提物的hplc色谱图(左为2d图，右为3d图)a.水；b.未发酵yolrs醇提物；c.发酵yolrs醇提物；

图10:未发酵yolrs和yolrs醇提物保留时间相近峰的峰面积比较；

图11：发酵yolrs醇提物对小鼠增重影响*p<0.05vs空白组,#p<0.05vs未发酵组；

图12：发酵yolrs对小鼠脏器指数影响。

具体实施方式

以下实施例和实验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在固体培养基上，于恒温培养箱28—32℃培养2-4d，然后将活化后的菌种用无菌水洗脱，制成孢子悬液，转接于液体培养基中，于恒温震荡培养箱28—32℃，120—170r/min振荡培养20-26h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间60—85h，接种量8—18％，含水量30—50％；

所述的玉屏风药渣发酵产物用于制备促生长添加剂，具体是指增重，降低料肉比。

实施例2

一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×10⁷个/ml，转接于100ml液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间60—85h，接种量8—18％，含水量30—50％；

固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,pda)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；

马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用；

所述的玉屏风药渣发酵产物用于制备促生长添加剂，具体是指增重，降低料肉比。

实施例3

一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×10⁷个/ml，转接于100ml液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间68—75h，接种量10—15％，含水量35—45％；

固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,pda)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；

马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用；

所述的玉屏风药渣发酵产物用于制备促生长添加剂，具体是指增重，降低料肉比。

实施例4

一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×10⁷个/ml，转接于100ml液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间72h，接种量12％，含水量40％；

固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,pda)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；

马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用；

所述的玉屏风药渣发酵产物用于制备促生长添加剂，具体是指增重，降低料肉比。

实施例5

一种玉屏风药渣发酵的工艺方法，先对菌种进行活化和培养，然后将菌液接种到药渣中，进行发酵；所述的菌种为黑曲霉；所述的发酵为固态发酵；所述的菌种活化和培养为将菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的菌种用无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×10⁷个/ml，转接于100ml液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养27h，即可用于接种发酵；菌液接种到药渣中的时间72h，接种量12％，含水量40％；

固体培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,pda)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用；

马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用；

所述的玉屏风药渣发酵产物用于制备促生长添加剂，具体是指增重，降低料肉比。

实验例1玉屏风口服液药渣发酵单因素的研究

1菌种及材料

1.1菌种

黑曲霉(atcc16404)购于上海复祥生物有限公司。

1.2材料

玉屏风口服液药渣(yupingfengoralliquidresidues，yolrs)：保定冀中药业有限公司提供。

1.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,pda)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用。

马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用。

1.3化学试剂

羧甲基纤维素钠分析纯国药集团化学试剂有限公司

(cmc-na)

1.4仪器设备

多功能酶标仪biotek，型号synergy4

超净工作台哈尔滨东联电子技术开发有限公司，型号：

dl-cf-ind

tmqr-3850

2试验方法

2.1菌种活化和培养

将黑曲霉标准菌种接种在马铃薯固体培养基上，于恒温培养箱30℃培养3d，然后将活化后的黑曲霉用适量无菌超纯水洗脱，制成孢子悬液，浓度调为1×10⁷个/ml，转接于100ml液体培养基中，于恒温震荡培养箱30℃，150r/min振荡培养24h，即可用于接种发酵。

2.2玉屏风口服液药渣固体发酵工艺路线，见图1

2.2.1时间对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响的研究

将菌液按照药渣发酵工艺的流程接种到10g药渣中，接种量为10％，含水量为50％，置于电热恒温振荡培养箱中30℃，150r/min分别在24h、48h、72h、96h、120h、144h条件下进行发酵，按照设定条件取药渣测定纤维素酶活，研究时间对药渣发酵产纤维素酶活的影响。

2.2.2接种量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响的研究

将菌液按照药渣发酵工艺的流程接种到10g药渣中，发酵时间为2.2.1筛选出的最佳时间，含水量为50％，分别在接种量6％、8％、10％、12％、14％、16％条件下进行发酵，按照设定条件取药渣测定纤维素酶活，研究接种量对药渣发酵产纤维素酶活的影响。

2.2.3含水量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响的研究

将菌液按照药渣发酵工艺的流程接种到10g药渣中，发酵时间为2.2.1筛选出的最佳时间，接种量为2.2.3.2筛选的最佳接种量，分别在含水量30％、40％、50％、60％、70％、80％条件下进行发酵，按照设定条件取药渣测定纤维素酶活，研究含水量对药渣发酵产纤维素酶活的影响。

2.2.4发酵玉屏风口服液药渣最佳发酵条件的确定

根据单因素试验的结果，选取时间、接种量和含水量三个因素作为试验因子，每个因素三个水平作正交发酵试验，通过产纤维素酶活来确定药渣接种发酵的最佳工艺参数。

2.2.5粗酶液的制取

按上述设置的试验条件发酵结束后，取1g发酵物，溶于10ml醋酸缓冲溶液，置于摇床中，50℃，150r/min，2h提取，6000r/min离心10min，取上清液作为粗酶液备用。

2.2.6纤维素酶活检测方法

2.2.6.1溶液配制

(1)ph5.0醋酸缓冲溶液配制：50gnach3cooh.3h2o溶于适量水，6molch3cooh34ml，定容至500ml。

(2)葡萄糖标准溶液(10mg/ml):称取105℃烘干至恒重无水葡萄糖约200mg，加柠檬酸盐缓冲溶液溶解，定容至20ml

(3)柠檬酸盐缓冲溶液配置：称取柠檬酸1.05g，加入氢氧化钠0.5g，再加80ml水溶解，用柠檬酸溶液(0.1mol/l)调节ph至5.5，再用水定容至100ml。

(4)柠檬酸溶液配置：称取柠檬酸(c6h8o7·h2o)2.1g，加水溶解定容至100ml。

(5)naoh溶液(200g/l)配制：10g，50ml水溶解。

(6)dns试剂配置：称3，5-二硝基水杨酸1.575g，加水250ml，搅拌溶解，水浴至45℃，然后逐步加入naoh(200g/l)50ml，不断搅拌，直至完全溶解，在逐步加入酒石酸钠钾45.5g，苯酚1.25g，亚硫酸钠1.25g，搅拌至溶解，冷却至室温后，定容至500ml，过滤，取滤液储存于棕色瓶中，避光保存，室温下存放7d，可以使用，有效期为6个月。

(7)0.5％的羧甲基纤维素钠溶液：0.5g，100ml醋酸缓冲溶液定容。

2.2.6.2葡萄糖标准曲线的绘制

称取105℃烘干至恒重无水葡萄糖约100mg，加柠檬酸盐缓冲溶液溶解，定容至10ml，利用柠檬酸盐缓冲液再稀释至1mg/ml。取1mg/ml葡萄糖溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，分别加柠檬酸缓冲溶液定容至2ml。取配制的不同浓度的葡萄糖溶液各1ml于试管中，分别加2ml水，2mldns试剂，沸水浴5min。冷却至室温，用水定容至10ml，在540nm波长下比色测定od值，绘制标准曲线，如图2。

2.2.6.3纤维素酶活性的测定

取粗酶液1ml，加0.5％的羧甲基纤维素钠溶液(ph＝5的醋酸缓冲液配置)3ml，于50℃水浴30min，冷却加2mldns，再沸水浴5min，冷却至室温，加水定容至25ml，在540nm波长下测od值。

公式：

c＝根据吸光度从标准曲线查得的葡萄糖浓度(mg/ml)

25＝加入的lml粗酶液到总溶液25ml为稀释25倍(ml)

10＝总的粗酶液量(ml)

5.56＝lmg葡萄糖的摩尔质量为5.56(umol)

m＝发酵物质量(g)

30＝反应时间(min)

3统计分析

数据分析采用spss17.0软件进行，用方差齐性检验和单因素方差分析(onewayanova)进行多组间比较分析，以p<0.05表示差异有统计学意义。

4结果

4.1时间对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响

在温度为30℃条件下恒温发酵，接种量10％，含水量50％，时间范围从24h至144h，每隔24h设一检测点测定纤维素酶活，筛选出最佳发酵时间点。由图3可见，随发酵时间的增加，发酵后纤维素酶活先升高后降低，且发酵时间在72h时，药渣发酵后纤维素酶活最高。

4.2接种量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响

在温度为30℃条件下恒温发酵，时间72h，含水量50％，接种量在6％至16％范围内测定酶活，选取最佳接种量。由图4可知，随接种量的增加，发酵后纤维素酶活先升高后降低，且接种量在12％时，药渣发酵后纤维素酶活最高。

4.3含水量对玉屏风口服液药渣发酵产纤维素酶活影响

在温度为30℃条件下恒温发酵，时间72h，接种量12％，含水量在30％至80％范围内测定酶活，选取最佳含水量。由图5可知，随含水量的增加，发酵后纤维素酶活先升高后降低，且含水量在50％时，药渣发酵后纤维素酶活最高。

4.4正交优选玉屏风口服液药渣的最佳发酵条件

为了得到药渣发酵后纤维素酶活最高的的发酵条件，以单因素试验为基础，选取每个因素下纤维素酶活高的三个水平作为正交试验条件组合，研究各因素及其水平组合对纤维素酶活的影响。按照药渣发酵条件，以表1对应的因素水平进行发酵，表2正交结果表明，确定药渣发酵后纤维素酶活最优发酵条件为a2b3c1，即时间72h，接种量12％，含水量40％，此条件下酶活最高。经极差分析，ra＝1.22>rb＝0.74>rc＝0.35，影响因素大小顺序为c(发酵时间)>b(接菌量)>a(含水量)。且由最佳发酵条件处理的纤维素酶活为3.94iu/g。图6为正交试验酶活变化趋势图。

表1正交因素水平表

表2正交试验直观分析表

采用正交试验目的在于以较少的试验，找到试验因素的最佳水平，以得到试验所需量的目标产物。本试验为了得到药渣发酵后纤维素酶活最高的的发酵条件，以单因素试验为基础，选取每个因素下纤维素酶活高的三个水平作为正交试验条件组合，研究各因素及其水平组合对纤维素酶活的影响。确定药渣发酵后纤维素酶活最优发酵条件为a2b3c1，即时间72h，接种量12％，含水量40％，此条件下酶活最高，为3.94iu/g。经极差分析，影响因素大小顺序为c(发酵时间)>b(接菌量)>a(含水量)。

不同发酵时间、接种量、含水量影响黑曲霉作用药渣产纤维素酶活的高低，通过筛选最佳发酵条件，使黑曲霉作用药渣降解细胞壁纤维素能力达到最佳，从而有助于药渣成分的析出和改变。同时，优化发酵工艺也利于得到安全有效的产物，对发酵产物在质量方面的评价具有重要意义。

实验例2：hplc分析不同方式提取玉屏风口服液药渣发酵前后成分的变化

1材料

1.1菌种及材料

菌种:黑曲霉(atcc16404)购于上海复祥生物有限公司。

材料：玉屏风口服液(1g/ml)：保定冀中药业有限公司提供。

玉屏风口服液药渣：保定冀中药业有限公司提供。

1.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar,pda)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，琼脂15g，121℃高压蒸汽灭菌20min，分装倒板，4℃保存备用。

马铃薯液体培养基：上述培养基不加琼脂，灭菌冷却后4℃保存备用。

1.3化学试剂

色谱乙分析纯塞默飞世尔科技有限公司，cas67-56-1腈，

色谱甲醇分析纯塞默飞世尔科技有限公司，cas75-05-8

1.4仪器设备及其他器械用品

waters2695高效液相色谱系统美国沃特世公司

waters2998光电二极管阵列检美国沃特世公司

测器

empower工作站美国沃特世公司

2试验方法

2.1发酵玉屏风口服液药渣制备

采用图1所示玉屏风口服液药渣发酵工艺路线，按照实验例1所选用的最佳发酵条件进行发酵。

2.2提取物制备

水提物

将发酵与未发酵药渣按照常规煎煮的方式进行水提，然后将上清液旋转蒸发浓缩至1g/ml，4℃保存。

醇提物

将药渣发酵物与未发酵物，用10倍量的70％乙醇，70℃水浴提取2次，每次1h，过滤，合并提取液，将提取液旋转浓缩蒸发干燥成粉末，4℃保存。

3成分分析

3.1样品制备

(1)口服液、发酵药渣水提物、未发酵药渣水提物(1g/ml)：各吸取2ml样品，0.22um小滤器过滤到色谱瓶上样。

(2)发酵与未发酵药渣醇提物：称取4℃保存的70％醇提物干燥粉末各20mg，溶于2ml超纯水，0.22um小滤器过滤到色谱瓶上样。

3.2色谱条件：

检测器:紫外检测器；色谱柱:c18色谱柱；流动相：0.05％磷酸(a)～乙腈(b)梯度洗脱程序：0～10min，100％～95％a，10～20min，95～85％a，20～40min，85～75％a；流速：1ml/mim；检测波长：254nm，280nm：进样量:20μl；柱温:25℃。

4结果

4.1发酵药渣水提后成分分析

分别吸取口服液、发酵药渣水提物和未发酵药渣水提物各20μl，在3.2所示色谱条件下注入高效液相色谱仪测定。结果(图7-a)显示：在此色谱条件下(检测波长为254nm)，通过对比保留时间峰(超过2min)，口服液检测出了13个含量相对较高的峰(纵坐标大于0.2au)，未发酵药渣水提物(图7-b)显示，与口服液相比，几乎没有检测到含量高的物质峰，保留时间误差控制在0.1s以内的相近峰为26.400min，29.791min，31.169min，33.651min，但峰高均低于口服液。发酵药渣水提物(图7-c)显示，与口服液相比，保留时间误差控制在0.1s以内的相近峰为4.314min，7.953min，8.954min，31.165min，33.656min，其中8.954min峰高高于服液，其余峰高均小于口服液。与未发酵相比，保留时间接近峰为5.925min，13.585min，15.478min，31.165min，33.656min，峰高均高于未发酵。如图8为上述相应时间峰峰面积的柱状图比较。

4.2发酵药渣醇提物成分分析

分别吸取溶于超纯水的发酵与未发酵药渣醇提物粉末，在3.2所示色谱条件下注入高效液相色谱仪测定。结果显示：在此色谱条件下(检测波长为280nm)，空白溶剂水(图9-a)无干扰，未发酵醇提物(图9-b)水溶后几乎无含量高的物质峰，发酵药渣醇提物(图9-c)水溶后在13.082、13.895min出现两个较高的物质峰，对应未发酵中保留时间较一致的峰分别为13.079、13.936min出现的两个含量极低的物质峰，如柱状图(图10)显示未发酵与发酵出峰时间较为一致的峰面积比较，可以看出发酵醇提物水溶后13.082、13.895min两处的峰面积分别约为未发酵13.079、13.936min两处峰的20倍和50倍。

本试验发现发酵药渣醇提物再水溶后与未发酵相比，出现两个含量很高的成分。

实验例3：

1材料

药物：发酵与未发酵玉屏风口服液药渣醇提物由本实验例2制备。

疫苗：h9n2流感病毒灭活疫苗。

环磷酰胺(cyclophosphamide，cp)：购于sigma公司。

2试验动物

昆明小鼠，雌性，18～22g，40只，购于中国人民解放军军事科学院实验动物中心[spf级，动物合格证号；scxk(军)2012-0004]。

balb/c小鼠，雌性，18～22g，30只，购于中国人民解放军军事科学院实验动物中心[spf级，动物合格证号；scxk(军)2012-0004]。

昆明小鼠，雌性，13g左右，30只，购于中国人民解放军军事科学院实验动物中心[spf级，动物合格证号；scxk(军)2012-0004]。

3试验方法

3.1动物分组处理和给药

3.2发酵药渣醇提物对小鼠促生长的影响

将30只13g左右雌性昆明小鼠为随机分为3组，每组10只：a空白组、b未发酵组、c发酵组。适应性喂养3d，饲养于温室内，饲养温度20±1℃，湿度45-55％，光照12h，基础颗粒饲料饲喂，自由取食，饮水。药物以蒸馏水溶解，按照0.2g/kg剂量给药，每只各灌胃0.2ml。按照表3进行分组喂养连续灌胃相应药物13d，第14d进行相关指标检测。

表1试验分组及处理

3.2测定指标

增重与采食量测定

于试验第1d，第4d，第7d，第10d，第14d测定小鼠体重，并分别记录投料量和剩余料，计算增重及料肉比。

3.2.4脏器指数测定

于第14d停止给药，进行脏器指数的测定，心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺进行称重。检测长期给药过程中是否产生脏器毒性。

4统计分析

数据分析采用spss17.0软件进行，用方差齐性检验和单因素方差分析(onewayanova)进行多组间比较分析，以p<0.05表示差异有统计学意义。

5.发酵玉屏风药渣醇提物对小鼠促生长作用的影响

5.1发酵玉屏风药渣醇提物对小鼠增重影响

增重是促生长一个直观指标，由结果可知(图11)发酵组小鼠在试验结束后与试验前增重显著高于空白组和未发酵组(p<0.05)，未发酵组小鼠增重与空白组无差异(p>0.05)。这说明发酵玉屏风药渣醇提物可提高小鼠增重。

5.2发酵玉屏风药渣醇提物对不同阶段小鼠的料肉比影响

由结果可知(表4)，发酵玉屏风药渣醇提物在不同阶段小鼠的料肉比均低于未发酵组，与空白组相比，发酵物在5～7d，8～10d，1～14d料肉比均低于空白组。1～14d整个阶段发酵药渣与空白组和未发酵组料肉比差值在1～2之间。

表4发酵yolrs对小鼠料肉比影响

5.3.3发酵玉屏风药渣醇提物对小鼠脏器指数影响

由结果可知(图12)，喂药结束后空白组、未发酵组和发酵组心脏指数、肝脏指数、肾脏指数、肺脏指数、脾脏指数和胸腺指数均无差异。说明发酵药渣醇提物在此阶段时间给药没有对小鼠造成脏器方面的毒性。