本发明涉及铁皮石斛技术领域，具体涉及一种铁皮石斛多糖片段及其提取方法。
背景技术：
铁皮石斛（dendrobiumofficinalekimuraetmigo），为兰科多年生附生草本植物。味甘，微寒，归胄、肾经。历代中药典籍《神农本草经》、《本草纲目拾遗》等都有记载，以新鲜或干燥茎入药，具有滋阴清热、养胃生津、补肾益精之功效。
传统中医将具有多饮，多食，多尿，久则身体消瘦或尿有甜味为主要症状的一类病症，称为“消渴”，而消渴症包括糖尿病。消渴症的发生以肾阴虚，肺胃燥热为基本病机，以气阴两虚为其病理特点。早在《黄帝内经》中提出治法以“养阴生津，平衡阴阳”为主。《本草正》云：石斛“能退火，养阴，除烦……亦止消渴热汗”。《中药大辞典》记载石斛“清热养阴，用于热病伤津，口干烦渴”。石斛既能生津止渴，又能清肺胃虚热，自古以来就是治疗消渴症的专药。
目前针对铁皮石斛降血糖功效的研究实验均存在多糖提取率低、杂质含量高、多糖成分不明确、作用特定性不强等缺点，且提取方法较为传统、单一，得到的多糖品质较差，对降血糖作用存在非特效型。
《霍山石斛多糖及其酶解片段抑制h2o2诱导人晶状体上皮细胞凋亡的研究，李小龙，合肥工业大学硕士学位论文》的作者从霍山石斛类原球茎中提取了命名为dhpd1的多糖片段，并最终得出了dhpd1及其酶解片段可以显著抑制h2o2诱导人晶状体上皮（hle细胞）损伤和凋亡的结论，但是其并未研究该多糖片段调节血糖的效果。本发明人依照论文所述地方法重新提取了dhpd1，发现虽然dhpd1确实能够缓解链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病型白内障，但是降血糖的功效并不明显。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种对链脲佐菌素致糖尿病的sd大鼠的降血糖作用显著的铁皮石斛多糖片段。
本发明的另一目的在于提供一种铁皮石斛多糖片段的提取方法，该提取方法提取率高、除杂率高。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种铁皮石斛多糖片段，由如下摩尔百分比的单糖组成：
d-葡萄糖11.4%-21.8%
d-甘露糖24.0%-36.5%
d-半乳糖8.3%-19.0%
l-鼠李糖13.2%-19.0%
d-木糖3.8%-8.6%
d-夫糖7.7%-13.3%，
其中，所述铁皮石斛多糖片段的分子量为3074.8-3192.6。
本发明的多糖片段从铁皮石斛中提取而得，经实验证明，本发明的铁皮石斛多糖片段对正常小鼠的胰岛素分泌无刺激作用，安全性更高，而且相对格列吡嗪降糖药以及dhpd1，血糖下降率、胰岛素上升率、胰高血糖下降率均比较好，可见本发明的多糖片段对链脲佐菌素致糖尿病的sd大鼠的降血糖作用显著。
优选地，所述铁皮石斛多糖片段由如下摩尔百分比的单糖组成：
d-葡萄糖11.4%-15.2%
d-甘露糖26.0%-31.5%
d-半乳糖9.4%-12.0%
l-鼠李糖15.2%-19.0%
d-木糖3.8%-4.6%
d-夫糖8.3%-9.3%。
本发明的另一发明目的通过下述技术方案实现：一种铁皮石斛多糖片段的提取方法，包括如下步骤：
（1）水提：将铁皮石斛用水提取，得到铁皮石斛水提取液；
（2）脱蛋白：利用脱蛋白方法对铁皮石斛水提取液进行脱蛋白处理，得到粗提取液；
（3）酶解修饰：对所述粗提取液进行加入生物酶剂进行酶解，得到混合多糖提取液，所述生物酶剂包括纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶中的至少一种；
（4）纯化：利用纯化方法对混合多糖提取液进行纯化处理，去除小分子杂质，得到单一多糖提取液，所述小分子杂质包括无机盐、低聚糖；
（5）干燥：将单一多糖提取液进行干燥，即得到所述的铁皮石斛多糖片段。
通过本发明的提取方法，可以从铁皮石斛中提取本发明的均一的多糖片段，步骤简单，除杂率高、提取率在1.2%以上（提取率=多糖片段重量/铁皮石斛原料重量）。
其中，所述步骤（1）水提具体步骤为：将铁皮石斛粉碎至60目以上，超声水浸提取1-3次，每次提取所用的水为铁皮石斛的20-30重量倍，然后取滤液进行减压浓缩，得到所述的铁皮石斛水提取液。其中超声的频率为30-50khz，每次水浸提取的时间为10-30min。
本发明的步骤（1）水提的主要创新点在于运用了超声技术，通过振动能量切断多糖分子的部分糖苷键，从而降低多糖分子量、促进多糖水溶性，进而提高本发明铁皮石斛多糖片段的生物活性，降血糖的效果响应时间有所降低。
其中，所述步骤（2）脱蛋白的具体步骤为：往所述的铁皮石斛水提取液加入90%-95%的乙醇，使多糖沉淀（一般使铁皮石斛水提取液中的乙醇体积分数为80%-90%即可），收集沉淀物，将沉淀物溶解于水中，加入sevage试剂，混合均匀后离心，取上清液，即得到所述粗提取液。
本发明的步骤（2）脱蛋白的具体步骤首先利用醇沉提取出粗糖沉淀物，除去水溶性而不溶于乙醇的杂质，将粗糖沉淀物重新溶于水后，再进一步地利用sevage试剂将蛋白质沉淀出来，通过离心取得上清液。通过本发明的步骤（2），已经将大部分的大分子蛋白质去除。优选地，所述sevage试剂由氯仿和正丁醇按体积比5:1的比例混合组成，所述sevage试剂与溶解了粗糖沉淀物的水的体积比为1:2，并且在加入sevage试剂后，摇晃溶液0.3-0.7h，然后再以900-1100r/min的速度进行离心，最后取得上清液。通过更为优选地方法取得的上清液相对更纯净。
其中，所述步骤（3）酶解修饰控制酶解的温度为48-50℃，酶解的ph值为4.5-5.2，酶解的反应时间为70-110min，所述生物酶剂由纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶溶于溶剂中制得，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.5%-0.9%、0.3%-0.7%、1.1%-1.5%。本发明的核心技术点之一在于采用纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶组合的生物酶剂对多糖片段进行修饰，利用纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的特异性对多糖片段的特定糖苷键进行降解，使新生成的非还原末端行程末端，从而改变了多糖片段的单糖组成以及聚合结构，决定了本发明铁皮石斛多糖片段在降血糖作用上的显著性。也因此，对于纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的用量选择是有很大地讲究的，不同地用量比例会影响不同糖苷键的降解程度不同，从而可能形成结构、功能完全不一样的多糖片段。本发明人通过对酶解温度、酶解ph、酶解时间以及生物酶剂中酶的种类和用量进行多次重新组合，然后以实践得出结论，最终得出了得出了上述的优选方案。
在众多的优选方案中，更为优选地，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.7%、0.5%、1.3%。
其中，所述步骤（4）纯化包括如下步骤：
a、超临界萃取：萃取温度为40-60℃，萃取压力为180-220bar，二氧化碳流量为15-25l/h，萃取时间为90-150min，每隔20-40min收集一次萃取产物；
b、凝胶柱层析：取所述萃取产物，上sephadexg-75凝胶柱，用0.5-1.5mol/l的tris-hcl缓冲液以1-3ml/min的流速进行洗脱，以硫酸-苯酚法检测，得纯化液；
c、透析：将纯化液在0-8℃的温度下透析10-14h，得到所述单一多糖提取液。
通过上述步骤（4）纯化的具体操作，进一步出去了多糖片段中小数难以除去的小分子杂质。虽然本发明的超临界萃取、凝胶柱层析和透析单一而言，均是对于现有技术的重新设定，但是对于不同分子量、结构的多糖片段，现有技术往往只能通用，但是提取效率堪忧，甚至可能会使本发明的多糖片段中混入分子量差异较大的其它多糖片段，从而影响多糖片段的均一性。本发明人通过对超临界萃取、凝胶柱层析和透析进行组合使用，并对参数进行针对性设定，从而使本发明纯化方法相对常规的方法以及设定而言，提取率得以提高10%以上。
在众多的优选纯化方法中，提取率相对常规的方法以及设定提高15%的更为优选的方案为：所述步骤（4）纯化包括如下步骤：
a、超临界萃取：萃取温度为50℃，萃取压力为200bar，二氧化碳流量为20l/h，萃取时间为120min，每隔30min收集一次萃取产物；
b、凝胶柱层析：取所述萃取产物，上sephadexg-75凝胶柱，用1mol/l的tris-hcl缓冲液以2ml/min的流速进行洗脱，以硫酸-苯酚法检测，得纯化液；
c、透析：将纯化液在4℃的温度下透析12h，得到所述单一多糖提取液。
其中，所述步骤（5）干燥的具体步骤为：将单一多糖提取液进行减压冷冻干燥，即得到所述的铁皮石斛多糖片段。减压冷冻干燥相对其他热干燥方式对于多糖片段的破坏性更低，至于具体的温度、气压和时间可以为-50～-30℃、5-15pa、3-5h，也可以根据现有技术进行设定，此处不再累述。
本发明的有益效果在于：1、本发明的多糖片段从铁皮石斛中提取而得，经实验证明，本发明的铁皮石斛多糖片段对正常小鼠的胰岛素分泌无刺激作用，安全性更高，而且相对格列吡嗪降糖药以及dhpd1，血糖下降率、胰岛素上升率、胰高血糖下降率均比较好，可见本发明的多糖片段对链脲佐菌素致糖尿病的sd大鼠的降血糖作用显著；2、本发明的提取方法步骤简单，提取率和除杂率高，提取出的多糖片段结构稳定，易于推广。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
本实施例通过如下步骤提取所述的铁皮石斛多糖片段：
（1）水提：将铁皮石斛粉碎至60目以上，超声水浸提取3次，每次提取所用的水为铁皮石斛的25重量倍，然后取滤液进行减压浓缩，得到所述的铁皮石斛水提取液；其中超声的频率为40khz，每次水浸提取的时间为20min。
（2）脱蛋白：往所述的铁皮石斛水提取液加入95%的乙醇，使铁皮石斛水提取液中的乙醇体积分数为90%，收集沉淀物，将沉淀物溶解于水中，加入sevage试剂，摇晃溶液0.5h，然后再以1000r/min的速度进行离心，最后取上清液，即得到所述粗提取液，其中，所述sevage试剂由氯仿和正丁醇按体积比5:1的比例混合组成，所述sevage试剂与溶解了所述沉淀物的水的体积比为1:2；
（3）酶解修饰：对所述粗提取液进行加入生物酶剂进行酶解，得到混合多糖提取液，其中，酶解修饰控制酶解的温度为49℃，酶解的ph值为4.8，酶解的反应时间为90min，所述生物酶剂由纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶溶于溶剂中制得，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.7%、0.5%、1.3%。
（4）纯化：包括如下步骤：a、超临界萃取：萃取温度为50℃，萃取压力为200bar，二氧化碳流量为20l/h，萃取时间为120min，每隔30min收集一次萃取产物；b、凝胶柱层析：取所述萃取产物，上sephadexg-75凝胶柱，用1.0mol/l的tris-hcl缓冲液以2ml/min的流速进行洗脱，以硫酸-苯酚法检测，得纯化液；c、透析：将纯化液在4℃的温度下透析12h，得到所述单一多糖提取液。
（5）干燥：将单一多糖提取液进行减压冷冻干燥，即得到所述的铁皮石斛多糖片段。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤（1）水提中，超声水浸提取次数为1次，提取所用的水为铁皮石斛的20重量倍；超声的频率为30khz，每次水浸提取的时间为30min。
所述步骤（2）脱蛋白中，往所述的铁皮石斛水提取液加入的乙醇体积浓度为90%，使铁皮石斛水提取液中的乙醇体积分数为80%，加入sevage试剂后摇晃溶液0.3h，然后再以900r/min的速度进行离心，最后取上清液；
所述步骤（3）酶解修饰中，酶解修饰控制酶解的温度为48℃，酶解的ph值为4.5，酶解的反应时间为70min，所述生物酶剂由纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶溶于溶剂中制得，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.5%、0.3%、1.1%；
所述步骤（4）纯化中，a步骤的萃取温度为40℃，萃取压力为180bar，二氧化碳流量为15l/h，萃取时间为90min，收集萃取产物的时间间隔为20min；b步骤的tris-hcl缓冲液浓度为0.5mol/l，流速为1ml/min；步骤c的透析温度为0℃，时间为10h。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤（1）水提中，超声水浸提取次数为2次，提取所用的水为铁皮石斛的20重量倍；超声的频率为50khz，每次水浸提取的时间为10min。
所述步骤（2）脱蛋白中，往所述的铁皮石斛水提取液加入的乙醇体积浓度为92%，使铁皮石斛水提取液中的乙醇体积分数为82%，加入sevage试剂后摇晃溶液0.7h，然后再以1100r/min的速度进行离心，最后取上清液；
所述步骤（3）酶解修饰中，酶解修饰控制酶解的温度为50℃，酶解的ph值为5.2，酶解的反应时间为110min，所述生物酶剂由纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶溶于溶剂中制得，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.9%、0.7%、1.5%；
所述步骤（4）纯化中，a步骤的萃取温度为60℃，萃取压力为220bar，二氧化碳流量为25l/h，萃取时间为150min，收集萃取产物的时间间隔为40min；b步骤的tris-hcl缓冲液浓度为1.5mol/l，流速为3ml/min；步骤c的透析温度为8℃，时间为14h。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤（1）水提中，超声水浸提取次数为3次，提取所用的水为铁皮石斛的28重量倍；
所述步骤（2）脱蛋白中，往所述的铁皮石斛水提取液加入的乙醇体积浓度为95%，使铁皮石斛水提取液中的乙醇体积分数为85%，加入sevage试剂后摇晃溶液0.4h，然后再以950r/min的速度进行离心，最后取上清液；
所述步骤（3）酶解修饰中，酶解修饰控制酶解的温度为49℃，酶解的ph值为5.1，酶解的反应时间为100min，所述生物酶剂由纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶溶于溶剂中制得，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.8%、0.4%、1.2%；
所述步骤（4）纯化中，a步骤的萃取温度为55℃，萃取压力为190bar，二氧化碳流量为22l/h，萃取时间为100min，收集萃取产物的时间间隔为30min；b步骤的tris-hcl缓冲液浓度为1.2mol/l，流速为2.3ml/min；步骤c的透析温度为2℃，时间为11h。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤（1）水提中，超声水浸提取次数为2次，提取所用的水为铁皮石斛的27重量倍；
所述步骤（2）脱蛋白中，往所述的铁皮石斛水提取液加入的乙醇体积浓度为93%，使铁皮石斛水提取液中的乙醇体积分数为84%，加入sevage试剂后摇晃溶液0.6h，然后再以980r/min的速度进行离心，最后取上清液；
所述步骤（3）酶解修饰中，酶解修饰控制酶解的温度为49℃，酶解的ph值为4.6，酶解的反应时间为80min，所述生物酶剂由纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶溶于溶剂中制得，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为0.8%、0.4%、1.4%；
所述步骤（4）纯化中，a步骤的萃取温度为55℃，萃取压力为195bar，二氧化碳流量为23l/h，萃取时间为135min，收集萃取产物的时间间隔为25min；b步骤的tris-hcl缓冲液浓度为1.1mol/l，流速为2.6ml/min；步骤c的透析温度为6℃，时间为12h。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于：
所述步骤（3）酶解修饰中，所述生物酶剂中纤维素酶、β-木聚糖酶、果胶酶的质量浓度分别为1.2%、1.0%、1.0%。
通过对实施例1-6提取得到的铁皮石斛多糖片段的分子量和单糖组成进行测定，实施例1-6提取得到的多糖片段分子量为3074.8-3192.6，由d-葡萄糖、d-甘露糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、d-木糖、d-夫糖六种单糖组成，每种单糖的摩尔百分比依次为11.4%-21.8%、24.0%-36.5%、8.3%-19.0%、13.2%-19.0%、3.8%-8.6%、7.7%-13.3%。
实施例1提取得到的铁皮石斛多糖片段降血糖效果测试：
1、铁皮石斛多糖片段对正常sd大鼠血糖、血清胰岛素的影响。
试验方法为：取正常大鼠36只，分成6组，分别给生理盐水20ml/kg，阳性药（格列吡嗪降糖药）0.0025g/kg，dhpd1多糖片段0.4g/kg，铁皮石斛粗多糖0.4g/kg，铁皮石斛多糖片段0.2g/kg、0.4g/kg、0.8g/kg，每天给药一次，连续3天，于末次给药后2h断尾取血，用葡萄糖氧化酶法测血糖，用放射免疫法测胰岛素，得下表1：
表1铁皮石斛多糖片段对正常sd大鼠血糖、血清胰岛素的影响
*和**：与空白对照组比较时p<0.05，p<0.01。
从上表可以看出，给药3天后，与生理盐水组相较，铁皮石斛多糖片段的低、中、高剂量在统计学上无显著差异，而铁皮石斛粗多糖对血糖值和血清胰岛素有一定的影响，说明本发明提供的铁皮石斛多糖片段对正常大鼠的空腹血糖无影响，说明本发明提供的铁皮石斛多糖片段对正常小鼠的胰岛素分泌无刺激作用，相比铁皮石斛粗多糖，本发明提供的铁皮石斛多糖片段安全性更高。
2、铁皮石斛多糖片段对链脲佐菌素-sd大鼠血糖、血清胰岛素、胰高血糖素的影响。
试验方法为：（1）建模：sd大鼠禁食16h，称重，注射链脲佐菌素70mg/kg，72h后断尾取血，再测定空腹血糖值，取血糖值大于16mmol/l供试验用；（2）取糖尿病大鼠48只，随机分成6组，分别给生理盐水20ml/kg，阳性对照药（格列吡嗪降糖药）0.0025g/kg，铁皮石斛粗多糖0.4g/kg，铁皮石斛多糖片段0.2g/kg、0.4g/kg、0.8g/kg，每天给药一次，连续9天，分别测定初始血糖值和第3天、第6天、第9天的空腹血糖值、血清胰岛素、胰高血糖素，得表2-4。
表2用药第3天后各项检测结果
*和**：与空白对照组比较p<0.05，p<0.01。
表3用药第6天后各项检测结果
*和**：与空白对照组比较p<0.05，p<0.01。
表4用药第9天后各项检测结果
*和**：与空白对照组比较p<0.05，p<0.01。
由表2-4表明，本发明提供的铁皮石斛多糖片段能显著降低链脲佐菌素-sd大鼠的血糖水平，提高血清胰岛素含量，并抑制胰高血糖素的释放，与空白对照相比，有显著差异，与阳性对照组（格列吡嗪降糖药）比较，在用药到第9天时，多糖片段组高剂量（0.8g/kg/d）的血糖下降率、胰岛素上升率、胰高血糖下降率均比阳性对照组高。此外，与粗多糖比较，多糖片段的降血糖效果更加明显，且随给药时间增加，作用效果随之增加。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。