一种抗菌肽及其分离方法与流程

本发明涉及分子生物学的技术领域，尤其涉及一种抗菌肽及其分离方法。

背景技术：

凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)，又名为南美白对虾(penaeusvannameiboone)，分类学上隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、游泳亚目、对虾科、滨对虾属，原产于南美洲太平洋海岸水域。凡纳滨对虾由于具有生长速度快、对食物要求低、环境适应力强、适宜密养、单产高、肉质鲜美等特点，已经成为继中国对虾、斑节对虾的世界三大养殖虾种之一。虽然凡纳滨对虾产量逐年增长，但是伴随着凡纳滨对虾养殖的产业化、高度密集化，凡纳滨对虾养殖的问题也不断出现，养殖环境恶化引发了各种疾病的产生，凡纳滨对虾抗病能力下降，引起了大规模的死亡，造成了巨大的生态和经济损失。

随着海洋药物研究的进展，已经有种类非常丰富的抗菌肽在海洋水生生物中被发现，其中甲克动物中的虾类和蟹类也发现许多抗菌肽。研究显示，在对虾的养殖过程中加入抗菌蛋白，可以显著提升对虾生长速率、相对增重率、饲料系数、成活率及抗病能力等。

研究表明抗菌肽能够防治对虾病害，并且凡纳滨对虾血液中含有抗菌肽，因此分离得到抗菌肽对对虾病害的防治有重要意义。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种抗菌肽及其分离方法，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗菌肽及其分离方法，为进一步开发具有抑菌活性、抗肿瘤活性的生物制品奠定基础。

为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种抗菌肽，其氨基酸序列如序列表seqidno:1所示。

一种抗菌肽的分离方法，包括以下步骤：

步骤一、凡纳滨对虾的准备：采用新鲜的凡纳滨对虾；

步骤二、副溶血弧菌的制备：

a、菌种活化：把-80℃保存的副溶血弧菌在肉汤固体培养基过夜活化，按照5ml肉汤液体培养基+100μl菌种，使用摇床在37℃下恒温过夜培养12h到对数生长期；

b、菌种扩培：取活化后的菌液进行扩大培养，按照50ml肉汤液体培养基+200μl活化菌液，在37℃下恒温摇床培养3h，收集菌液；

c、离心、洗涤：将菌液在室温下，12000rpm离心1min，用质量分数0.85％的无菌生理盐水洗涤3次；

d、计数：采用血球计数板法显微计数，用质量分数0.85％的无菌生理盐水将菌液稀释到1.0×10⁷cfu/ml的注射浓度，于4℃保存备用；

步骤三、副溶血弧菌对凡纳滨对虾的刺激：使用含有100μl副溶血弧菌菌悬液的1ml无菌注射器于凡纳滨对虾的第2或3腹节处进行肌肉注射；

步骤四、血浆的制备：

24小时后，先用75％酒精给对虾消毒，然后用1ml注射器直接在凡纳滨对虾的心脏抽取血淋巴，并与抗凝剂按体积比1:1混合，在4℃下，800g离心10～15min，除去大多数完整的血蓝蛋白，取上清液分装后于-20℃保存备用；

步骤五、抗菌肽的分离：采用高效液相色谱分离：

a、样品前处理：取出-20℃保存的血清原样，用超纯水稀释样品，上层稀释5倍，中层稀释15倍；先取处理后的样品，用注射器注入0.22微米的膜滤器除杂，再装进自动进样器的样品瓶中，放在冰块上保存；

b、先将实验用的流动相a即超纯水、流动相b即乙腈超声脱气后，打开高效液相色谱仪，先冲泵，再平衡，采用梯度洗脱方法，设置洗脱条件：流速：0.3ml/min、波长：214nm、进样量：20μl、流动相a：超纯水、流动相b：乙腈(色谱纯)、0-20min：55％-60％b；

c、点击开始，自动进样，跑样，收集主要色谱峰，冻干备用得到含抗菌肽的制品。

作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述肉汤液体培养基的配方：蛋白胨10g、牛肉膏5g、nacl5g、加蒸馏水950ml，用1mnaoh将ph调至7.2，定容至1000ml，121℃高压灭菌20-30min，室温保存。

作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述肉汤固体培养基的配方：称取23.5g琼脂，加1000ml蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20-30min，冷却到46℃备用。

由于本发明采用了上述的技术方案，使得本发明具有以下有益效果：本发明分离得到的抗菌肽为进一步开发具有抑菌活性、抗肿瘤活性的生物制品奠定了基础。

附图说明

图1为本发明的考染电泳图；其中，从左到右的样品依次为：maker(maker)、生1(稀释5倍的生理盐水对照组的上层血清)、vp1(稀释5倍的副溶血弧菌刺激的上层血清)、生2(稀释15倍的生理盐水对照组的中层血清)、vp2(稀释15倍的副溶血弧菌刺激的中层血清)；

图2为本发明银染电泳图；其中，从左到右的样品依次为：maker(marker)、生1(稀释5倍的生理盐水对照组的上层血清)、vp1(稀释5倍的副溶血弧菌刺激的上层血清)、生2(稀释15倍的生理盐水对照组的中层血清)、vp2(稀释15倍的副溶血弧菌刺激的中层血清)；图3为本发明稀释5倍的生理盐水对照上层血清色谱图；

图4为本发明稀释5倍的副溶血弧菌刺激得到的上层血清色谱图。

具体实施方式

实施例1

一种抗菌肽，其氨基酸序列如序列表seqidno:1所示。

实施例2

2.1实验方法

凡纳滨对虾，购自汕头市华勋水产有限公司牛田洋基地；实验菌种：副溶血弧菌，为汕头大学保存菌种。

2.2实验方法

2.2.1凡纳滨对虾的准备

从汕头市华勋水产有限公司牛田洋基地购买新鲜的凡纳滨对虾。

2.2.2副溶血弧菌的制备

1、菌种活化：把-80℃保存的副溶血弧菌在肉汤固体培养基过夜活化，按照5ml肉汤液体培养基+100μl菌种，使用摇床在37℃下恒温过夜培养12h到对数生长期。

2、菌种扩培：取活化后的菌液进行扩大培养按照50ml肉汤液体培养基+200μl活化菌液，在37℃下恒温摇床培养3h，收集菌液。

3、离心、洗涤：将菌液在室温下，12000rpm离心1min，用0.85％无菌生理盐水洗涤3次。

4、计数：采用血球计数板法显微计数，用0.85％的无菌生理盐水将菌液稀释到1.0×10⁷cfu/ml的注射浓度，于4℃保存备用。

作为实施例的优选方式，所述肉汤液体培养基的配方：蛋白胨10g、牛肉膏5g、nacl5g、加蒸馏水950ml，用1mnaoh将ph调至7.2，定容至1000ml，121℃高压灭菌20-30min，室温保存。

作为实施例的优选方式，所述肉汤固体培养基的配方：称取23.5g琼脂，加1000ml蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌20-30min，冷却到46℃备用。

2.2.3副溶血弧菌对凡纳滨对虾的刺激实验

将购买的凡纳滨对虾，分成对照组和实验组，每一组100只，实验组使用含有100μl副溶血弧菌菌悬液的1ml无菌注射器于凡纳滨对虾的第2或3腹节处进行肌肉注射。对照组用等体积0.85％的无菌生理盐水代替副溶血弧菌的菌悬液。

2.2.4血浆的制备

24小时后，先用75％酒精给对虾消毒，然后用1ml注射器直接在凡纳滨对虾的心脏抽取血淋巴与抗凝剂(1:1)混合，在4℃下，800g离心10～15min，除去大多数完整的血蓝蛋白，取上清液分装后于-20℃保存备用。

2.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳法

1、样品前处理：取样品15μl，上样缓冲液5μl，巯基乙醇(样品的3％＝15×3％＝0.45μl)0.45μl于离心管，用封口条封口，在水中煮沸5min，然后在室温下12000r，离心5min。

2、配胶：

分离胶：将h2o、30％acrylamide、1.5mtris-hcl(ph8.8)、10％sds、10％过硫酸铵在小烧杯中混合，再加入temed搅拌均匀，马上将胶沿玻璃壁注入已经检漏好的胶室中，差不多到整个胶室的十分之七即可。注胶完毕后要马上往胶室继续注入的超纯水，垂直静止30分钟左右直到分离胶凝固。

浓缩胶：将h2o、30％acrylamide、1.5mtris-hcl(ph6.8)、10％sds、10％过硫酸铵在小烧杯中混合，再加入temed搅拌均匀，马上将浓缩胶沿玻璃壁注入已经倒去超纯水的装有凝固分离胶的胶室中，然后把梳子即样品槽模板垂直插入浓缩胶液中，直到浓缩胶凝固。

卡胶：将两块胶室装好，用超纯水检漏至不会漏水即可，接着注入电泳缓冲液。

上样：用微量进样器分别吸取5μl的marker和13μl的稀释5倍的生理盐水、副溶血弧菌刺激后的上层血清样品及稀释15倍的生理盐水、副溶血弧菌刺激后的中层血清样品，分别注入样品槽内。

跑胶、取胶：24ma(2块胶)，100v，120min左右，跑完胶后，先将缓冲液倒掉拿出胶板，用刮片刮玻璃板，再用超纯水冲胶板，一直重复至玻璃板拿下来，接着刮胶，用超纯水冲胶，重复直至胶松动，刮下的胶片放入盒子中，用超纯水清洗三次。

3、电泳分离蛋白质的常规检测与定量的方式：

(1)考马斯亮蓝法：把考马斯亮蓝溶液倒入装有胶的盒子中，封上保鲜膜，用微波炉加热，中火，15s，三次，然后放在脱色摇床上染色，转速125r左右，30min。染色结束后，回收考马斯亮蓝溶液，将配好的脱色液倒入，摇床过夜脱色。

(2)银染法：先用50％的甲醇浸泡胶两次，每一次15min；再用5％的甲醇浸泡胶一次，每一次10min；超纯水快洗三次；用10μl的ddt(1μl的ddt+100ml超纯水定容)浸泡20min；再用0.1％agno3(0.1g的agno3+100ml超纯水定容)染色20min；然后用超纯水快速清洗一次；用显影液(现配现用，3gagno3+50μl的36％甲醛+100ml超纯水定容)洗两次，每一次不超过15s；胶在显影液中浸泡至呈现条带即可；加入约3g的固体柠檬酸使胶停止显影；然后用超纯水保存胶。

5、分析图像，得到结论。

2.2.6高效液相色谱分离

1、样品前处理：取出-20℃保存的血清原样，包括生理盐水空白对照跟副溶血弧菌刺激的两种，用超纯水稀释样品，上层稀释5倍，中层稀释15倍。先取处理后的样品，用注射器注入0.22微米的膜滤器除杂，再装进自动进样器的样品瓶中，放在冰块上保存。

2、先将实验用的流动相a(超纯水)、流动相b(乙腈)超声脱气后，才可以使用。打开高效液相色谱仪，先冲泵，再平衡，采用梯度洗脱方法，选择洗脱条件为流速：0.3ml/min、波长：214nm、进样量：20μl、流动相a：超纯水、流动相b：乙腈(色谱纯)、0-20min：55％-60％b。

3、点击开始，自动进样，跑样，收集主要色谱峰，冻干备用得到含抗菌肽的制品。

2.2.7质谱检测

1、样品前处理：取1000kda透析袋，先用蒸馏水清洗透析袋3遍，折好一边用夹子夹住，用移液枪取1ml样品加到透析袋中，排除气泡，折好另一边用夹子夹紧，放进装有超纯水的烧杯中进行透析，水没过透析袋，用保鲜膜给烧杯封口，放入4℃的冰箱中，透析时间一般是4h换一次透析液，第一次时间短一些，共换四次水。将透析后的样品拿去冷冻干燥，冷冻干燥后分别放入3kda和10kda超滤管中,在20℃下，离心12000g，10min，收集滤液，分装为分子量3kda以下，3kda～10kda，10kda以上的三部分。

将上述样品及得到的反相高效液相色谱的分离条件一起送到上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱检测。

2.2.8凡纳滨对虾降解片段的鉴定

根据质谱检测结果得到的样品的分子量和氨基酸序列,在数据库上进行搜索和比对,并进行生物信息学分析。

登录http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站,点击blast,选择basicblast中的proteinblast，然后在blastpsuite中的enterquerysequence里，输入降解片段的氨基酸序列,点击blast，获取与此降解片段的氨基酸序列相关的蛋白质的氨基酸序列、登录号、来源等基本信息

实施例3结果与分析

3.1聚丙烯酰胺凝胶电泳法

3.1.1考马斯亮蓝法

从图1中可知，maker范围在大于66.2kda中，对1与vp1中肽段分布大致相同，而对2与vp2的肽段分布差别较大，对2几乎没有什么肽段，而vp2中有肽段分布。由此，我们可以推测可能是副溶血弧菌刺激后虾血产生了新的肽段。

3.1.2银染法

从图2中可知，maker范围在大于35.0kda中，对1与vp1大致相同；maker范围在小于25.0kda中，vp2比对1多了肽段。maker范围在大于66.2kda中，对2比vp2少了很多的肽段，maker范围在小于18.0kda中，对2比vp2多了很多肽段。因此，我们可以推测，用副溶血弧菌刺激后的虾血可能产生了一些肽段，也有一些肽段消失了。

3.1.3结果分析

通过上面的图1和图2，我们可以发现，生1(稀释5倍的生理盐水对照组的上层血清)、vp1(稀释5倍的副溶血弧菌刺激的上层血清)、生2(稀释15倍的生理盐水对照组的中层血清)、vp2(稀释15倍的副溶血弧菌刺激的中层血清)这四种样品经电泳后都产生了很多的降解片段(小肽片段)，并且生理盐水对照组得到的以及副溶血弧菌刺激得到的样品，降解片段的分子量的大小也有很大的不同。例如，图1和图2中，maker范围在大于116.0kda及66.2kda-116.0kda之间，生1(稀释5倍的生理盐水对照组的上层血清)与vp1(稀释5倍的副溶血弧菌刺激的上层血清)的小肽片段分布类似，而生2(稀释15倍的生理盐水对照组的中层血清)与vp2(稀释15倍的副溶血弧菌刺激的中层血清)相比，vp2有很多小肽片段，而生2没有。由此，说明凡纳滨对虾经刺激后，血清中产生了很多的降解片段。因此，说明凡纳滨对虾经刺激后的血清确实含有降解片段。

3.2高效液相色谱分离

生理盐水空白对照组采用分离条件：流速：0.3ml/min、波长：214nm、进样量：20μl、流动相a：超纯水、流动相b：乙腈(色谱纯)、0-20min：55％-60％b；如图3所示，为稀释5倍的生理盐水对照上层血清色谱图。

副溶血弧菌刺激组采用分离条件：流速：0.3ml/min、波长：214nm、进样量：20μl、流动相a：超纯水、流动相b：乙腈(色谱纯)、0-20min：55％-60％b；如图4所示，为稀释5倍的副溶血弧菌刺激得到的上层血清色谱图。

3.3凡纳滨对虾降解片段的鉴定

将高效液相色谱法寻找到的对虾血清最适质谱分离条件以及样品送往上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱检测，根据检测结果，发现分子量在3000kda内副溶血弧菌刺激的对虾血清分离的比生理盐水的多了六个降解片段，如表1所示。

表1对虾血清(副溶血弧菌、3k)中表达显著的降解片段的质谱鉴定表

从表1中，可知六个降解片段中有两个来源于凡纳滨对虾，分别是1号降解片段(vlgdhs)和2号降解片段(tvtamdvvyalk)。根据上述结果，登录http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，点击网页左侧ncbihome中的proteins，在alldatabases中的输入框中输入蛋白质的英文名称，点击search，选择proteins中的proteins-proteinsequences，得到该蛋白不同的物种来源，查询与凡纳滨对虾相关的信息，得到以下结果：其中1号降解片段位于凡纳滨对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白一级结构的1279-1287位置上，因此，可以判断1号降解片段来源于凡纳滨对虾。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依次限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。