一种登革病毒的PCR检测方法与流程

本发明属于基因检测技术领域。具体地，本发明涉及一种蚊虫感染登革病毒的极早期检测方法。

背景技术：

登革热(denguefever，df)是由伊蚊(aedes)传播的、登革病毒(denguevirus,denv)感染引起的人类最严重的虫媒传染病，可引起登革热(dv)、重症登革热和登革休克综合征等。尤其是以高热、严重出血、休克等为临床症状的重症登革热，病死率较高。

登革病毒自1943年首次被分离以来，已在100多个国家出现过病毒流行，全球将近一半的人口(约25亿)有罹患登革热的危险，世界卫生组织最新统计数据显示每年约5千万～1亿会发生显性感染，近3亿人会发生隐性感染，显性感染者中约50万人因重症登革热需住院治疗，其中很大一部分是儿童，某些地区的死亡率约5％。由于全球气候变暖、人口快速增长、人员流动性激增等因素，登革病毒感染的威胁正日趋严重，近几十年全球登革热发病率大幅度增长。据预测，全球50-60％的人口可能会面临威胁，登革病毒感染已成为一个世界性的严重公共卫生问题，是世界卫生组织呼吁全球预警和应对(globalalertandresponse，gar)的疾病之一。

在我国，登革病毒的感染也较为严重，广东、广西、海南、福建等东南沿海地区是高发地区。尤其2014年，在广东等东南沿海地区出现历史上最为严重的登革热疫情，是近年来十分罕见的，约有3万多人显性感染，发病人数是常年的10倍以上，严重威胁着广东、乃至深圳广大居民的健康。由于目前尚无特效治疗手段，同时疫苗研制尚未成功，所以，在我国登革热也是一个非常严重的公共卫生问题。

登革病毒以伊蚊为传播媒介，共有四种不同的病毒毒株。目前认为：病毒的传播途径是由雌蚊叮咬带有病毒血症的登革热患者或灵长类，病毒在蚊虫体内增殖，经8-10天的潜伏期，再将病毒传播给健康人，伊蚊感染后无症状，但可终身携带和传播病毒，并可经卵传递给后代。由此可见：伊蚊在登革病毒的自然循环中处于中心的位置。所以，针对伊蚊感染登革病毒进行检测将在极早期获得疾病传播的信息，将成为控制登革病毒在人群中传播的极早期监控手段。

长期以来，登革病毒传播的极早期方法非常欠缺，对登革病毒的检测常常是疫情发生之后，即出现人群感染病例以后的检测，使得对登革病毒的检测常常处于被动和滞后的状态，常用的检测方法为：elisa方法检测病人血清中特异性的登革病毒抗体和登革病毒抗原；pcr方法检测登革病毒的基因序列。而对于蚊虫感染登革病毒的检测方法则相对欠缺，仅仅在人感染的流行区域对蚊虫进行登革病毒基因进行pcr检测，检测基因针对登革病毒的结构基因e基因。所以，针对蚊虫感染登革病毒的检测方法尚未建立，而极早期检测方法更是未见。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于：蚊虫感染登革病毒的极早期检测技术。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为提供一种登革病毒的pcr检测方法，包括如下步骤：

s1、登革病毒rna的提取纯化：匀浆破碎蚊虫虫体和/或孑孓虫体和/或虫卵，提取全部rna分子，采取负向选择的方法去除宿主mrna，纯化得到登革病毒rna；

s2、登革病毒rna分子的逆转录：根据登革病毒不同毒株之间的共有序列，设计特异性逆转录pcr的茎环状引物，逆转录所述登革病毒rna得到登革病毒的cdna；

s3、实时荧光定量pcr：根据所述共有序列和所述茎环状引物，设计实时荧光定量pcr引物，利用实时荧光定量pcr的方法定量检测登革病毒的浓度。

在本发明提供的登革病毒的pcr检测方法中，所述步骤s1中，基于蚊虫mrna具有3’-polya、而登革病毒rna的3’末端没有多聚polya的特征，利用寡dt纤维素-核酸纯化柱吸附除去宿主mrna分子，保留没有3’-polya的rna，利用负向选择纯化登革病毒rna。

在本发明提供的登革病毒的pcr检测方法中，所述步骤s2中，所述共有序列为5’-ttttwawtagagagcagatctctg-3’，其中w为a或t；所述茎环状引物为：

5’-cagagatctgctcttawtwaaaagtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacttttwaw-3’。

在本发明提供的登革病毒的pcr检测方法中，针对登革病毒不同毒株基因组中5’-utr的特征性一致序列，采用简并密码获得所述共有序列。

在本发明提供的登革病毒的pcr检测方法中，所述步骤s3中，设计一对实时荧光定量pcr引物，引物序列如下：

正向引物：5’-ttttawwtagagagcagatctctg-3’

反向引物：5’-gtcacgcacagcacctca-3’

以所述登革病毒的cdna为模板，使用所述实时荧光定量pcr引物定量检测登革病毒的浓度。

实施本发明，具有如下有益效果：本发明的检测方法工艺简单高效、切实可行；设计的逆转录pcr引物、实时荧光定量pcr引物以及扩增条件具有高特异性、高灵敏度，可以在蚊虫感染登革病毒及越冬蚊虫虫卵、孑孓时期进行极早期检测，提供人群感染登革病毒危险性评估和极早期预警。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，对实施例描述中所使用的附图作简单地介绍。附图中：

图1为登革病毒四种毒株对比及共有序列；

图2为逆转录pcr的特异性茎环状引物5’-utrslprimer。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的实施例进行具体描述。

本发明要解决的技术问题在于蚊虫感染登革病毒的极早期检测技术：目前常用的检测方法是在疫情发生之后利用elisa技术检测病人血清中特异性的登革病毒抗体、登革病毒抗原和pcr方法检测登革病毒的基因序列。而对于蚊虫感染登革病毒的检测方法则相对欠缺，仅仅在人感染登革病毒的流行疫区对蚊虫中登革病毒结构基因e基因进行pcr检测，特异性、灵敏度均不理想。而且上述方法具有明显的滞后性，检测的对象均为疫情发生后的人群和蚊虫群体，无法在疫情发生极早期、蚊虫感染时期进行监控，而蚊虫感染登革病毒是登革热疫情发生的源头事件。所以，针对蚊虫感染登革病毒的极早期检测方法的建立将在疫情发生的源头提出预警，可以有效避免人群的大规模感染，控制疫情的发生发展。

在蚊虫感染登革病毒的极早期，病毒的滴度非常低，需要灵敏度高、特异性强的检测方法。目前常用的检测方法是针对蚊虫感染登革病毒后，登革病毒结构基因e基因进行pcr检测，该方法的灵敏度不高，且特异性不强，也无法确保四种登革病毒毒株均被有效检出。

本发明要解决的关键技术问题是在蚊虫感染登革病毒的极早期，即病毒滴度很低的情况下，建立灵敏度高、特异性强的检测方法。本发明是通过以下技术方案得以实现：针对4种登革病毒毒株保守的5’utr序列及基于保守序列的5’-utrslprimer的设计，5’-utr即5’-非翻译区(5’-untranslatedregions)，以此特异性5′-utrslprimer进行逆转录pcr，并对逆转录pcr扩增条件的设立优化，获得4种病毒毒株特异性cdna片段；基于上述特异性引物的实时荧光定量pcr引物的设计，并以登革病毒特异性cdna片段为模板，建立灵敏度高、特异性强的荧光定量pcr方法为登革病毒极早期检测方法。本发明的检测方法中设计的逆转录pcr引物和实时荧光定量pcr引物以及扩增条件具有高度特异性和灵敏度，可以在蚊虫感染登革病毒及越冬蚊虫虫卵、孑孓时期进行极早期检测，提供人群感染登革病毒危险性评估和极早期预警。

实施例1

1.登革病毒rna的提取纯化：

a、匀浆破碎蚊虫虫体、孑孓虫体、虫卵，利用trizol试剂提取全部rna分子，其中包括蚊虫rna和登革病毒rna；

b、基于蚊虫mrna具有3’-polya、而登革病毒rna3’末端没有多聚polya的特征，polya即多聚腺苷酸，利用寡dt纤维素(oligot纤维素)和核酸纯化柱(spincolumn柱)吸附除去宿主rna中大量的mrna分子，保留没有polya的rna，利用负向选择(negativeselection)纯化登革病毒rna；

c、获得的登革病毒rna分子经聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和紫外分光光度计od260/od280检测rna的纯度；凝胶电泳为特异性谱带，od260/od280≥2.0。

2.登革病毒rna分子的逆转录：

针对登革病毒四种毒株设计逆转录pcr的特异性茎环状引物，用于全部四种类型的登革病毒rna分子的逆转录pcr，具体步骤如下：

a、针对登革病毒四种毒株特定的一致性序列，进行生物信息学比对，发现四种登革病毒毒株的差异性较大，仅仅在5’-utr具有显著的共有序列，具体比对结果如图1中所示。

基于上述分析结果，5’-utr的共有序列为5’-ttttwawtagagagcagatctctg-3’，其中w为a或t；下划线部分为末端特异序列，此共有序列命名为5′-utrcprimer。

b、基于上述共有序列可知，其互补序列为5’-cagagatctgctcttawtwaaaa-3’，设计特异性逆转录pcr的茎环状引物(命名为5′-utrslprimer)，其具体结构如图2所示，该茎环状引物的具体序列为：

5’-cagagatctgctcttawtwaaaagtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacttttwaw-3’；

其中下划线部分与上述共有序列的3’末端序列互补。

c、逆转录获得登革病毒的cdna。

根据iscript^tmcdnasynthesiskit和上述特异性引物(5′-utrslprimer)，以步骤1中获得的纯化rna为模板逆转录成cdna，即登革病毒特异性cdna片段，所有操作均在冰上进行。具体操作如下：取rna样品1ug，5′-utrslprimer1ul加适量depc水至总体积12ul；将上述混合物置于pcr仪上，65℃反应5min，置于冰上2-3min；向上述混合物中分别加入10mmdntpmix2ul，ribolockrnaseinhibitor1ul，5×reactionbuffer4ul，revertaidtmm-mulvreversetranscriptase1ul，总体系20ul，充分混匀；上述反应体系置于pcr仪上反应42℃，60min，然后70℃温育5min，即获得包含登革病毒四种毒株的特特异性cdna片段。

3.实时荧光定量pcr：

设计针对上述共有序列和茎环状引物的实时荧光定量pcr引物，利用实时荧光定量pcr的方法定量检测登革病毒的浓度。具体操作步骤如下：

a、针对登革病毒四种毒株的共有序列5′-utrslprimer和茎环结构特异引物5′-utrslprimer，设计一对实时荧光定量pcr引物，引物序列如下：

正向引物：5’-ttttawwtagagagcagatctctg-3’

反向引物：5’-gtcacgcacagcacctca-3’

正向引物为登革病毒特异性序列，反向引物为茎环结构通用引物。

b、实时荧光定量pcr反应体系及程序

反应体系：realmastermix(2x)，10ul；正向引物，0.4ul；反向引物，0.4ul；cdna，1ul；h2o，8.2ul；总体积，20ul。

反应循环程序：95℃预变性2min；95℃变性15s；50℃退火/延伸40s；共40个循环。

c、实时荧光定量pcr测定

以18s为内参基因，利用上述体系和反应程序，对登革病毒特征性cdna片段进行荧光定量检测，并利用系统所带软件对实验结果进行分析，定量测定登革病毒的浓度。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。