一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种草莓盐胁迫相关基因fvdiv及其应用。

背景技术：

草莓多年生草本植物，属于蔷薇科草莓属，浆果类果树(林凤起，1986)。草莓果实为假果，由花托发育而成(雷家军，2006)。草莓果实色泽红嫩诱人，口感柔软多汁，独具风味，具备很高的营养价值及药用价值，素有“水果皇后”之称，广受大众欢迎(万清林，1994)。

植物对非生物逆境(干旱、冷害、高盐碱等)的适应性对于作物的产量和品质有着非常重要的影响，在许多地区是农业发展的瓶颈。由于北方地区草莓的种植是在日光温室中进行的，因而低温和盐碱胁迫一直是困扰设施草莓发展的瓶颈问题，但目前在草莓中还没有真正可用于抗逆遗传改良的基因。

在植物体内，通过转基因技术，过表达或干扰某个基因可以提高植物对环境胁迫的抗性。在烟草中，过表达精氨酸脱羧酶基因，进而提高植物体内多胺水平，增强了烟草对干旱胁迫的抗性(lietal.2017)。有研究报道，在拟南芥过表达gmwrky20基因，提高了拟南芥中aba含量，从而提高了拟南芥的抗旱性(luoetal.2013)。另有研究表明，在对模式植物金鱼草的研究中发现divaricata(div)radialis(rad)、dichotoma(dich)共同参与两侧对称花型发育的分子调控(魏海超等，2012)，但有关divaricata基因在植物耐盐过程中的作用鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种草莓盐胁迫相关基因fvdiv及其应用。本发明的技术方案是从二倍体森林草莓‘ruegen’中分离得到fvdiv基因，构建该基因的植物过表达载体，通过农杆菌介导法，将该基因转化到拟南芥中，以实现fvdiv基因的功能分析。

本发明提供了一种草莓盐胁迫相关基因fvdiv，该基因的cdna序列如seqno.1所示；草莓盐胁迫相关基因fvdiv编码的蛋白质，所述基因编码的氨基酸序列如seqidno：2所示；本发明还提供了一种含有草莓盐胁迫基因fvdiv的植物表达载体pri101-gfp-camv35s-fvdiv，将其通过农杆菌介导法转入拟南芥中。

实际上，任何一种将外源基因导入植物体内的表达载体都可以用，本发明优先选用的是的pri101-gfp-camv35s。

本发明的有益效果是：利用现有植物基因工程技术，本发明克隆了草莓耐盐相关基因fvdiv，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐胁迫明显提高。

附图说明

图1：fvdiv基因全长cdna序列的扩增结果。其中m为dl2000

图2：pri101-gfp-camv35s-fvdiv重组载体验证结果。其中m为dl2000

a：为kpn1和ecor1对pri101-gfp-camv35s-fvdiv重组载体双酶切验证结果。

b：为转化了的pri101-gfp-camv35s-fvdiv农杆菌的菌落pcr结果。

图3：pri101-gfp-camv35s-fvdiv测序比对结果。

图4：转基因拟南芥抗性筛选。

图5：为盐胁迫下转基因植株的生长状况。其中，wt为转化的拟南芥，line8/line19为两个独立的转基因株系。

图6：fvdiv与其他物种氨基酸序列比对结果

具体实施方式：

实施例1、草莓盐胁迫基因fvdiv的克隆

(1)以二倍体森林草莓‘ruegen’为试材。

(2)rna提取：采用改良ctab法，提取材料中的总rna之后用反转录试剂盒以rna为模板反转录得到cdna第一链。

(3)基因的克隆：以反转录的果实cdna第一链为模板，利用引物fvdiv-f和fvdiv-r进行pcr扩增，回收pcr产物，获得939bp的目的片段。

fvdiv-f：5＇－aaaggtaccatgtataggggaattgaagttc－3＇

fvdiv-r：5＇－aaagaattcctgatattgcatctcgaaacgc－3＇

其中，引物5＇端的前3个碱基为保护碱基，紧接着的6个碱基是酶切位点，5＇端前9个碱基是构建过表达载体所需，不属于fvdiv的基因序列。

实例2、植物表达载体的构建

(1)利用植物表达载体pri101-gfp-camv35s，选用kpn1和ecor1(购自takara公司)分别对pri101-gfp-camv35s和含有目的基因的pmd18-t(购自takara公司)进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用t4dna连接酶连接过夜后转化大肠杆菌感受态dh5a(购自北京全式金生物技术有限公司)，鉴定重组子后即可进行双酶切验证。

(2)选取双酶切验证正确的重组质粒，送金唯智生物科技有限公司测序。之后转化农杆菌gv3101感受态细胞，得到的含有重组质粒的农杆菌用于转化拟南芥。

实例3、转基因功能验证—拟南芥转化筛选及耐盐表型分析

3.1拟南芥转化

当拟南芥(哥伦比亚生态型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导侧花序的生成，转化前将材料浇透水。挑选含有目的基因fvdiv的农杆菌gv3101阳性克隆。接种于含有kan(卡那霉素)50mg/l和rif(利福平)25mg/l的yep液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h，取1ml培养好的菌液，加入50ml液体yep液体培养基，放置于28℃，200rpm振荡培养，使od600＝0.8左右。

将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，5min离心收集菌种，再用同等体积的ms重悬液(1/2ms+5％sucrose，ph5.7)重悬农杆菌，并加入表面活性剂silwet，使其终浓度达到0.03％(300μl/l)。一个月后收获了t0代种子在含有30mg/l的卡纳霉素的培养基上筛选出阳性植株(见图4)，以便收获t2代种子，用于盐胁迫实验。

3.2拟南芥阳性株系耐盐表型分析

在1/2ms培养基上播种的wt和转基因拟南芥种子生长5d后(约2片子叶)，挑选生长状况一直的植株转移到含有75mm的nacl的1/2ms的培养基上，生长12天之后测定主根长度(见图5)。测定结果如表1所示。

表1野生型和转基因植株在0mm和75mmnacl1/2ms培养基上主根长

由表1可知，在相同的培养条件和培养基上，12天之后，在不含nacl的1/2ms培养基上，野生型拟南芥(wt)的根长与转基因株系(line8和line19)拟南芥根长没有明显差别。在含有75mmnacl的1/2ms培养基上，转基因株系的主根明显长于野生型，且转基因植株的生长状态也优于野生型，叶片颜色较野生型绿。这说明，草莓fvdiv能够提高植物的抗盐胁迫能力。以上植株的培养条件均在温度23-25℃，光照1800～2200lx，光照时间为16h/d。

seqidno:1

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seqidno:2

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sequencelisting

<110>沈阳农业大学

<120>一种草莓盐胁迫相关基因fvdiv及其应用

<130>2017.7.11

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<212>dna

<213>人工合成

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