本发明属于生物工程
技术领域：
，特别地涉及一种几丁质的生产分离方法。
背景技术：
：几丁质又名甲壳素、甲壳质，其有效成分是几丁聚糖(壳聚糖)。在自然界中，几丁质存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、昆虫的外壳，高等植物的细胞壁等，是除纤维素以外的又一重要多糖。因几丁质的化学结构和植物纤维素非常相似，故几丁质又称为动物性纤维。节肢动物的外壳中有35％的蛋白质、30％的钙和无机盐、剩下的就是35％甲壳质。近年来，甲壳素的生物学功能在生理健康中的作用被广泛关注，其应用潜力巨大。在调节免疫方面，甲壳素能加强免疫细胞的增殖，因此有调节免疫力的功效。日本发表的动物实验证实甲壳素的免疫强化作用有助于减少肿瘤细胞的伤害，及促进肝脏受损细胞的新生与正常化。在预防癌症方面，甲壳素的抗癌效果已由日本东北药科大学确认，非常适合生物体而无毒性反应出现。北海道大学的研究小组也发现，甲壳素有抑制恶性肿瘤细胞扩散及移转的效果。在减少胆固醇和油脂吸收方面，甲壳素可抑制小肠对胆固醇的吸收，不但会减少胆固醇在肝脏的堆积量、也可降低低密度脂蛋白(ldl)的浓度、提高高密度脂蛋白(hdl)的含量，因此对于预防动脉硬化及心血管疾病有很好的效果。同时，甲壳素本身所带的正电离子与食物中带负电的脂肪自动附着结合，阻断脂肪分解酵素的作用，使脂肪在肠内不被吸收而直接排出体外。在改善消化机能方面，甲壳素可促进肠内有益菌丛的繁殖，抑制有害菌丛的滋生，减少大肠菌生长的机会，以达到健胃的功效。在预防血压升高方面，甲壳素是不会被人体吸收的一种高分子聚合物。日本水产厅主导的一项研究结果显示，在食品中添加甲壳素可保留食品原来的口味、又不致吸收过多食盐，可帮助高血压患者控制食盐的摄取。在减少体内重金属的积蓄方面，重金属在体内蓄积会造成神经性病变、器官功能失调等后遗症。甲壳素可以吸附铜、镉、锌、铀等重金属，并排出体外。甲壳素有助于体内废物的排除，而确保人体生理机能的正常运作。此外，壳聚糖在生物材料，食品添加剂和农业领域也有广泛应用价值。例如，生物材料方面，由于壳聚糖具有良好的生物相容性，由壳聚糖制成的人工皮肤透气性好，渗出性好，可以止痛，止痒，消肿化癖，并且能够促进皮肤生长，加快创面愈合。由壳聚糖制备的人工皮肤若与乙酸合用，还有镇痛和抗感染等功效。在食品添加剂应用方面，大量的研究表明，甲壳素和壳聚糖是无毒的，基于结构和氨基多糖的特点，它们有广泛的用途。而其各种经化学修饰或降解后的产物，由于具有极好的水溶性，更是日益受到青睐。美国食品与医药卫生管理局(fda)已批准其作为食品添加剂。而日本的食品工业中，壳聚糖的应用更是占据重要地位。在农业应用方面，用壳聚糖处理种子以及与种子接触的土壤，利用壳聚糖的抗菌能力和改善土壤的作用，可将壳聚糖与可溶性蛋白合成液体土壤改良剂。这种改良剂有适当的稳定性和具有可降解性，降解以后是优质的有机肥料，可供作物吸收，不但能抑制土壤中的病原菌生长繁殖，还能有效改善土壤的团粒结构。目前，壳聚糖的生产方法主要为化学法(酸碱法)和生物法(发酵法)。酸碱法是目前利用虾壳提取制备几丁质最普遍的方法，也是目前工业上大规模利用虾壳制备几丁质的主要方法。该方法先通过盐酸浸泡虾壳脱去碳酸盐，再通过naoh溶液进行碱煮脱去蛋白质和脂类物质，然后再洗涤至中性，使用kmno4溶液或者h2o2溶液脱色，最后干燥得到几丁质。得到的几丁质再通过浓碱液法脱去乙酰基，就可以得到不同脱乙酰度的壳聚糖。发酵法即以虾壳和虾头等废弃物为底料，利用微生物在其生长繁殖过程中产酸去除矿物质，产蛋白酶去除蛋白质。相比传统的酸碱法，微生物发酵法不仅反应条件温和，耗能少，而且发酵过程不会水解几丁质，可以得到较大分子量的几丁质产物，另外不会产生大量的酸碱废液，对环境友好。但目前此方法还处在实验室研究阶段，尚未大规模应用到工业化生产中。技术实现要素：针对现有技术中存在的不足之处，本申请通过探索几种商业化的蛋白酶，以虾蟹壳为原料，采用酶促反应催化脱蛋白的方法制备几丁质，从而提供了一种廉价、高效生产几丁质的方法，本发明的方法优化了反应条件，进一步提高了转化率和产品纯度，具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点。本发明提供了一种生产几丁质的方法，所述方法包括以下步骤：(1)采用1-3mol/l的盐酸浸泡虾蟹壳；(2)将浸泡液的ph值调节为2-4，然后加入酸性蛋白酶和假丝酵母脂肪酶进行酶解处理；(3)将酶解处理后的虾蟹壳脱色，用水漂洗，干燥得到几丁质。优选地，在本发明方法的步骤(2)中，所述酶解处理的条件为：反应温度35℃-45℃，反应时间为10-12小时，假丝酵母脂肪酶的加料质量是虾蟹壳质量的1-3wt％；更优选地，所述酶解处理的条件为：反应温度40℃，反应时间为12小时，假丝酵母脂肪酶的加料质量是底物质量的1wt％。优选地，在本发明方法的步骤(1)中，虾蟹壳浸泡2次，每次12小时。优选地，在本发明方法的步骤(2)中，所述酸性蛋白酶的投料量是2mg/100ml浸泡液；更优选地，所述酸性蛋白酶获自黑曲霉；更优选地，所述酸性蛋白酶的酶活力单位为10～30万u。在本发明方法步骤(3)中，虾蟹壳的脱色采用kmno4或h2o2进行；优选采用h2o2进行；更优选地，h2o2的使用质量为虾蟹壳质量的1％。在本发明方法的步骤(3)中，所述干燥的条件为：干燥温度50-70℃，干燥时间3-5个小时。本发明采用黑曲霉来源的酸性蛋白质进行水解，水解率高达80％以上，相对于现有技术中50％以下的蛋白水解率，水解率大幅度提高。本发明还采用假丝酵母脂肪酶与酸性蛋白酶结合的方式，虾蟹壳中的脂肪成分被有效地水解，从而更加有利于虾蟹壳中蛋白质成分的水解。本发明人在实验中发现，假丝酵母脂肪酶对蛋白质的水解具有很好的促进作用。假丝酵母脂肪酯对酸性蛋白酶水解的促进作用远高于假单胞菌、霉菌、猪胰腺来源的脂肪酶。本发明的几丁质的生产方法以虾蟹壳为原料，通过酶促反应催化蛋白质水解来制备高分子量的几丁质，操作简单，分离条件温和，大大提高了几丁质的转化率。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1示出本发明方法的工艺流程图。具体实施方式实施例1将蟹壳清水洗净后，称取10g蟹壳，敲碎，每块面积小于1cm2，放入100ml锥形瓶中，加入20ml1mol/l的盐酸，浸泡12小时，过滤除去液体得固体物质。将固体物质倒回锥形瓶，再次加入20ml新鲜的1mol/l的盐酸，浸泡12小时，直至蟹壳变软，以除去蟹壳中的钙质成分。实施例2将实施例(1)得到的产物过滤，除去液体，将固体物质倒回锥形瓶，加入20ml去离子水，使用1mol/l的盐酸或1mol/l的氢氧化钠，小心调节ph大约在3左右，加入10万酶活(u)的酸性蛋白酶(郑州食全食美商贸有限公司10万u/g～30万u/g，或郑州君凯化工产品有限公司10万u/g)以及底物质量1％的假丝酵母脂肪酶，以300rpm、40℃的条件在摇床中反应12小时，除去其中的蛋白质成分。此时样品由白色逐渐变得透明，得到水解后的透明产物。实施例3反应后产物蛋白含量的确定：取实施例2所得透明产物1g，使用bca蛋白定量试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)标准方法定量产物中残余蛋白含量，将此残余蛋白含量定义为反应后产物蛋白含量。初始产物蛋白含量的确定：将蟹壳清水洗净后，称取10g蟹壳，敲碎，每块面积小于1cm2，放入100ml锥形瓶中，加入20ml1mol/l的盐酸，浸泡12小时，过滤除去液体得固体。取少量固体并加入10万酶活(u)的酸性蛋白酶后，取1g酶解液，测定蛋白含量并将测量得到的蛋白含量定义为初始蛋白含量。以蛋白水解效率(％)评价几种酸性蛋白酶催化效率，蛋白水解率的计算公式如下。几种酸性蛋白酶水解效率数据见表1。表1酸性蛋白酶来源蛋白水解效率米曲霉38.9％黑曲霉83.2％胃蛋白霉48.9％由上表可知，黑曲霉来源的酸性蛋白酶效率最高，水解效率高达83.2％。实施例4在实施例3的基础上，本实施例以35℃、40℃、45℃的反应温度，10、11、12小时的反应时间，0.5％、0.8％、1％底物质量的假丝酵母脂肪酶量添加作为条件，实施三因素三水平正交试验，最终得到的最优的假丝酵母脂肪酶催化反应条件为：反应温度40℃，反应时间12小时，假丝酵母脂肪酶的添加量为底物质量的1％。实施例5本实施例采用假单胞菌脂肪酶、霉菌脂肪酶、假丝酵母脂肪酶和猪胰腺脂肪酶四种脂肪酶，就脂肪酶的来源对蛋白水解效率的影响进行了考查。将实施例(1)得到的产物过滤，除去液体，将固体物质倒回锥形瓶，加入20ml去离子水，使用1mol/l的盐酸或1mol/l的氢氧化钠，小心调节ph大约在3左右，分成4份。每份加入10万酶活(u)的酸性蛋白酶，然后在各份中分别加入底物质量1％的假单胞菌脂肪酶、霉菌脂肪酶、假丝酵母脂肪酶和猪胰腺脂肪酶，以300rpm、40℃的条件在摇床中反应12小时，除去其中的蛋白质成分。此时样品由白色逐渐变得透明，得到水解后的透明产物。通过实施例3的方法测量蛋白水解率，得到数据如表2所示。表2脂肪酶来源蛋白水解率假单胞菌脂肪酶62.3％霉菌脂肪酶60.9％假丝酵母脂肪酶83.2％猪胰腺脂肪酶65.5％由表2可知，在相同的条件下，采用假丝酵母脂肪酶进行酶解处理时，获得的蛋白水解率最高。实施例6在处理过程当中，蟹壳会产生一定红色，这时候需要使用脱色剂进行脱色处理。常用的脱色剂为高锰酸钾或者过氧化氢。使用过氧化氢不会有残留，因此，本实验选用过氧化氢作为脱色剂。由于不同反应批次样品产生颜色程度有所差异，故过氧化氢使用无定量，每批产品以gsb国标色卡标定处理后乳白色产品，确定过氧化氢使用量为底物量的0.1％。实施例7将实施例5脱色后产品经室温5倍产物体积清水漂洗后，50-70℃干燥3-5个小时即可得到最终分离的几丁质产物。实施例8定性分析：几丁质在高温和碱作用下会分解成几丁糖，几丁糖经碘和稀酸作用后呈现紫色。利用这个特性，可以对从虾蟹壳中提取的几丁质进行定性检测。定性分析步骤如下：称取1g提取的几丁质，放入试管中，加入1ml0.1％氢氧化钠，放入烘箱，160℃加热1小时。取1滴在白瓷点滴试样板上，加入1滴0.03％碘-碘化钾溶液和1滴1wt％硫酸，在白瓷点滴试样板上显示紫褐色，再加数滴75％硫酸，发现紫色逐渐消失，表明提取的物质为几丁质。当前第1页12