本发明属于食品致病菌检测技术领域，具体涉及一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法。
背景技术：
食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，食源性致病菌对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。食源性疾病并不随经济发展和技术进步而减少或消失，世界范围内食品安全恶性事件接连发生，食源性疾病未能受到有效控制，食源性疾病发生率居高不下，食品安全形势严峻。尽管政府监管部门不断加大对食品安全的监管力度，对食品安全研究领域科研投入逐年加大，同时食品企业也不断提高生产过程中食品安全意识，引进了haccp等先进的管理体系来确保食品安全，但是食源性致病菌污染食品进而导致食源性疾病暴发日益频繁。目前对致病菌污染食品途径控制当中，还无法找到一种完全有效杜绝致病菌污染的方式，开发出快速灵敏实用性强的致病菌检测方法就成为确保食品安全的一个重要保障。
现阶段常用的快速检测方法虽然得到广泛应用，常规pcr和免疫学检测方法,通常面临的问题是检测方法灵敏度不够高，一般食品样品经过选择性增菌处理后，待检细菌浓度要达到104-105cfu/ml才能得到比较准确结果，当食品样品中存在防腐剂，天然抗菌，抑菌成分时，往往待检致病菌浓度达不到检测限，导致出现假阳性结果。
综上，现有技术存在的缺点是，检测方法灵敏度不够高，容易出现假阴性结果。
技术实现要素：
本发明提供的一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，解决了现有技术的常规pcr和免疫学检测方法灵敏度不够高，容易出现假阴性结果的问题。
本发明的目的是提供一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：
s1，收集待测样品
s2，制备环糊精处理样品
向待测牡蛎样品中加无菌生理盐水，均质处理，加入环糊精，并使溶液中环糊精最终浓度为10g/100ml，均质处理，低速离心去除大颗粒物质，所得上清液高速离心，将沉淀物溶于0.01m醋酸生理盐水缓冲液，得到环糊精处理样品；
s3，制备膨润土包被活性炭
活性炭用去离子清洗，沥干备用；向膨润土中加入去离子水，膨润土与去离子水的比例为1g：50ml，震荡1min，700rpm离心1min，弃沉淀，将上层溶液转至干净的容器中，加入沥干的活性炭，上层溶液与沥干的活性炭之间的比为例为4ml：1g，37℃摇床过夜，随后55℃烘干，得到膨润土包被活性炭；
s4，制备膨润土包被活性炭处理样品
用0.85％生理盐水清洗膨润土包被活性炭，将环糊精处理样品与清洗好的膨润土包被活性炭混合，室温震荡；将震荡后的混合物转移至装有玻璃棉的容器内，用醋酸生理盐水缓冲液清洗并收集洗脱液；洗脱液离心，弃去上清液；将沉淀悬浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精dna溶液和去离子水；沸水浴，得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，离心，加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，离心，弃去上清液，保留沉淀的dna，加入无菌去离子水溶解沉淀的dna，得到dna模板，备用；
s5，pcr检测
pcr检测使用的引物序列为：
inlb1：5’-aatcactttctttggagcataatggtataagtg-3’
inlb2：5’-gttccatcaacatcataacttactgtgtaaacc-3’
如果获得的pcr检测产物片段为279bp，则结果为阳性。
优选的，上述牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，每升0.01m醋酸生理盐水缓冲液中溶质为0.01mol的乙酸和0.01mol的乙酸钠，溶剂为0.85％nacl溶液，用0.1m盐酸调节ph为5.0。
优选的，上述牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s2的具体步骤为：取待测牡蛎样品中加入无菌0.85％生理盐水，待测牡蛎样品与无菌0.85％生理盐水的比例为1g：3ml，均质处理，加入环糊精，并使溶液中环糊精最终浓度为10g/100ml，继续均质2min，低速离心1000rpm、5min，去除大颗粒物质，所得上清液高速离心10000rpm、10min，将沉淀物溶于0.01m醋酸生理盐水缓冲液，得到环糊精处理样品。
优选的，上述牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s3中，所述活性炭为200目的粉末。
优选的，上述牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s3中，每120ml上层溶液中含有1.52g的膨润土。
优选的，上述牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s4中，膨润土包被活性炭与环糊精处理样品的比例为4.6g：30ml。
优选的，上述牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s4中，所述将沉淀悬浮在5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精dna溶液和去离子水中，牛血清白蛋白溶液、鲑鱼精dna溶液和去离子水的体积比例为1:1:3。
优选的，上述牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法中，s5中，pcr采用50μlpcr反应体系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物inlb1，0.5μl引物inlb2，0.25μltaqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl；
pcr反应条件为：94℃，4min预变性；94℃，20s变性；60℃，20s退火；72℃，50s延伸，35个循环；72℃，10min终延伸；4℃保存。
与现有技术相比，一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，具有以下有益效果：
(1)本发明的方法是一种从牡蛎中灵敏快速实用性强无需前增菌的pcr检测方法，大大缩短目前常规单核细胞增生李斯特氏菌检测及快速检测方法的检测时间(新建立的检测方法对样品的检测时间为4小时)，且检测限仅为10cfu/25g，检测灵敏度高，不容易出现假阴性结果，可以确保食品从农场到餐桌流通过程中的食品安全实时检测，进而更好地确保消费者健康。
(2)由于食品中含有大量的pcr反应抑制因子，比如脂肪，蛋白质，酶，抗生素，有机和无机化学物质，多糖类物质等，这些抑制因子极大地影响了pcr方法对食品中致病菌检测的应用。目前，对于克服pcr反应抑制因子的方法是通过检测前12-24小时增菌的手段，提高检测的灵敏度，但同时也延长了检测时间。
本发明的目的是建立有效的样品处理方法提高致病菌从食品中的回收率，消除pcr反应抑制因子。β-环糊精(β-cyclodextrin)是一种环状多糖化合物，其中七个葡萄糖单体与一个特定体积的中空内部形成一个截短的锥形结构。它的疏水性空洞内可嵌入各种有机化合物，形成包接复合物，并改变被包络物的物理和化学性质。活性炭具有极强的吸附能力，这种吸附能力会受到碳表面化学结构的强烈影响。根据前期实验工作证实，定量的膨润土结合活性炭，并于β-环糊精结合使用，可以有效的将致病菌从食品中分离，并且能够有效的去除pcr反应抑制因子，另外在样品处理过程中添加定量鲑鱼精dna可以进一步去除pcr反应抑制因子，提高检测灵敏度，所以新建立的检测方法对样品的检测时间仅需要4小时。经申请人实验证明，如果不采用膨润土、活性炭、β-环糊精、鲑鱼精dna则pcr检测结果难以辨别，甚至无法得到pcr扩增结果。
从而，本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌为检测目标，建立一种从牡蛎中灵敏快速实用性强无需前增菌的pcr检测方法。
附图说明
图1是阳性和阴性检测结果电泳图；
其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为阳性检测结果，2号泳道为阴性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。
实施例1
一种牡蛎中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测方法，包括以下步骤：
s1，收集待测样品
本实施例1收集的待测样品为人工污染样品，人工污染样品按以下方法制备：取25g牡蛎样品人工污染1ml单核细胞增生李斯特氏菌菌悬液(浓度范围分别为100cfu/ml、101cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml)，人工污染的样品放入4℃冰箱中保存过夜，确保致病菌有效的吸附在样品上，得到人工污染样品，检测开始前要对样品中的待检致病菌浓度进行实际测试，测试方法参照现行国家食品中各种致病菌检测方法进行。
s2，制备环糊精处理样品
取25g人工污染样品中加入75ml无菌0.85％生理盐水，利用均质机进行均质处理，加入环糊精溶液，并使溶液中环糊精最终浓度为10g/100ml，继续均质处理2min，低速离心1000rpm、5min，去除大颗粒物质，所得上清液高速离心10000rpm、10min，将沉淀物溶于30ml0.01m醋酸生理盐水缓冲液，得到环糊精处理样品。
其中，每升0.01m醋酸生理盐水缓冲液中溶质为0.01mol的乙酸和0.01mol的乙酸钠，溶剂为0.85％nacl溶液，用0.1m盐酸调节ph为5.0。
s3，制备膨润土包被活性炭
将200目的活性炭用去离子清洗3次，沥干备用。向4g膨润土中加入200ml去离子水，震荡1min，700rpm离心1min，弃沉淀，将120ml含有1.52g的膨润土的上层溶液转至1升的烧杯，加入30g沥干的活性炭(湿重)，烧杯放在旋转摇床中150rpm、37℃摇床过夜(≥12h)，随后将烧杯中的溶液放置在55℃烘箱中烘干，直至膨润土包被的活性炭变干(水分含量≤1％)，得到膨润土包被活性炭。
需要说明的是，膨润土需要先进行清洗，除掉一些杂质，才能使用，我们实验证实了离心后的膨润土溶液中膨润土的含量是1.52g/120ml，所以不能直接将1.52g的膨润土加入到120ml水中，否则会影响检测结果。
s4，制备膨润土包被活性炭处理样品
取4.6g膨润土包被活性炭加入到250ml烧杯中，用20ml0.85％生理盐水清洗2次，将30ml环糊精处理样品与清洗好的膨润土包被活性炭混合，混合物在室温下160rpm旋转震荡15min；取0.2g无菌玻璃棉放至50ml无菌塑料注射器底部，将震荡后的混合物转移至装有玻璃棉的注射器内，以无菌离心管为收集容器，用醋酸生理盐水缓冲液清洗直至在无菌离心管中收集到30ml洗脱液。30ml洗脱液经10000rpm离心10min，弃去上清液保留沉淀。沉淀悬浮在0.5ml含有100μl5mg/ml牛血清白蛋白溶液中，加入100μl0.05mg/ml鲑鱼精dna溶液和300μl去离子水。
将离心管放入沸水中，沸水浴热裂解细胞10min，将得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，12000rpm离心5min，将上清液转移至干净离心管内，加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，以沉淀dna，离心管再次12000离心15min，弃去上清液，保留沉淀，加入100μl无菌去离子水溶解沉淀的dna，dna样品分装，每份10μl，得到dna模板，备用。
s5，pcr检测
针对单核细胞增生李斯特氏菌毒力基因(inlb)设计特异引物序列，优化反应条件。所述引物序列为：
inlb1：5’-aatcactttctttggagcataatggtataagtg-3’
inlb2：5’-gttccatcaacatcataacttactgtgtaaacc-3’
50μlpcr反应体系：5μl10×pcrbuffer，4μldntps混合物，0.5μl引物inlb1(40μmol/l)，0.5μl引物inlb2(40μmol/l)，0.25μl(5u/μl)taqdna聚合酶，模板1μl，ddh2o38.75μl。
pcr反应条件：94℃，4min预变性；94℃，20s变性；60℃，20s退火；72℃，50s延伸，35个循环；72℃，10min终延伸；4℃保存。
如果获得的pcr检测产物片段为279bp，则结果为阳性，阳性和阴性检测结果电泳图如图1所示。其中，m泳道为dnamaker，1号泳道为阳性检测结果，2号泳道为阴性检测结果。
需要说明的是，实施例1中使用的环糊精是β-环糊精。
我们对市场上出售的牡蛎进行实际测试，提取单核细胞增生李斯特氏菌，其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌的dna作为模版，利用本检测方法pcr反应体系来验证检测方法的特异性。
实验组s1中收集的是市售牡蛎，其余步骤均与实施例1的方法相同。以已经公开发表的单核细胞增生李斯特氏菌检测引物特异性(prfa:cccaagtagcaggacatgctaa；ggtatcacaaagctcacgag)作为对照，其余操作同实验组。同时以现行国家食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测标准方法作为对比，来验证新建立的pcr检测方法的实用性，结果见表1。
表1结果表明，实施例1采用的引物序列具有较好的特异性，只对单核细胞增生李斯特氏菌呈阳性检测结果，而对其他李斯特氏菌及非李斯特氏菌呈阴性检测结果。而另外一种prfa引物对于部分单核细胞增生李斯特氏菌呈阴性结果，部分其他李斯特氏菌检测呈阳性结果，表明该引物序列的特异性并不是很理想，存在假阴性检测结果的缺陷。现行国家食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测标准方法与实施例1的结果相同，故表1中仅以inlb特异性结果来表征。
表1检测方法的特异性
注：表1中“+”表示阳性结果，“—”表示阴性结果。
将不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌人工污染到牡蛎中，利用实施例1的检测方法进行检测，确定实施例1的检测灵敏度，结果见表2。由表2可知，实施例1的检测方法的检测灵敏度为10cfu/25g，且稳定性良好。
表2检测方法的灵敏度
注：表1中“+”表示阳性结果，“—”表示阴性结果。
采集市售新鲜牡蛎样品200份，分别采用快速检测方法和现行国家检测标准进行检测对比，用来验证该快速检测方法的实用性，结果见表3。由表3可知，实施例1的方法与现有国家标准方法的检出率、符合率和活体菌检测率均相同，但是实施例1的方法检测时间明显缩短，仅为4小时。
表3实际样品测试结果
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例1，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。