一种抗PEDV的单克隆抗体及其化学发光方法检测方法与流程

本发明属于生物监测领域，具体涉及一种抗pedv的单克隆抗体及其化学发光方法检测方法。

背景技术：

猪流行性腹泻（ped）由猪流行性腹泻病毒（pedv）引起猪只发生呕吐、腹泻、肠炎、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征。所有不同阶段的猪群均可感染，发病率可达100%，哺乳仔猪的死亡率高达90%以上。在许多养猪业发达的国家都己有此病暴发的报道,尤其是在亚洲、欧洲等地区引起了重大的经济损失。

ped首次在1971年于英国报道，随后在1978年该病在比利时和英国首次得到鉴定，我国于1984年证实该病在的存在，目前世界上大多数养猪国家都有该病的报道，尤其以韩国、日本、中国、泰国和越南等国家发病严重。自2010年秋以来,我国南方部分省份出现了严重的仔猪流行性腹泻,发病情况比先前更为凶猛，造成仔大量的哺乳仔猪发病死亡，尤其是7日龄以内的仔猪死亡率高达100%，给养殖户造成了巨大的经济损失，并已成为影响我国养猪业健康发展的重要疫病之一。由于ped与猪传染性胃肠炎(tge)在流行病学、临床症状等变化上非常相似这给该病的快速诊断与防治都带来了一定困难。另外，由于pedv具有在体外分离培养难度大的特点，在研制单克隆抗体方面大多通过原核表达病毒的某个蛋白，制备抗相应蛋白的单克隆抗体，而通过pedv疫苗弱毒株，研制出抗pedv的igg2a单克隆抗体，并利用单克隆抗体，建立化学方法检测pedv方法，未见报道。因此，本研究利用空斑纯化技术，从猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎-轮状病毒的三联弱毒疫苗中获得pedv弱毒株，作为抗原，制备pedv单克隆抗体，并建立化学发光检测技术及应用于该病的诊断，对该病的有效诊断与防控具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗pedv的单克隆抗体及其化学发光方法检测方法，主要利用空斑纯化技术，从猪流行性腹泻病毒-猪传染性胃肠炎-猪轮状病毒的三联活疫苗中纯化获得pedv弱毒，通过细胞培养、梯度离心、免疫小白鼠和制备单克隆抗体核心技术，获得抗pedv单克隆抗体杂交瘤细胞株及pedvigg2a单克隆抗体，单克隆抗体具有效价高、特异性强及稳定性好等特点。利用pedv单克隆抗体，通过包被液、单抗包被浓度等系列条件优化，建立了一种检测pedv的化学发光检测方法。该方法具有特异性强、敏感性高、一次性检测量大及稳定性好等特点,能检测到0.26ng的病毒。建立的化学发光检测方法，应用表明与rt-pcr检测技术的符合率在95%以上，与荧光定量rt-pcr检测方法符合率100%，适合对pedv的快速诊断。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用所述pedv单克隆抗体建立检测pedv的化学发光检测方法，具体包括如下步骤：

（1）抗体包被：采用磷酸盐缓冲液为包被液，以4ug/mlpedv单克隆抗体浓度包被于固相载体微孔板上，100ul/孔，37℃孵育2h或4℃过夜，洗涤3次；

（2）封闭：以2.5%bsa作为封闭液体封闭覆盖微孔板，每孔300ul/孔，4℃过夜，洗板3次；

（3）加样：依次加入样品，100ul/孔37℃温育1小时，洗板3次；

（4）加酶标二抗：加入hrp酶标记的pedv单克隆抗体，以1:4000稀释后的液体加100ul/孔，37℃45min，洗板6次；

（5）加检测底物：加入化学发光底物液thermoscientificsupersignalelisafemto底物液（购自thermofisher）100ul/孔，避光反应3分钟；

（6）检测：用发光检测仪测定发光计数。

hrp酶标记pedv单克隆抗体的方法通过常规方法标记获得。

本发明的优点在于：

所获得单克隆抗体具有特异性强，稳定性好，抗体效价高等特点（elisa和ifa效价均在10^-5），且是针对pedvm蛋白的单克隆抗体，同时pedv单克隆抗体株具有中和病毒特性，其效价为10^-3。利用pedv单克隆抗体，建立了一种检测pedv的化学发光检测方法，该方法具有特异性强（只能检测到pedv），敏感性高(能检测到0.26ng的病毒，比普通rt-pcr敏感10倍以上)、操作简单（相当于普通elisa检测方法）、一次性检测量大（一次可以检测80以上个样品）及稳定性好等特点，具有比其他检测方法无可比拟的绝对优势。应用表明与rt-pcr检测技术的符合率在95%以上，与荧光定量rt-pcr检测方法符合率100%。适合对pedv的快速诊断及科研试验。

附图说明

图1是pedv接种vero细胞导致细胞出现萎缩脱落的病变。

图2是pedv接种vero细胞的空斑形态。

图3是pedv-e1杂交瘤细胞上清ifa染色结果。

具体实施方式

本发明主要是利用空斑纯化技术，从猪流行性腹泻病毒-猪传染性胃肠炎-猪轮状病毒的三联活疫苗中纯化获得pedv弱毒，病毒通过梯度离心、免疫小白鼠和制备单克隆抗体核心技术，获得抗pedvigg2a单克隆抗体杂交瘤细胞株及相应单克隆抗体。利用单克隆抗体，通过系列条件优化，首次建立化学发光诊断技术，用于防治ped疾病。以下说明本发明制备抗pedvigg2a单克隆抗体及建立的化学发光检测方法在疫病诊断防控中应用，选用理由及其具体操作方法：

实施例1

（一）纯化培养ped病毒

利用空斑纯化技术，通过vero细胞从猪流行性腹泻-猪传染性胃肠炎-轮状病毒的三联弱毒疫苗中，纯化获得pedv毒株。该病毒能致vero细胞出现典型的病理变化（见附图1），病毒效价达10^-7.5/0.1ml,为制备pedv单克隆抗体奠定基础。其空斑纯化步骤如下：

1、用dmem冲洗长满单层vero细胞的6孔板3遍；加入400μl倍比稀释（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7）的病毒液，并设置阴性对照加入400μldmem，37℃孵育45min，每15min摇匀以充分接触；孵育后吸出病毒液，用dmem冲洗3遍，每孔加入4ml低熔点琼脂混合液（2.0%低熔点琼脂与2×dmem等比例混合，并加入1.5%的fbs）；待其凝固后，37℃恒温箱中倒置培养4-6d，注意观察；空斑随时间而慢慢变大，我们发现病毒在10^-6稀释度时，其空斑形态最容易观察和辨别，随后弃覆盖琼脂，用0.5%结晶紫染色后，可以清晰的看到典型的pedv空斑(附图2)。

2、挑取合适的空斑于400μldmem（无血清）中，冻融4次，将病毒液进行5轮的空斑纯化。待空斑长置合适大小的时候，弃覆盖琼脂，用10%甲醛固定20min，0.5%结晶紫染液染色10min，pbs冲洗3遍，观察并记录空斑形态。

3、将5轮纯化过的病毒液于vero细胞中扩大培养，收集病毒液进行pcr鉴定，确定病毒液是否存在其他嗜细胞系病毒。结果表明纯化的病毒液中猪传染性胃肠炎和轮状病毒等其他嗜细胞系病毒检测为阴性，而pedv检测为阳性。说明试验获得单一pedv毒株。

(二)制备pedvigg2a单克隆抗体

1、ped抗原制备

将pedv接种于vero细胞单层，培养2～3d，当细胞病变达85%以上时，收获细胞毒。细胞毒经超声裂解，10000r·min^-1离心60min，取上清液，45000r·min^-1离心180min，用0.01mol·l^-1pbs（ph7.2）悬浮沉淀，即为粗提病毒；取粗提抗原铺依次垫于30%-60%蔗糖-pbs，33000r·min^-1离心150min，收集30-40%病毒目的条带，重悬于pbs中，45000r·min^-1离心180min洗脱蔗糖，沉淀重悬于pbs中即为纯化的病毒抗原，经w-b和rt-pcr鉴定为pedv后，测定蛋白浓度为4mg/ml，用于免疫balb/c小鼠。

2、免疫balb/c小鼠

采用常规免疫方法进行长程免疫。将取纯化病毒抗原(1mg/ml)与等体积弗氏完全佐剂乳化后，皮下多点注射6周龄babl/c鼠，0.2ml/只。初次免疫后第14天、28天和第42天，取抗原与弗氏不完全佐剂等量混匀乳化，进行二免、三免及四免，当血清elisa抗体效价达1:10000以上时，于融合前3天取纯化抗原经尾静脉加强免疫，100μg/只。

3、细胞融合

即无菌取免疫小鼠脾脏，分散脾淋巴细胞，1000rpm离心10min，将细胞疏松后加nh4cl，冰浴10min，同上离心，疏松、重悬于10mldmem，收集sp2/o细胞，进行脾细胞和sp2/o细胞计数，取脾细胞和sp2/o细胞按6:1的比例混合，1200r·min^-1离心5min，疏松后1min内缓缓加入1ml37℃预热的peg进行细胞融合，捻转5min，缓慢加入dmem，同上离心，疏松细胞后，重悬杂交瘤细胞于含20%牛血清的hat-dmem培养基中，调节脾细胞数量，加到96孔细胞培养板，0.1ml/孔，置37℃，5％co2培养箱中培养，第5天补加0.1ml含15%牛血清的ht-dmem，每天观察生长情况，待细胞长至孔底的1/3，或培养液变黄时，上清进行抗体检测。

4、pedv间接elisa方法的建立

pedv抗原用ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释，包被于elisa板条，100µl/孔，置37℃2h，0.01mpbst洗涤液洗涤3次后，以1.5％bsa-pbst封闭，300µl/孔，37℃2h，同上洗涤，加入杂交瘤细胞培养上清液，100µl/孔，37℃反应1h，同上洗涤后加1:40000稀释的羊抗鼠igg辣根过氧化物酶，100µl/孔，37℃反应1h，同上洗涤后，加入opd，100µl/孔，37℃避光显色15min，2mol／lh2so4终止反应，在自动酶联检测仪上测定各孔的od490值，以p:n≥2.1时，判断为杂交瘤细胞分泌抗体阳性。经方阵滴定法测定，当抗原包被浓度为2.5μg/0.1ml/孔，血清稀释度为1:2000或抗原包被浓度为3.5μg/0.1ml/孔，血清稀释度为1:4000时，阳性血清od490值均达1.0，阴性血清的od490值较小，od490值均在0.08以下，p/n值达15以上，确定最佳抗原包被浓度为2.5-3.5μg/0.1ml/孔。

5、筛选阳性杂交瘤细胞株

用间接elisa筛选杂交瘤细胞生长孔特异性抗体，从检出的阳性孔中，挑选od值高、细胞形态好生长旺盛且不与正常细胞培养物交叉的阳性孔，通过饲养细胞培养，进行有限稀释法克隆。经多次有限稀释后，获得1株能稳定分泌抗pedv抗体的杂交瘤细胞株，命名为pedv-e1。这株细胞在体外连续培3个月，能稳定分泌抗体，经液氮冻存、复苏后，细胞生长良好，且上清液抗体效价不变。

6、腹水制备

6.1babl/c小鼠诱导

8周龄balb/c小鼠腹腔注射灭菌的液体石蜡进行诱导，分笼饲养8天。取对数生长期的杂交瘤细胞，经1500r/min离心5min沉淀细胞，用不含血清的dmem约1ml重悬，腹腔注射石蜡诱导的babl/c鼠，每只小鼠注射1×10⁶杂交瘤细胞。

6.2收集腹水

小鼠注射杂交瘤细胞约10天后观察小鼠腹部，有产生腹水的小鼠腹部会明显膨大。此时采用引流收集腹水，1000r/min，离心15min，收集上层淡黄色腹水，采用thermo公司生产的nabtmspinkits试剂盒进行纯化，测定elisa效价和间接免疫荧光试验（ifa）效价，做好标记，冻于-20℃备用。

6.3pedv感染细胞的制备及免疫荧光试验(ifa)

将pedv接种于已长成单层的vero96孔细胞板，37℃5%co2培养至30%细胞出现病变时，弃上清，pbs洗涤1次，每孔加入预冷甲醇100μl，4℃固定30min，弃甲醇，pbs洗涤1次，凉干后，-30℃冻存备用。同样处理不接毒的vero细胞用于阴性对照。ifa检测时，于上述细胞板中每孔加入30ul杂交瘤细胞培养上清液于37℃作用30min，用0.85%生理盐水洗涤3次，每次5分钟，甩干，加羊抗鼠igg-fitc每孔30ul，37℃作用30分钟，洗涤同上，甩干，加50%pbs—甘油，每孔30ul，于倒置荧光显微镜下观察ifa染色结果,具有荧光反应（见附图3）。

7、单抗特性分析

7.1单抗亚级份的测定

按照单克隆抗体分型试剂盒介绍的方法进行。经过抗体亚型试剂盒鉴定，单抗在亚类鉴定中pedv-e1株属于igg2a。

7.2细胞株稳定性试验

将具有分泌特性的杂交瘤细胞体外连续培养2个月，每15天检测其上清液的抗体效价稳定；将液氮冻存的阳性杂交瘤细胞每个月复苏一次，连续3个月，测定上清抗体效价基本不变。

7.3单抗特异性的测定

单抗只能识别pedv；间接免疫荧光试验（ifa）结果表明：单抗都不与vero细胞、prrsv、prv、pcv2和scfv发生反应，说明单抗的特异性好。

7.4单抗elisa效价及单抗ifa价测定

应用间接elisa检测杂交瘤培养上清液和ifa腹水抗体的效价，杂交瘤细胞上清液用抗体稀释液稀释成2^-1～2^-10，腹水用抗体稀释液按10倍稀释成10^-2～10^-8。结果elisa效价pedv-e1株单抗的培养上清液为2^-5，腹水抗体效价为10^-5，ifa效价为10^-5。

8westernblot试验

以pedv抗原进行sds-page电泳。转印至nc膜用tbs-t封闭，4℃过夜，tbs-t洗膜3次，加1:100倍稀释的腹水单克隆抗体，37℃作用2h，洗涤，加入羊抗鼠igg碱性磷酸酶标记抗体(1:10000)，室温反应2h，同上洗涤，置于底物显色，结果表明pedv-e1是针对m蛋白的单克隆抗体。

(三)建立pedv化学发光检测方法

1、化学发光的工作流程

本实验采用酶促化学发光免疫检测的方法，以pedv单克隆抗体作为包被抗体、以hrp标记的pedv单克隆抗体为标记抗体。具体工作流程如下：（1）包被：将pedv单克隆抗体包被于固相载体微孔板上,100ul/孔，37℃孵育2h或4℃过夜，洗涤3次；（2）封闭：覆盖微孔板每孔加入2.5%bsa进行封闭，300ul/孔，4℃过夜，洗板3次;（3）加样：依次加入样品100ul/孔，浓度为80ug/ml（s5），37℃温育1h，洗板3次；（4）加二抗：hrp酶标记的pedv单克隆抗体（以1:4000稀释后的液体）100ul/孔，37℃40min，洗板6次；（5）加检测底物：加入化学发光检测thermoscientificsupersignalelisafemto底物液购自thermofisher）100ul/孔，避光反应3分钟；(6)检测：用发光检测仪测定发光计数。

2、化学发光工作条件的优化

2.1包被液的选择

按化学发光工作流程，选择3种缓冲液，第一种为5%bsa磷酸盐缓冲液，第2种为磷酸盐缓冲液，第三种为碳酸盐缓冲液。稀释包被单克隆抗体，其它条件不变，根据单克隆抗体包被浓度80ug（s5）/0ug(s0)的值确定最佳包被液。结果以磷酸盐缓冲液为包被缓冲液时，其s0点的发光值明显低于其他包被液，且s5/s0的值明显高于其他包被缓冲液，因此，选择磷酸盐缓冲液作为包被缓冲液。见下表1

表1不同包被缓冲液的s0、s5的发光值及s5/s0的值

2.2封闭液的选择

按化学发光的工作流程，封闭液分别为2.5%bsa和5%bsa,2.5%明胶和5%明胶300ul/孔，其他2条件不变，根据实验结果和s5/s0的值确定最佳稀释液。结果以2.5%bsa磷酸盐缓冲液作为稀释液时，且s5/s0的值明显高于其他组，因此，选择2.5%bsa磷酸盐缓冲液作为封闭液。见下表2。

表2不同封闭液的s0、s5的发光值及s5/s0的值

2.3包被抗体浓度的选择

按化学发光的工作流程，包被液将单抗分别稀释为1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml，8ug/ml孔，其他条件不变，根据s5/s0的值确定最佳包被浓度。结果以4ug/ml作为单克隆抗体包被浓度时，其s0点的发光值明显低于其他，且s5/s0的值明显高于其他组，因此，选择单克隆抗体包被浓度为4ug/ml。见下表3。

表3不同单克隆抗体包被浓度s0、s5的发光值及s5/s0的值

2.4酶标抗体工作浓度的选择

按化学发光工作流程，将辣根过氧化物酶标的单抗分别以1:2000、1:4000和1:6000倍稀释，其他条件不变，根据根据s5/s0的值确定最佳酶标记单抗的稀释浓度。结果以酶标记单克隆抗体的浓度为1:4000时，其s0点的发光值明显低于其他，s5/s0的值也较高，因此，选择酶标记单克隆抗体的浓度为1:4000。见下表4。

表4不同酶标记单克隆抗体的浓度s0、s5的发光值及s5/s0的值

2.5酶标记单抗最佳工作时间的选择

按化学发光的工作流程，根据上述确定的最佳工作条件，分别反应30min、45min和60min，其他条件不变，根据s5/s0的值确定酶标记单抗的最佳工作时间。结果以酶标记单克隆抗体的工作时间为45min，且s5/s0的值明显高于其他组，因此，选择酶标记单克隆抗体的工作时间45min,见下表5。

表5不同酶标记单克隆抗体的工作时间s0、s5的发光值及s5/s0的值

2.6化学发光反应体系及条件的确定

经过以上一系列条件的优化，确立了化学发光最佳反应体系及反应条件：采用磷酸盐缓冲液为稀释液体，以4ug/mlpedv单克隆抗体浓度包被于固相载体微孔板上100ul/孔，37℃孵育2h或4℃过夜，洗涤3次；封闭：以2.5%bsa作为封闭液体封闭覆盖微孔板，300ul/孔，4℃过夜,洗板3次;加样：依次加入样品，100ul/孔37℃温育1h,洗板3次；加二抗：hrp酶标记的pedv单克隆抗体（以1:4000稀释后的液体）100ul/孔，37℃45min，洗板6次；

(5）加检测底物：加入化学发光检测thermoscientificsupersignalelisafemto底物液

（购自thermofisher）100ul/孔，避光反应3min；(6)检测：用发光检测仪测定发光计数。

3、化学发光检测方法特异性、敏感性及重复性的测定

3.1特异性的测定

根据建立的化学发光检测方法，分别采用猪流行性腹泻病毒（pedv）、猪瘟病毒(scfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪传染性胃肠病毒(tegv)及猪轮状病毒(rv)为被检测样品，测定方法的特异性。结果只有pedv检测到强的化学发光值421975,为阳性，其他病毒检测为阴性，说明建立的化学发光方法具有很好的特异性。见下表6。

表6特异性测定

注：+表示阳性，表示-阴性

3.2敏感性的测定

根据建立的化学发光检测方法，将pedv进行1:10、1:100、1:1000、1:10000依次倍比稀释，测定检测方法的敏感性。结果该方法能检测到2.6ng的病毒含量，说明方法具有较好的灵敏性。见下表7。

表7敏感性测定

+表示阳性，表示-阴性

3.3重复性的测定

根据建立的化学发光检测方法，将pedv样品进行5次重复，测定检测方法的重复性。结果化学发光强度基本一致，说明方法具有良好的重复性，见下表8。

表8重复性测定

注：+表示阳性，表示-阴性

4、化学发光方法的临床初步应用

通过检测56份疑似病料进行检测，并与常规rt-pcr检测技术进行比较，符合率在95%以上，与荧光定量rt-pcr检测技术进行比较，符合率为100%，说明建立的pedv化学方法检测方法，适合对pedv的快速诊断，能为ped的快速诊断提供了良好的技术支撑。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。