一种长波长型H2S荧光探针及其合成方法和应用与流程

本发明涉及一种基于四氢喹喔啉并吡喃酮类衍生物长波长识别h2s荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术：

众所周知，硫化氢(h2s)是一种有毒的、具有臭鸡蛋气味的气体，其主要来自火山喷发和哺乳动物细胞自身通过胱硫醚-β-合成酶(cbs)，胱硫醚-γ-裂解酶(cse)，3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mst)等酶的作用产生的。硫化氢是一种气体信号分子，由于其在生理和病理过程中的多重作用，近年来成为生物领域的研究热点。以往的研究表明，内源性h2s可影响心血管、神经、免疫、内分泌、消化系统等，其抗氧化、抗凋亡信号传导的影响也表现为诱导的心力衰竭，过量硫化氢缺血治疗会刺激眼睛和呼吸道，造成严重的意识丧失，呼吸衰竭，甚至死亡。

鉴于h2s的生物学重要性，科学家们需要精确的方法来检测硫化氢，目前最常见的经典方法包括亚甲蓝法、比色法、电化学法和气相色谱法。与传统方法相比，荧光分析技术以其成本低、操作简单、灵敏度高、实时无损生物成像等优点受到人们的广泛关注。

近年来，基于识别h2s荧光探针分子的设计多集中于利用亲核取代反应，还原反应和选择性结合铜等。例如，xian等利用亲核取代反应设计合成了一种识别h2s的荧光探针(angewandtechemieinternationaledition,2011,50,10327)；范方禄等通过h2s对叠氮基的还原合成了一种苯并噻唑类荧光增强型硫化氢探针(有机化学,2014,34,2178)；zeng等利用s^2-与cu²⁺的强亲和力，设计合成了一种铜配合物识别h2s的荧光探针(inorganicchemistry,2012,51,2454)。这些文献虽然能专一识别硫化氢，但报道的荧光探针仍有一定的局限性，如复杂的合成路线，较短的发射波长，响应时间过长等，因此，设计和合成更优良的h2s荧光探针具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种识别h2s荧光探针及其合成方法和应用，该荧光探针具有较长的发射波长，响应时间较短，可在水介质中和细胞中对h2s实现识别，具有特异选择性和灵敏性。

本发明的技术方案是：

一种识别h2s荧光探针,该荧光探针l是基于四氢喹喔啉并吡喃酮类衍生物，结构式如下：

一种识别h2s荧光探针的合成方法，其具体步骤如下：

(1)以乙醇为溶剂，原料1,4-二乙基-1,2,3,4-四氢-7-羟基喹喔啉-6-醛和乙酰乙酸乙酯按照摩尔比1:1～1:3进行投料，并加入0.2ml哌啶，加热回流反应，回流反应时间为4h～8h，然后加入稀盐酸，60℃条件下搅拌30分钟，反应结束后用二氯甲烷萃取，干燥，旋出溶剂得到粗产物，用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂进行分离，得到化合物2

(2)将得到的化合物2、对羟基苯甲醛、哌啶按照摩尔比1:(1～5)：(0.1～2)进行投料，溶解于甲苯中，加热回流反应4h～10h，然后加入稀盐酸，60℃条件下搅拌30分钟，反应结束后用二氯甲烷萃取，干燥，旋出溶剂得到的粗产物用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂进行分离，得到化合物1

(3)以dmf为溶剂，将化合物1、2,4-二硝基氟苯、碳酸钾按照摩尔比1:(1～3)：(1～5)进行投料，室温下搅拌3小时，反应结束后过滤，得到粗产物，用硅胶柱色谱法进行纯化，用乙酸乙酯和石油醚作为洗脱剂进行分离，得到荧光探针l

所述乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:1～1:10。

一种识别h2s荧光探针的应用，在ph＝3～12、体积比为6:4的四氢呋喃(thf)与tris缓冲溶液中对h2s进行检测。

一种识别h2s荧光探针的应用，在mcf-7细胞中对h2s进行检测。

本发明所提供的基于四氢喹喔啉并吡喃酮类衍生物的合成路线如下：

本发明的荧光分子探针使用方法没有特殊限制，通常将探针分子溶解含60％四氢呋喃的水中，室温下进行测试。本发明的荧光分子探针对h2s的检测原理如下式所示：

当加入h2s时，由于h2s可以使2,4-二硝基苯保护的羟基脱去保护，生成具有荧光的化合物分子1，从而使探针的荧光增强。

本发明的有益效果：

(1)合成荧光探针分离提纯过程容易；荧光探针可以在水介质中长波长(650nm)荧光增强识别h2s，具有高度的选择性和良好的灵敏度，并可应用到细胞中检测h2s。

(2)以1,4-二乙基-1,2,3,4-四氢-7-羟基喹喔啉-6-醛为底物，通过分子改造制备出基于四氢喹喔啉并吡喃酮类衍生物，进而增大分子共轭程度，引入2,4-二硝基氟苯作为反应位点，利用硫化氢与探针l的亲核取代反应，进而荧光增强识别h2s，检测限达到7.3×10^-7mol/l。

附图说明

图1是本发明荧光探针l的¹hnmr谱图。

图2是本发明荧光探针l的¹³cnmr谱图。

图3是本发明荧光探针l的质谱图。

图4是本发明荧光探针l与f^-，cl^-，br^-，i^-，no2^-，co3^2-，hco3^-，ch3coo^-，hpo4^2-，h2po4^-，po4^3-，cn^-，scn^-，hs^-，ppi，clo^-，so4^2-，so3^2-，hso3^-，hso4^-，n3^-，s2o3^2-，hcy，gsh，cys作用前后的荧光发射光谱图。

图5是本发明荧光探针l对h2s识别抗其它阴离子干扰的荧光检测图。

图6是本发明荧光探针l与不同倍数h2s作用前后的荧光发射光谱变化图。

图7是本发明荧光探针l的检测限图。

图8是本发明荧光探针l识别h2s时间响应图。

图9是本发明荧光探针l对mcf-7细胞的毒性。

图10是本发明荧光探针l在mcf-7细胞中与不同浓度h2s作用后荧光强度变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1：化合物2的具体合成步骤如下：

化合物1,4-二乙基-1,2,3,4-四氢-7-羟基喹喔啉-6-醛(468mg，2mmol)，乙酰乙酸乙酯(260mg，2mmol)和哌啶0.1ml溶于乙醇回流4小时，然后将溶液倒进盐酸(4mol/l，10ml)，在60℃搅拌30分钟，将溶液与水混合后，用乙酸乙酯萃取(3×80ml)，用无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱色谱纯化，利用ea：pe＝1：5(v/v)做洗脱剂，分离得到420.5mg化合物2，产率为70％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.38(s,1h),6.48(s,1h),6.39(s,1h),3.59-3.52(m,2h),3.42(q,j＝7.1hz,2h),3.32(q,j＝7.1hz,2h),3.26-3.20(m,2h),2.67(s,3h),1.20(dt,j＝15.9,7.1hz,6h)。

实施例2：化合物1的具体合成步骤如下：

化合物2(300.4mg，1mmol)，对羟基苯甲醛(134.2mg，1.1mmol)，和哌啶(0.1mmol)溶于甲苯回流4h，然后加入盐酸(4mol/l，15ml)，在40℃下搅拌50分钟，将溶液中加水，再用乙酸乙酯(3×100ml)萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱色谱纯化，利用ea：pe＝1：2(v/v)做洗脱剂，分离得到179.8mg化合物1，产率为44％。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.01(s,1h),8.48(s,1h),7.82(d,j＝15.7hz,1h),7.56(d,j＝15.7hz,1h),7.51(d,j＝8.2hz,2h),6.76-6.83(m,3h),6.51(s,1h),3.51(t,j＝5.1hz,2h),3.45(q,j＝7.1hz,2h),3.27(d,j＝7.1hz,2h),3.15(t,j＝5.1hz,2h),1.08(dt,j＝13.2,5.1hz,6h)。

实施例3：荧光探针l的具体合成步骤如下：

化合物1(404.5mg，0.5mmol)，2,4-二硝基氟苯(186mg，1.0mmol)，钾碳酸(187mg，1.35mmol)，溶解在dmf(5ml)中搅拌，在室温条件下反应3h。反应结束后加水淬灭，用乙酸乙酯萃取(3×100ml)，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂即得到粗产物，粗产物经硅胶柱色谱纯化，利用pe：pe＝1：10(v/v)做洗脱剂，得到285.3mg探针l，产率50％。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.92(s,1h),8.55(s,1h),8.46(s,1h),7.69-8.06(m,4h),7.29-7.34(m,3h),6.88(s,1h),6.57(s,1h),3.21-3.56(m,8h),1.13-1.21(m,6h).¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ185.77,162.73,160.79,155.52,154.79,153.65,148.08,144.30,142.17,140.45,140.04,133.46,132.76,131.11,130.12,126.24,122.38,121.09,120.38,114.75,109.10,108.14,95.08,47.59,46.03,45.05,44.06,10.89,9.62.hrms(esi⁺)calcdforc30h27n4o8[m+h]⁺:571.1751,found:571.2986。

荧光探针l对h2s选择性的检测：

10μmol/l荧光探针l的thf:tris＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液，向其中分别加入40μl(50mmol/l)阴离子(f^-，cl^-，br^-，i^-，no2^-，co3^2-，hco3^-，ch3coo^-，hpo4^2-，h2po4^-，po4^3-，cn^-，scn^-，hs^-，ppi，clo^-，so4^2-，so3^2-，hso3^-，hso4^-，n3^-，s2o3^2-，hcy，gsh，cys)，检测溶液的荧光发射光谱变化，如图4所示。从图4中可以看出，当加入阴离子时，只有hs^-可以引起荧光强度显著变化，即加入hs^-后650nm处的荧光强度原位增强，而其他阴离子的加入对荧光强度没有明显影响，由此可知，荧光探针l对h2s有高度的选择性。

荧光探针l识别h2s的抗干扰检测：

10μmol/l荧光探针l的thf:tris＝6:4(v/v,ph＝7.4)溶液，向其中分别加入40μl(50mmol/l)25种阴离子(f^-，cl^-，br^-，i^-，no2^-，co3^2-，hco3^-，ch3coo^-，hpo4^2-，h2po4^-，po4^3-，cn^-，scn^-，hs^-，ppi，clo^-，so4^2-，so3^2-，hso3^-，hso4^-，n3^-，s2o3^2-，hcy，gsh，cys)，检测溶液的荧光发射光谱,然后向以上各个含有阴离子的溶液中再分别加入40μl(50mmol/l)的hs^-，检测溶液的荧光发射光谱,取最大发射波长所对应的值作图，如图5所示。由图5可知，即使有其它阴离子存在时，hs^-也能导致探针l荧光增强，说明荧光探针l只对h2s有识别，不受其它阴离子的干扰。

荧光探针l对h2s的滴定测试：

10μmol/l的荧光探针l的thf:tris＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液，分别加入0～100倍(50mmol/l)的hs^-，检测溶液的荧光发射光谱变化如图6所示。从图6中可以看出，随着hs^-不断加入，在650nm处的荧光强度逐渐升高，当加入100倍的hs^-时，在650nm处的荧光强度不再升高，说明此时达到了饱和。

荧光探针l对h2s的检测限测试：

在探针l的thf:tris＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液中，测试了不少于11个平行样的荧光强度，根据公式∑(xi-x)²＝(x1-x)²+(x2-x)²+……+(xn-x)²求出平方差的总和(xi为每次测量受体本身荧光强度值，x为荧光强度平均值，n为测试次数，n大于等于11)，然后根据公式s＝[∑(xi-x)²/(n-1)]^0.5求出s，再根据检测限公式3s/k，k为所选直线部分的斜率(注：直线是根据滴定做点图，横坐标为离子浓度，纵坐标为荧光强度)，求出检测线为7.3×10^-7mol/l(见图7)，达到了0.1微摩尔级，这说明该探针有较低的检测限，可检测含量较低浓度的h2s，具有较高的灵敏度，有一定的实际应用价值。

荧光探针l对h2s的响应时间测试：

在探针l的thf:tris＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液中，加入100倍hs^-后测试不同时间的荧光强度变化，从图8中可以看出，随着时间延长探针荧光强度逐渐增强，在20分钟左右达到最高值并呈稳定趋势，说明探针l对h2s的识别在20分钟内即可完成，具有快速响应的能力。

荧光探针l在细胞中检测h2s：

我们用mtt法检测探针l对mcf-7细胞的毒性，把10μm探针l与mcf-7细胞培养24h，发现没有对细胞的增殖产生明显的抑制作用(见图9)，即本发明设计合成的探针无细胞毒性，适于生物学研究。随后用mcf-7细胞进行活细胞成像实验，将mcf-7细胞与探针l(2μm)在37℃培养30分钟，然后mcf-7细胞用磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗三次，再加入hs^-(1，5，10，20，50μm)培养30分钟，观察红色荧光亮度随hs^-浓度增加而增强(见图10)，这些结果表明探针l具有良好的细胞渗透性，能够检测mcf-7细胞中的h2s。

以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。