一种游离DNA保存液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及游离dna保存领域，具体的涉及一种游离dna保存液及其制备方法和应用。
背景技术：
：细胞凋亡或坏死后，细胞内部的dna释放入体液形成游离dna(cfdna)。而癌症患者的cfdna中含有的肿瘤循环dna(ctdna)与肿瘤的发生发展过程紧密相关。游离dna与肿瘤组织的基因突变一致，遗传信息丰富；与肿瘤负荷正相关，检测灵敏度高；对疾病的发展最早做出反应；半衰期短(<1.5h)，可实现实时监测。因此，游离dna作为重要的肿瘤特异性标志物，完整获取和保存则对癌症早筛、阶段用药指导及预后等方面应用提供前提与基础。现有技术中，游离dna保存常采用血液样本，必需经专业医师操作、过程繁复、且耗费时间；样本成分复杂而保存提取难度较大；游离dna片段分布范围在35～1500bp，而肿瘤游离dna片段多集中在100～300bp，片段小易丢失而失去遗传信息的完整性；游离细胞不稳定破碎后释放的细胞内dna造成游离dna的污染，导致检测结果失真；样本中dnase丰富使得游离dna降解快速而难于保存；游离dna保存通常需要低温条件的冷链运输，成本较高。技术实现要素：本发明旨在解决上面描述的问题。本发明的目的是提供一种游离dna保存液，主要应用于人体尿液、组织液游离dna的保存。相对于传统的抽血采集的方式来说，尿液样本的采集过程完全无创、操作简便、成本低、易接受，能最大限度的扩大基因疾病筛查或诊断的取样范围。组织液主要指的是腹水及胸水，两者样本通过微创手术即可获得，游离dna较血浆丰富度更高、含量更多，且可连续收集、动态监测肿瘤随时间的遗传学变异过程，并最终用于临床治疗和诊断。同时本发明的保存液，dna片段保存完整度高，可室温实现中长期保存；可最大程度避免样本稀释，最终降低样本采集、保存、运输成本。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种游离dna保存液，包括以下组分，以100ml计，所述各组分的含量为：其中，包括以下组分，以100ml计，所述各组分的含量为：其中，包括以下组分，以100ml计，所述各组分的含量为：其中，包括以下组分，以100ml计，所述各组分的含量为：其中，所述游离dna保存液的ph值范围为5.5～7.0。其中，所述ph稳定剂可以是tris-hcl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。其中，所述游离dna保存液与保存样品的比例为1:20～1:10。根据本发明的另一方面，提供一种游离dna保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将预定含量的乙二胺四乙酸二钠、ph稳定剂、咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，60～65℃水浴25～35min；溶解后，添加预定含量的tritonx-100，最后添加去离子水定容至100ml，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离dna保存液。其中，包括以下步骤：将预定含量的乙二胺四乙酸二钠、ph稳定剂、咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，65℃水浴30min；溶解后，添加预定含量的tritonx-100，最后添加去离子水定容至100ml，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离dna保存液。根据本发明的第三个方面，提供游离dna保存液在保存尿液、组织液游离dna上的应用。人体尿液、组织液样本中的游离dna极不稳定，游离细胞破碎后细胞内成分的污染、细菌污染、dnase的催化降解、ph变化均会影响样本中游离dna的稳定；样本中酮体、蛋白等成分也会对游离dna造成干扰。本发明的游离dna保存液中的咪唑烷基脲作为甲醛缓释剂可以稳定细胞膜，避免样本细胞内dna释放到细胞外，污染游离dna；同时咪唑烷基脲作为广谱抑菌剂可以高效抑制细菌繁殖；是稳定样本游离dna的主要作用试剂。咪唑烷基脲缓释的甲醛作为交联剂/固定剂，一方面可以稳定样本的细胞、蛋白、dna，但是如果过量有可能引起dna质量降低。甘氨酸可以在常温下与咪唑烷基脲缓释出的过剩甲醛结合，生成羟甲基衍生物。研究过程中发现，对于成分简单的尿液、腹水、胸水样本，例如健康人的尿液样本，添加0～2.7g的甘氨酸可以与组分含量为8～32g的咪唑烷基脲缓释的过剩甲醛结合，使得样本中的游离dna可以很好地保存。然而对于成分复杂的样本，例如孕妇、病患，在实验过程中发现，仅需低浓度甘氨酸辅助稳定ph或不需要添加。dnase作为降解样本游离dna的重要因素，主要有dnasei、ii、iii三种。其中，dnasei存在于细胞外，最佳ph为7.1，依赖金属离子催化作用；dnaseii存在于溶酶体中，通过内吞作用降解dna，降解dna不依赖金属离子，最适ph值为4.5～5.5；dnaseiii定位于细胞核中，其催化dna降解不依赖金属离子，最适ph值为8.5。在本发明的游离dna保存液中添加0.005～0.036mol的乙二胺四乙酸二钠作为金属离子螯合剂可以络合金属离子从而抑制dnasei作用。本发明的游离dna保存液中的ph稳定剂的含量在0～0.005mol；可以使保存样本的ph稳定在5.5～7.0，可以抑制dnaseii、dnaseiii降解dna的活性，同时稳定样本在正常ph范围内，保证样本中各成分的稳定。ph稳定剂可以是tris-hcl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液等缓冲试剂。同时，甘氨酸也可以作为ph缓冲物质与ph稳定剂共同作用，维持样本ph与各成分的稳定。本发明中的乙二胺四乙酸二钠与ph稳定剂的含量均指的是干物质含量。在保存液配制过程中，使用的是乙二胺四乙酸二钠溶液或tris-hcl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。本发明中所包含的去离子水的含量为乙二胺四乙酸二钠溶液和缓冲液的去离子水的含量以及最后定容所加入的去离子水的总和。本发明的游离dna保存液还添加了50～100μl含量范围的tritonx-100，该含量范围的tritonx-100可以破坏dnasei表面的亲水层，降低dna酶的活性，从而在室温稳定样本游离dna。由于保存液中的各组分在样本中尤其在复杂样本中会产生一系列复杂反应，各组分协同作用的结果往往不能预知。所以本发明中咪唑烷基脲、乙二胺四乙酸二钠、ph稳定剂、tritonx-100、甘氨酸的比例范围是经过大量试验而获得的；并且针对复杂的样本得到了各组分的优选比例范围。从而使得本发明的保存液可以中长期保存样本中的游离dna，适用样本范围广且保存效果稳定；并且可以保证游离dna的完整度，避免游离dna被细胞内dna污染而干扰检测结果。将预定含量的乙二胺四乙酸二钠、ph稳定剂、咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，60～65℃水浴25～35min；优选的，65℃水浴30min；溶解后，添加预定含量的tritonx-100，最后添加去离子水定容至100ml，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离dna保存液。本游离dna保存液与保存样品的比例为1:20～1:10。在该比例范围内，样本中的游离dna的具有很好的保存效果。本游离dna保存液的应用到人体尿液、腹水、胸水游离dna的保存，可以制成保存试剂盒，包括：存放有该游离dna保存液的保存管、生物安全袋、说明书、个人信息卡、编号条形码、回寄快递单，组装成游离dna保存试剂盒；样本保存管为优质无菌、无dnase、无rnase和热源的15ml/50ml塑料尖底离心管，内含约0.1倍样本体积的保存液；采集保存样本直接转移到保存管中，密闭混匀即可室温保存，快递单直接到付室温转运，客户编号条形码方便后期样本数据分析处理。与已有技术相比，本发明有益效果体现在：1、本发明可高效抑制人体尿液、组织液样本中的dnase避免游离dna被降解。2、本发明保存液室温条件下可稳定保存尿液、组织液游离dna至少2周。3、本发明可稳定尿液样本中的细胞，保证细胞膜的完整性，避免游离dna被细胞内dna污染而干扰检测结果，且蛋白尿、血尿等病理尿液样本的游离dna亦可完整保存。4、本发明制备方法简单，不含有毒试剂，无需特殊处理。5、成本低、适合工业化生产。参照附图来阅读对于实施例的以下描述，本发明的其他特性特征和优点将变得清晰。附图说明并入到说明书中并且构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且与描述一起用于解释本发明的原理，在这些附图中，类似的附图标记用于表示类似的要素，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，而不是全部实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据这些附图获得其他的附图。图1示出了本发明的游离dna保存液对普通健康人尿液样本对比实验的凝胶电泳检测图；图2示出了本发明的游离dna保存液对健康孕妇尿液样本对比实验的凝胶电泳检测图；图3示出了本发明的游离dna保存液与对照组保存0d(2h)、8d、14d的凝胶电泳检测图；图4示出了本发明的游离dna保存液与对照组保存0d(2h)、8d、14d时条带的光密度分布图；图5示出了本发明的游离dna保存液实验组、对照组尿液游离dna样本在4℃、37℃保存14天的凝胶电泳检测图；图6示出了本发明的游离dna保存液实验组、对照组尿液游离dna样本在4℃、37℃保存14天条带的光密度分布图；图7示出了本发明的游离dna保存液多尿液游离dna样本保存14天的凝胶电泳检测图；图8示出了本发明的游离dna保存液不同稀释比例保存效果图；图9示出了本发明的游离dna保存液与不同配方保存液对尿液游离dna保存0d、+3d、+8d、+14d的凝胶电泳检测图；图10示出了本发明的游离dna保存液与不同配方保存液对500bp游离dna随时间变化的保存效果；图11示出了本发明的游离dna保存液与不同配方保存液对200bp游离dna随时间变化的保存效果；图12示出了本发明的游离dna保存液与不同配方保存液对100bp游离dna随时间变化的保存效果。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。本发明提供一种游离dna保存液，包括以下组分，以100ml计，各组分的含量为：咪唑烷基脲8～32g；乙二胺四乙酸二钠0.005～0.036mol；甘氨酸0～2.7g；tritonx-10050～100μl；ph稳定剂0～0.005mol；去离子水70～85ml。优选的，各组分的含量为：咪唑烷基脲15～32g；乙二胺四乙酸二钠0.02～0.036mol；甘氨酸0～2.7g；tritonx-10050～100μl；ph稳定剂0～0.005mol；去离子水70～83ml。进一步优选的，各组分的含量为：咪唑烷基脲30g；乙二胺四乙酸二钠0.02～0.036mol；tritonx-10050μl；ph稳定剂0.005mol；去离子水75～80ml。或咪唑烷基脲30g；乙二胺四乙酸二钠0.02mol；甘氨酸0.25g；tritonx-10050μl；ph稳定剂0.005mol；去离子水76ml。本发明还提供了游离dna保存液的制备方法，包括以下步骤：将预定含量的乙二胺四乙酸二钠、ph稳定剂、咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，60～65℃水浴25～35min，优选的，65℃水浴30min；溶解后添加预定含量的tritonx-100，最后添加去离子水定容至100ml，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离dna保存液。所得保存液的ph值为5.5～7.0。本发明的游离dna保存液应用于保存尿液、组织液的游离dna。该保存液与上述保存样品的比例为1:20～1:10。实施例保存液制备量取预定含量的浓度为0.5m的乙二胺四乙酸二钠溶液、浓度为1m的tris-hcl缓冲液，称取预定含量的咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，65℃水浴30min；溶解后，添加预定含量的tritonx-100，最后添加去离子水定容至100ml，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离dna保存液。各组分的数据可以如表1所示，同时，表1还示出了各实施例保存液的ph值。需要指出的是，本发明的保存液的配方含量并不局限于表1中数据。表1游离dna保存液实施例对比测试例下面给出本发明游离dna保存液的保存效果对比测试例。由于影响人体尿液、胸水及腹水中游离dna稳定性的因素基本一致，考虑到获取检测样本的简便性和多样性，选择尿液样本进行游离dna保存的对比实验测试。晨尿中核酸浓度较高、遗传信息更为丰富，降解风险相对较高，更能检验保存液质量，故采集晨尿样本。普通健康人尿液中游离dna含量较低(含量范围0.06～25ng/μl，中值3ng/μl)，对样本量、提取操作造成一定困难，游离dna片段分布范围主要在100～1000bp，故采集样本当下设计添加一定量dnamarker，方便游离dna保存效果检测与呈现，且节约时间与成本。以下实施例的尿液游离dna保存液相关测试实验中无特殊说明均采集晨尿样本并添加定量外源dnamarker。对比测试例1普通健康人和健康孕妇尿液游离dna对比实验保存效果测试1、仪器、试剂和样本主要仪器：台式高速冷冻离心机(盐城市安信仪器设备有限公司tgl16m)、全自动核酸提取仪(杭州奥盛仪器有限公司autopure-32)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝胶成像仪(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度计(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要试剂：实施例1-7保存液、0.1倍添加某品牌血液游离dna保存液cw0.1、0.01倍添加某品牌血液游离dna保存液cw0.01、无菌水对照h2o、磁珠法游离dna提取试剂盒(英芮诚生化科技(上海)有限公司)。样本：普通健康人、健康孕妇新鲜尿液样本；dnamarker(smobiodm2000、dm2100)。2、实验方案：向普通健康人、健康孕妇新鲜尿液样本中添加定量marker作为含游离dna尿液模型，按比例添加实施例1-7保存液、cw0.1、cw.0.01保存液、无菌水，室温保存1天，使用磁珠法游离dna提取试剂盒提取各组尿液样本中的游离dna，电泳检测提取样本条带的完整性，观察各保存液对尿液游离dna的保存效果。电泳条件为：2％琼脂糖凝胶、1×tae缓冲液、110v、25min。电泳上样量为marker0.95μl、实验组dna提取样品5μl。上样顺序从左到右：m(dnamarker)、1(实施例1)、2(实施例2)、3(实施例3)、4(实施例4)、5(实施例5)、6(实施例6)、7(实施例7)、8(cw0.1)、9(cw.0.01)、10(无菌水)。实验组：各保存液(实施例1-7保存液、cw0.1、cw0.01、h2o)室温保存尿液游离dna模型1天(+1d)；阴性对照组：无菌水h2o组室温保存尿液1天(+1d)。3、实验结果：对普通健康人，实施例1-7保存液组分均可稳定保存游离dna+1d；对孕妇，实验组中实施例1、2、6保存液对游离dna的保存效果均优于其他组保存液的保存效果及无菌水对照。具体见图1、2。同时，表2还示出了对健康孕妇尿液样本对比实验的紫外吸收检测结果。表2各保存液的紫外吸收检测结果样本260/280浓度(ng/μl)回收率实施例11.7512.9890.14％实施例21.7613.1291.11％实施例30.00-1.120实施例41.704.6232.08％实施例51.777.5252.11％实施例61.8113.8496.11％实施例71.7710.3972.15％cw0.11.666.3043.75％cw0.010.00-2.460h2o0.00-1.570实验结论：实施例1-7的保存液可稳定保存普通健康人尿液的游离dna，效果与市售血液游离dna保存液效果相当；实施例1、2、6的保存液相较其他配方及市售血液游离dna保存液可以更好地保存健康孕妇尿液的游离dna，适用样本更广。对比测试例2保存液与空白对照实验1、试剂、仪器和样本主要仪器：台式高速冷冻离心机(盐城市安信仪器设备有限公司tgl16m)、磁力架(上海奥润微纳新材料科技有限公司)、数显恒温水浴锅(邦西仪器科技(上海)有限公司hh-2)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝胶成像仪(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度计(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要试剂：dnamarker(smobiodm2100)、磁珠法游离dna提取试剂盒(英芮诚生化科技(上海)有限公司)、实施例6保存液。样本：采集普通健康人新鲜晨尿样本约35ml。2、实验方案：晨尿添加保存液后室温保存，0d(2h)、8d、14d检测游离dna保存效果。实验组：14ml尿液添加1ml专利保存液，混匀后室温保存；对照组：14ml尿液添加1ml无菌水，混匀后室温保存。检测时间点：0d(2h)、8d、14d。预处理：取实验组、对照组两组保存样本各700μl，分别添加等量dnamarker70μl于两管，充分混匀，各组均分于3个1.5ml离心管室温保存，用于0d(2h)、8d、14d三个时间点的保存效果检测。检测前样本需进行1000×g离心10min，取上清，使用游离dna提取试剂盒进行游离dna提取。电泳检测提取样本条带的完整性，观察各保存液对尿液游离dna的保存效果。电泳条件为：2％琼脂糖凝胶、1×tae缓冲液、110v、25min。电泳上样量为marker2μl、实验组dna提取样品7μl。上样顺序(从左到右)：ca-0(对照组0d)、ca-8(对照组8d)、ca-14(对照组14d)、n-0(专利保存液组0d)、n-8(专利保存液组8d)、n-14(专利保存液组14d)。3、实验结果：保存液产品中游离dna可被完整保存，且回收率达到80％以上，而对照组游离dna则降解快速，具体见图3、图4。4、实验结论：采用本专利所述试剂盒产品处理的dna可完整保存样本dna各片段条带，保存效果良好。对比测试例3尿液样本极端室温保存测试实验1、仪器、试剂和样本主要仪器：全温振荡培养箱(苏州培英实验设备有限公司hzq-f100)、冰箱(青岛海尔股份有限公司bcd-190tmpk)、台式高速冷冻离心机(盐城市安信仪器设备有限公司tgl16m)、全自动核酸提取仪(杭州奥盛仪器有限公司autopure-32)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝胶成像仪(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度计(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要试剂：磁珠法游离dna提取试剂盒(英芮诚生化科技(上海)有限公司)、dnamarker(smobiodm2000)、实施例6保存液。样本：普通健康人新鲜尿液样本。2、实验方案：采集普通健康人新鲜尿液样本，1000×g离心10min取上清，添加定量dnamarker混匀，实验组和对照组分别使用专利保存液和无菌水保存尿液，保存温度条件为4℃、37℃，保存0d(2h)、14d对游离dna进行试剂盒提取和电泳条带完整度检测。电泳条件为：2％琼脂糖凝胶、1×tae缓冲液、110v、25min。电泳dna提取样品上样量7μl。实验组(c组)：保存液保存尿液样本放置于4℃、37℃；对照组(n组)：无菌水保存尿液样本放置于4℃、37℃；3、实验结果：保存液组4℃、37℃回收率均在80％以上，而对照组则当天2h内迅速降解。具体见图5、图6。表3保存液与无菌水的紫外吸收检测结果样本260/280浓度(ng/μl)回收率c-0d(2h)1.755.0129.47％n-0d(2h)1.7616.9499.65％4℃-c-0d0.000.0004℃-n-14d1.7016.6898.12％37℃-c-0d1.770.070.41％37℃-n-14d1.8116.7898.71％实验结论：尿液游离dna保存试剂盒可在4℃、37℃条件下稳定保存尿液样本中的游离dna。对比测试例4保存液多样本尿液游离dna保存测试实验1、仪器、试剂和样本主要仪器：台式高速冷冻离心机(盐城市安信仪器设备有限公司tgl16m)、全自动核酸提取仪(杭州奥盛仪器有限公司autopure-32)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝胶成像仪(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度计(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要试剂：磁珠法游离dna提取试剂盒(英芮诚生化科技(上海)有限公司)、实施例6保存液；样本：普通健康人新鲜尿液。2、实验方案：针对个体差异问题的存在，为验证本保存液产品对尿液游离dna样本保护的有效范围，采集随机8人尿液样本，其中包括男性4人、女性4人(1#为孕期女性；2#为经期女性；3#为已婚育女性；4#为未婚女性；5#为糖尿男性；6#、8#为已婚男性、7#为未婚男性)，添加一定量游离dna，进行保存液室温保存14d，提取0d、+14d游离dna。1000×g离心10min获取样本上清，试剂盒提取游离dna，电泳检测最终提取的游离dna洗脱液，电泳条件为：2％琼脂糖凝胶、1×tae缓冲液、电压100v、时间25min。电泳上样量为实验组dna提取样品7μl。3、实验结果：实验组回收率均在80％以上，条带保存完整，具体如图7所示。4、实验结论：保存液产品可满足人群多样性，可对多种尿液样本游离dna进行中长期保存。对比测试例5保存液抑菌效果实验1、仪器、试剂和样本主要仪器：生物安全柜(东联哈尔仪器设备有限公司classiitypea2)、全温振荡培养箱(苏州培英实验设备有限公司hzq-f100)、移液器、一次性培养皿、玻璃涂布棒等。主要试剂：lb固体培养基、实施例6保存液、无菌水。样本：普通健康人新鲜尿液2、实验方案：设实验组保存液、对照组无菌水保存尿液样本，分别取室温保存了6d、10d的尿液样本同时进行抑菌效果检测。lb固体培养基铺lb平板，取各组200μl保存样本均匀涂于lb平板上，隔天计数平板菌斑数。实验组：保存液保存尿液样本6d、10d；对照组：无菌水保存尿液样本6d、10d。3、实验结果：对照组6d、10d的lb平板长满菌落，实验组6d的lb平板上仅6个菌斑、10d无菌斑。4、实验结论：保存液抑菌效果明显，可避免细菌繁殖对游离dna的影响。对比测试例6保存液对蛋白尿、血尿模常规14项检测效果影响1、仪器、试剂和样本主要仪器：尿液分析仪(烟台宝威医疗器械有限公司)；主要试剂：实施例6保存液、bsa(牛血清白蛋白/新鲜鸡血)；样本：普通健康人新鲜尿液样本。2、实验方案：向普通健康人新鲜尿液样本中添加1gbsa作为蛋白尿模型；添加1ml新鲜鸡血作为血尿模型，使用保存液对样本保存8d、14d(血尿模型为18d)，观察保存液对尿常规检测14项检测参数的影响效果。实验组：保存液保存尿液组0d、8d、14d(血尿18d)；对照组：无菌水组保存尿液组0d、8d、14d(血尿18d)；3、实验结果：对照组亚硝酸盐出现假阳性、其他数据无变化；实验组保存液保存后14项数据均无变化。4、实验结论：保存液可稳定保存蛋白尿、血尿的常规14项的检测结果。对比测试例7保存液稀释比例对尿液游离dna保存效果的试验1、仪器、试剂和样本主要仪器：台式高速冷冻离心机(盐城市安信仪器设备有限公司tgl16m)、全自动核酸提取仪(杭州奥盛仪器有限公司autopure-32)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝胶成像仪(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度计(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要试剂：实施例6保存液。样本：普通健康人尿液样本；dnamarker(smobiodm2000)。2、实验方案：向普通健康人新鲜尿液样本中添加定量marker作为含游离dna尿液模型，实验组按1:10、1:20、1:30比例添加专利保存液，室温保存0d、7d、14d，观察不同稀释比例的专利保存液对尿液游离dna的保存效果。3、实验结果：按照1:10和1:20比例添加的专利保存液能够在室温14天内高效保存尿液游离dna，而按1:30比例添加的保存液在14天时的保存效果较差，具体见图8。4、实验结论：本专利保存液的使用稀释比例在1:20～1:10之间。对比测试例8保存液与其他保存液对尿液游离dna保存效果的试验1、仪器、试剂和样本主要仪器：台式高速冷冻离心机(盐城市安信仪器设备有限公司tgl16m)、全自动核酸提取仪(英芮诚生化科技(上海)有限公司ep300)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝胶成像仪(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度计(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要试剂：磁珠法游离dna提取试剂盒(英芮诚生化科技(上海)有限公司)、实施例6保存液、其他各成分保存液见设组。样本：普通健康人尿液样本；dnamarker(smobiodm2000)。2、实验方案：向普通健康人新鲜尿液样本中添加定量dnamarker作为含游离dna的尿液模型，实验组按保存液成分不同设组，室温保存0d、3d、8d、14d，观察不同保存液对尿液游离dna的保存效果及常规项检测结果的稳定性。1000×g离心10min获取样本上清，试剂盒提取游离dna，电泳检测最终提取的游离dna洗脱液，电泳条件为：2％琼脂糖凝胶、1×tae缓冲液、电压100v、时间25min。电泳上样量为marker1.8μl(代表100％回收率)、实验组dna提取样品8μl。设组：ca(对照组-无菌水)、tdz(某品牌市售尿液保存液)、a、d、e、f(对应保存液a、d、e、实施例6保存液)。ca：无菌水，ph8.0；a:250mmedta·2na、0.9％nacl、0.5％pfa、0.2％dtt、30％无水乙醇50mmtris-hcl，ph8.0；d：1％peg6000、1％丁酰胺、250mmedta·2na、50mmtris-hcl，ph8.0；e：2％peg、0.4％pfa、20mmedta·2na、5％tris-hcl、50％无水乙醇，ph7.4；f：30g咪唑烷基脲、0.02moledta、50μltritonx-100、0.005moltris-hcl、76ml去离子水，ph6.7；时间点：0d(+4h)、3d、8d、14d。3、实验结果：a：各配方保存液dna样本凝胶电泳检测图9及代表游离dna典型片段范围的500bp、200bp、100bp的光密度图10-12，500bp代表游离dna较大片段，200bp、100bp代表小片段。无菌水ca组在2h内便降解70％、电泳条带模糊，3天时已完全降解；d组可以短期(3d)保存游离dna，之后大片段逐步降解为小片段(14d时，c组500bp含量下降而200bp、100bp上升)；a、e在实验周期内可完整保存较大片段(500bp80％以上)，但200bp以下的小片段不能保存；市售同类产品tdz组与本发明的保存液f组可以在14天内对所有片段保存，但是对小片段100bp的保存效果f组(约85％)明显优于tdz组(约70％)。b：在常规14项的检测结果的稳定性实验的第三天，无菌水ca组出现潜血项假阳性、ph从6.0增加到7.5；市售同类产品tdz组出现亚硝酸盐假阳性、ph为7.5；专利保存液f组各项结果稳定仅ph从6.0增加到6.5稍有变动。常规项检测实验结果仅体现0、+3d的，+8d、+14d实验结果与+3d一致。4、实验结论：专利保存液相较于市售某品牌尿液保存液可以更完整、更长时间地保存ucfdna和稳定尿常规项的检测结果。综上所述，根据本发明提供的游离dna保存液可以完整地中长期保存人体尿液、组织液中的游离dna、可以适用多样本尿液、组织液游离dna的保存，适用范围广，可以保证后续样本检测的准确度和可信度。最后应说明的是：在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包含一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12