本发明涉及一种南瓜游离小孢子诱导培养基及诱导培养方法，具体涉及一种显著提高了南瓜游离小孢子胚性愈伤诱导效率、促进了南瓜花培育种体系建立的南瓜游离小孢子诱导培养基及诱导培养方法，属于蔬菜培育高新技术领域。
背景技术：
南瓜（cucurbitamoschata）属于葫芦科南瓜属的一年生蔓性草本植物，起源于美洲，在16世纪中叶明中期传入中国。南瓜全球目前栽培种主要有5个：中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜、灰籽南瓜和黒籽南瓜，在中国主要是栽培前3种。南瓜是人类最早栽培的古老作物之一，在公元前4050年就开始了美洲南瓜的栽培，公元前5000～3000年就有了中国南瓜和墨西哥南瓜的残片存在。
南瓜的营养、保健与药用价值较高，古代名医李时珍在《本草纲目》中对南瓜的作用有如下记载“补中，补肝气，益心气，益肺气，益精气”，凡久病气虚、脾胃虚弱、症见气短倦怠、食少腹胀、水肿尿少者宜用。近年来的研究结果亦表明，南瓜的营养成分丰富，其营养成分为水分90.24%、蛋白质0.65%、脂肪0.13%、碳水化合物6.08%、纤维2.15%、灰分0.73%，同时还含有丰富的胡萝卜素、维生素b、维生素c、维生素e、精氨酸、天门冬氨酸、腺嘌呤、果胶、甘露醇、叶红素、叶黄素及钙、钾、锌、铬等矿物质，特别是稀有氨基酸瓜氨酸含量达20.9mg/100g，果胶含量占南瓜干物质的7%-17%，脂肪含量却非常低。南瓜具有多种食疗保健作用和药用价值，近年来，国内外研究表明，南瓜具有降血糖、降血脂、解毒、保肝肾、防治癌症及肥胖症等保健与药用功效。随着人们对南瓜认识的不断加深，国内外逐渐开始对南瓜进行综合开发利用，目前市场上出现的系列南瓜产品有南瓜粉、南瓜酱、南瓜罐头、南瓜果脯、三合味南瓜片、南瓜蜜钱瓜干、南瓜晶、南瓜糊、南瓜糕点、南瓜饮料、南瓜冰淇淋、什锦瓜果、南瓜果冻、南瓜酱油、南瓜火腿、南瓜营养汁等多种品种。
在我国，南瓜的保健作用正渐渐被人们认识了解，南瓜食品越来越受到人们的喜爱。南瓜对环境适应力极强，极易生长，在我国各地普遍栽培，而且运输和保存比较方便。南瓜在中国的种植面积为76万hm2，总产量为1616万吨，面积和总产量分别占全世界的10.3%和20%，我国是南瓜生产世界第一大国。开发南瓜产品，开展南瓜深加工的研究，对发展南瓜的种植及丰富保健食品市场都有较大的意义。
随着南瓜国际国内市场需求的紧俏，优质、抗病、丰产的南瓜良种培育成为蔬菜培育科研人员的研究主题之一。南瓜是异花授粉植物，杂交优势非常明显，目前主要采用杂交育种方法进行南瓜新品种培育。传统杂交育种方法存在周期长、效率低等突出问题，育成一个稳定优良自交系一般需要6-8年，甚至更长时间，选育自交系非常费事、费工。近年来随着人工成本的增加，常规育种的不足在实际工作中日渐明显。因此，迫切需求南瓜育种的新途径和新方法。
单倍体育种与常规多代自交获得纯系相比，具有周期短、效率高、纯系稳定等特点。游离小孢子培养是单倍体育种技术中快速获得纯系的一种有效方法，同单倍体育种技术中的花药培养相比，游离小孢子培养消除了小孢子和花药壁、级链层细胞之间可能存在的营养竞争，往往培养成功的基因型多，胚状体诱导频率也高，同时去除了花药壁、级链层细胞等体细胞再生植株的干扰，从而可以提高选择的准确性，提高育种效率和品种质量。
国内外学者对影响蔬菜游离小孢子培养的一些因素进行了研究，取得了显著的进展，通过优化培养基和改进培养方法，使部分蔬菜材料小孢子胚诱导率有了提高，部分蔬菜种花培育种体系得以建立。但是南瓜游离小孢子培养研究进展缓慢，利用这项技术进行南瓜育种的研究鲜见报道，主要原因是小孢子胚性愈伤诱导率低而不稳定，直接限制了南瓜游离小孢子培养技术在育种上的应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种显著提高了南瓜游离小孢子胚性愈伤诱导效率、促进了南瓜花培育种体系的建立的南瓜游离小孢子诱导培养基及诱导培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种南瓜游离小孢子诱导培养基及诱导培养方法，其特征在于：所述南瓜游离小孢子诱导培养基的配方如下：
kno380-90mg/l，mgso4∙7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2∙4h2o160-200mg/l，mnso4∙4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4∙7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4∙7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4∙2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4∙5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2∙6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，l-谷氨酰胺450-550mg/l，维生素b10.9-1.1mg/l，维生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，烟酸4.5-5.5mg/l，肌醇160-180mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，环鸟苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基亚硝基脲1.2-1.8g/l，蔗糖55-65g/l，植物凝胶3.0-3.5g/l，6-ba0.15-0.25mg/l，naa0.3-0.4mg/l，甘露醇10-14g/l，聚乙二醇140-180mg/l，水解蛋白1.0-1.4g/l，植物硫化激动素psk-α25-35pmol/l，ph5.4-5.8。
所述的南瓜游离小孢子的诱导培养方法为：
将南瓜种子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧长至3-4米后进入初花期，选择单核晚期南瓜花蕾进行取材，置于4℃冰箱内低温预处理1-2d，接种前，将花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次；沥干水分后，在b5液体洗涤培养基中用平头玻棒碾压花蕾，挤出小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液于10ml离心管，850rpm下离心3min，沉淀物加5mlb5洗涤培养基，摇匀，850rpm下离心2min，重复两次，所得沉淀物即为南瓜游离小孢子；将南瓜游离小孢子转移入南瓜游离小孢子诱导培养基中，33℃热激处理48h后转入25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。
所述的单核晚期南瓜花蕾的选材标准为：测量花蕾的纵茎和横茎长度并计算纵横比，取材纵横茎之比为2.4-2.6的南瓜花蕾。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明根据禾本科和茄科小孢子诱导培养基配方，针对于南瓜游离小孢子的孢子体发育特性，继续优化并组合基本培养基配比，调整基本培养基的组配，有利于南瓜游离小孢子的诱导；采用低含量的植物凝胶，使配制成的培养基半固体化，对南瓜游离小孢子的诱导更有利；发掘和试验针对于提高南瓜游离小孢子成胚诱导能力的有机添加物和无机添加物，agno3、腺嘌呤、环鸟苷酸、谷胱甘肽、甲基亚硝基脲、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激动素psk-α等物质的合适浓度的添加，均不同程度的提高了南瓜游离小孢子的诱导率。
本发明所提供的南瓜游离小孢子诱导培养基，是在现有其它蔬菜种的研究基础之上创造性改良的成果，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。采用本发明所提供的培养基可以大大提高游离南瓜小孢子胚性愈伤的诱导效率，因此具有较高的产业推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种南瓜游离小孢子诱导培养基及诱导培养方法，其特征在于：所述南瓜游离小孢子诱导培养基的配方如下：
kno380-90mg/l，mgso4∙7h2o140-160mg/l，kh2po470-76mg/l，ca(no3)2∙4h2o160-200mg/l，mnso4∙4h2o25-30mg/l，na2-edta11-14mg/l，feso4∙7h2o12-15mg/l，h3bo38.0-8.5mg/l，znso4∙7h2o8.5-9.5mg/l，ki0.45-0.55mg/l，agno315-19mg/l，na2moo4∙2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4∙5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2∙6h2o0.02-0.03mg/l，腺嘌呤13-17mg/l，l-谷氨酰胺450-550mg/l，维生素b10.9-1.1mg/l，维生素b60.6-0.8mg/l，vc0.55-0.65mg/l，烟酸4.5-5.5mg/l，肌醇160-180mg/l，甘氨酸3.5-4.5mg/l，环鸟苷酸0.15-0.25g/l，谷胱甘肽30-35mg/l，甲基亚硝基脲1.2-1.8g/l，蔗糖55-65g/l，植物凝胶3.0-3.5g/l，6-ba0.15-0.25mg/l，naa0.3-0.4mg/l，甘露醇10-14g/l，聚乙二醇140-180mg/l，水解蛋白1.0-1.4g/l，植物硫化激动素psk-α25-35pmol/l，ph5.4-5.8。
南瓜游离小孢子的诱导培养方法为：
将南瓜种子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧长至3-4米后进入初花期，选择单核晚期南瓜花蕾进行取材，单核晚期南瓜花蕾的选材标准为：测量花蕾的纵茎和横茎长度并计算纵横比，取材纵横茎之比为2.4-2.6的南瓜花蕾；然后将选材的南瓜花蕾置于4℃冰箱内低温预处理1-2d，接种前，将花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次；沥干水分后，在b5液体洗涤培养基中用平头玻棒碾压花蕾，挤出小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液于10ml离心管，850rpm下离心3min，沉淀物加5mlb5洗涤培养基，摇匀，850rpm下离心2min，重复两次，所得沉淀物即为南瓜游离小孢子；将南瓜游离小孢子转移入南瓜游离小孢子诱导培养基中，33℃热激处理48h后转入25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。
实施例1
配制本发明所述的一种南瓜游离小孢子诱导培养基，培养基配方具体如下：
kno385mg/l，mgso4∙7h2o150mg/l，kh2po473mg/l，ca(no3)2∙4h2o180mg/l，mnso4∙4h2o27.5mg/l，na2-edta12.5mg/l，feso4∙7h2o13.5mg/l，h3bo38.25mg/l，znso4∙7h2o9.0mg/l，ki0.5mg/l，agno317mg/l，na2moo4∙2h2o0.25mg/l，cuso4∙5h2o0.025mg/l，cocl2∙6h2o0.025mg/l，腺嘌呤15mg/l，l-谷氨酰胺500mg/l，维生素b11.0mg/l，维生素b60.7mg/l，vc0.6mg/l，烟酸5.0mg/l，肌醇170mg/l，甘氨酸4.0mg/l，环鸟苷酸0.2g/l，谷胱甘肽32.5mg/l，甲基亚硝基脲1.5g/l，蔗糖60g/l，植物凝胶3.25g/l，6-ba0.2mg/l，naa0.35mg/l，甘露醇12g/l，聚乙二醇160mg/l，水解蛋白1.2g/l，植物硫化激动素psk-α30pmol/l，ph5.6。
南瓜游离小孢子的诱导培养方法为：
将南瓜种子在春季3-4月份播于大田，待南瓜秧长至3-4米后进入初花期，选择单核晚期南瓜花蕾进行取材，单核晚期南瓜花蕾的选材标准为：测量花蕾的纵茎和横茎长度并计算纵横比，取材纵横茎之比为2.4-2.6的南瓜花蕾；然后将选材的南瓜花蕾置于4℃冰箱内低温预处理1-2d，接种前，将花蕾转移入超净工作台无菌烧杯中，倒入70%酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次；沥干水分后，在b5液体洗涤培养基中用平头玻棒碾压花蕾，挤出小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液于10ml离心管，850rpm下离心3min，沉淀物加5mlb5洗涤培养基，摇匀，850rpm下离心2min，重复两次，所得沉淀物即为南瓜游离小孢子；将南瓜游离小孢子转移入南瓜游离小孢子诱导培养基中，33℃热激处理48h后转入25℃暗培养直至胚性愈伤组织形成。
为了比较本发明所提供的南瓜游离小孢子诱导培养基各组分的配比效果，我们对本发明提供的南瓜游离小孢子诱导培养基进行了组分改变的单因子试验，试验品种亦采用锦红一号和黄金二号，游离小孢子的分离方法、组培操作方法、培养方法均相同，胚性愈伤组织形成后分别统计锦红一号和黄金二号的游离小孢子在各培养基内的小孢子愈伤组织诱导率。
单因子试验的试验组分分别为：agno3、腺嘌呤、环鸟苷酸、谷胱甘肽、甲基亚硝基脲、植物凝胶、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激动素psk-α，各组分因子梯度浓度设置和试验结果如下表1-9。
由表1到表9的南瓜游离小孢子诱导培养基组分改变的单因子试验可以发现，采用低含量的植物凝胶，使配制成的培养基半固体化，对南瓜游离小孢子的诱导更有利，而当植物凝胶比例继续降低时，游离小孢子的诱导率突降为0，这是由于小孢子沉降入培养基内造成小孢子诱导生长缺氧造成的；而agno3、甲基亚硝基脲配比的增加产生了很明显的不利效应；而腺嘌呤、环鸟苷酸、谷胱甘肽、甘露醇、聚乙二醇和植物硫化激动素psk-α的增加不能显著增加培养基的诱导效果，由于这些添加物的增加会提高培养基的配制成本，在培养基诱导效果达最优值的最小配比量是综合生产成本后的最佳配比。由此可见，进行任何培养基组分的增加或减少均是不利的，同时说明本发明的组分配比是最优的。
实施例2
为了比较本发明所提供的南瓜游离小孢子诱导培养基与其它培养基对南瓜游离小孢子胚性愈伤组织诱导效率的差异，我们另外选择了2种游离小孢子诱导培养基，试验品种亦采用锦红一号和黄金二号，游离小孢子的分离方法、组培操作方法、培养方法均与实施例1相同，胚性愈伤组织形成后分别统计锦红一号和黄金二号的小孢子在该2种培养基内的小孢子愈伤组织诱导率。
其它2种游离小孢子诱导培养基配方为：
nln培养液，ph为5.8（对比文件来自于栗根义等《大白菜游离小孢子培养》）；
nln-13培养基+0.5g/l活性炭，ph为5.8（对比文件来自于蒋武生等《活性炭对小白菜小孢子培养的影响》）。
培养基对比实验
将采用本发明所提供的培养基诱导常州长白梗和合肥小叶菜游离小孢子统计所得的小孢子愈伤组织诱导率与对比实施例的锦红一号和黄金二号小孢子愈伤组织诱导率进行比较，比较结果如下表10所示。
由表10可以发现，本发明所提供的南瓜游离小孢子诱导培养基对南瓜品种锦红一号和黄金二号的小孢子愈伤组织诱导率平均值达到了16.7个/蕾，而前人所采用的两种培养基对南瓜品种锦红一号和黄金二号的小孢子愈伤组织诱导率平均值分别仅为4.3个/蕾和8.9个/蕾，可以发现本发明所提供的南瓜游离小孢子诱导培养基对南瓜游离小孢子的诱导能力做出了显著的提升。
本发明所提供的南瓜游离小孢子诱导培养基，是在现有其它蔬菜种的研究基础之上创造性改良的成果，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。采用本发明所提供的培养基可以大大提高游离南瓜小孢子胚性愈伤的诱导效率，因此具有较高的产业推广价值。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。