一种高通量桃叶片基因组DNA的提取方法与流程

本发明涉及一种桃叶片基因组dna的提取方法，具体涉及一种高通量桃叶片基因组dna的提取方法。
背景技术：
：桃[prunuspersica(l.)batsch]原产我国，是我国栽培面积较大的落叶果树之一。由于其遗传和生物学特征(基因组小、童期短、自交亲和、质量性状多等)，是多年生果树研究的模式植物。同时由于栽培品种多为二倍体，更易于遗传规律分析、重要性状定位、遗传多样性分析以及系统进化关系研究。桃全基因组序列测定的完成和在genomedatabaseforrosaceae(gdr)的数据释放，为基于大量样品dna进行基因精细定位和分子辅助选种研究奠定了基础。近年来随着生物技术的进步，特别是基于二代测序的标记技术加速了作物经济性状基因的挖掘和分子聚合育种体系的建立。其中，图位克隆法仍是基因定位和克隆的常用和有效手段。这种方法首先在初步定位该基因的基础上，通过寻找较为紧密的分子标记，对该基因进行精细定位，从而将该基因界定在一个较小的区域内。许多重要的质量和数量性状已经通过图位克隆的方法被精细定位或克隆。但图位克隆的前提是需要足够量的杂交群体后代。同样，应用分子聚合育种需对杂交后代单株进行分子鉴定和筛选，这些都需提取大量样品dna，结合分子标记开展相关的育种工作。目前，多年生果树包括桃，存在叶片基因组dna提取步骤复杂、时间长、通量少等缺点。因此，如何快速、省时、高通量地提取叶片dna是亟需解决的问题之一，是开展后续工作的前提。技术实现要素：本发明目的是提供一种高通量桃叶片基因组dna的提取方法，克服了传统桃叶片基因组dna提取时间长、通量少等缺点。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种高通量桃叶片基因组dna的提取方法，包括以下步骤：步骤1：称取桃叶片分别置于48组、每个离心管体积为1.2ml的八连排离心管中，在每个离心管中加入直径4mm的研磨钢珠，加入液氮冷冻后放入样品研磨仪中研磨100s至桃叶片粉碎，研磨完成后在放入液氮中冷冻；步骤2：加入500μl、质量浓度为2％的ctab，在60℃烘箱中放置30min，期间每隔10min轻轻摇匀；步骤3：采用台式离心机，在转速500r/min下离心5min，防止研磨物溢出导致样品间污染；步骤4：用300ml量程的8通道移液器向八连排离心管中加入氯仿和异戊醇的混合液，直至1.2ml离心管的满载线，然后轻轻上下晃动摇匀5min；所述混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；步骤5：放入冷冻离心机，在4℃、转速4000r/min条件下离心10min，吸取上清液，将约150μl上清液转入200μl的96孔pcr板，然后加入与上清液等体积的经过预冷的无水乙醇，轻轻上下晃动摇匀，在-20℃冰箱中放置1h；步骤6：将96孔pcr板放入冷冻离心机中，在4℃、转速4000r/min条件下离心10min，弃上清液；步骤7：在带有沉淀的96孔pcr板中加入200μl、质量浓度为70％的乙醇，放入冷冻离心机，在转速1000r/min下离心5min，然后用质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，在室温下自然晾干；步骤8：在室温下自然晾干后，在96孔pcr板中加入150μl的0.1×te缓冲液溶解沉淀，同时加入0.5μl的rnasea，去除rna污染。进一步地，步骤1中所述样品研磨仪的振动频率为30hz。相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明建立了一种快速、高通量提取桃叶片基因组dna的方法，精简了提取步骤和水浴方法，每人每天可提取1024个样品dna，克服了传统dna提取方法程序复杂、耗时长的缺点，为大规模提取桃叶片基因组dna提取奠定了基础。该方法提取的基因组dna可用于ssr分析、基于hrm的snp分型扩增、sanger测序以及其他分子标记分析等后续研究。附图说明图1为本发明实施例一中桃叶片加入1.2ml八连排离心管后的状态示意图。图2为本发明实施例一中桃叶片经研磨后状态示意图。图3为本发明实施例一中桃叶片加入ctab后状态示意图。图4为本发明实施例一中桃叶片加入氯仿和异戊醇后状态示意图。图5为本发明实施例一中提取的桃叶片dna溶液示意图。图6为本发明提取dna的1％的琼脂糖胶电泳结果。图7为本发明提取dna的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图8为本发明提取dna进行hrm的snp基因分型结果。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实验器具和试剂：200ml、质量浓度为2％的ctab溶液：含4g的十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，16.364g的nacl，20ml、1mol/l、ph＝8.0的三羟甲基氨基甲烷，8ml、0.5mol/l的乙二胺四乙酸；te缓冲液：10mm/l的三羟甲基氨基甲烷，1mm/l、ph＝8.0的乙二胺四乙酸；氯仿，分析纯；异戊醇，分析纯；无水乙醇，分析纯；质量浓度为70％的乙醇；1.2ml的八连排离心管；100ml、300ml和10μl的8通道移液器(eppendorf)；尖头镊子、钢珠(直径4mm)；样品碾磨仪(上海)；台式离心机；冷冻离心机(eppendorf5810r)；96孔pcr板(axygen)；乳胶手套(光明)；液氮；pcr仪(eppendorf)；荧光定量pcr仪(rochelc480)、taq聚合酶、hrmmatermix(roche)、page胶电泳系统胶等。实施例中所用的04-1-112为桃品种97矮和鸳鸯垂枝的杂交后代单株，种植于中国农业科学院郑州果树研究所桃育种圃内。实施例一如图1～5所示，一种高通量桃叶片基因组dna的提取方法，包括以下步骤：步骤1：挑选以桃中油8号(prunuspersica，cn8)为母本，04-1-112(prunuspersica)为父本杂交后代的单株384个，称取每个单株的桃叶片300μg，分别置于48组、每个离心管体积为1.2ml的八连排离心管中，并对每个离心管和管盖进行位置和方向标记，在每个排离心管中加入直径4mm的研磨钢珠，加入液氮冷冻后放入样品研磨仪中研磨100s至桃叶片粉碎，研磨完成后在放入液氮中冷冻；所述样品研磨仪的振动频率为30hz；步骤2：加入500μl、质量浓度为2％的ctab，在60℃烘箱中放置30min，其间每隔10min轻轻摇匀；步骤3：采用台式离心机，在转速500r/min下离心5min，防止研磨物溢出导致样品间污染；步骤4：用300ml量程的8通道移液器向八连排离心管中加入氯仿和异戊醇的混合液，直至1.2ml离心管的满载线，然后轻轻上下晃动摇匀5min；所述混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；步骤5：放入冷冻离心机，在4℃、转速4000r/min条件下离心10min，吸取上清液，将约150μl上清液转入200μl的96孔pcr板，然后加入与上清液等体积的经过预冷的无水乙醇，轻轻上下晃动摇匀，在-20℃冰箱中放置1h；步骤6：将96孔pcr板放入冷冻离心机中，在4℃、转速4000r/min条件下离心10min，弃上清液；步骤7：将带有沉淀的96孔pcr板中加入200μl、质量浓度为70％的乙醇，放入台式离心机，在转速1000r/min下离心5min，然后用质量浓度为70％的乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，在室温下自然晾干；步骤8：在室温下自然晾干后，在96孔pcr板中加入150μl的0.1×te缓冲液溶解沉淀，同时加入0.5μl的rnasea，去除rna污染，即可得到桃叶片基因组dna，将桃叶片基因组dna长期保存于-20℃的冰箱中，或者短期保存于4℃冰箱。采用上述方法在3h内可完成了384个样品dna的提取，一天按8小时工作时间计，可提取1024个样品dna，克服了传统dna提取方法程序复杂、耗时长的缺点，本发明实现了高通量提取桃叶片dna。实施例二本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：步骤1中采用的桃叶片为中油8号(prunuspersica，cn8)的桃叶片。实施例三本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：步骤1中采用的桃叶片为04-1-112成年亲本树的桃叶片。实施例四dna的提取是分子生物学研究中非常重要的一步。因此，dna提取方法的适用性还需要下游实验的验证。本实施例以实施例1～3所得的桃叶片基因组dna溶液为样品，检测样品的纯度、完整度、能否用于pcr扩增结果及hrm的snp基因分型。由于一个完整提取过程所获得的桃叶片dna溶液为384个，数量较大，故本实施例选取实施例1中的5个杂交单株、实施例2中的1个单株及实施例3中的1个单株的桃叶片得到的桃叶片dna溶液进行上述检测。采用nanodrop1000spectrophotometer(themo)分别测量上述三种提取dna溶液在230nm、260nm及280nm处的光吸收峰度值，结果如表1所示。采用1％的琼脂糖胶对提取的桃叶片dna溶液进行电泳检测，结果如图6所示。参考表1和图6，采用本发明方法从桃叶片中提取的dna纯度符合要求。表1本发明方法提取3种dna的质量比较植物名浓度(ng/μl)od260/od230od260/od280杂交后代单株1136.21.851.89杂交后代单株2105.81.801.75杂交后代单株3130.61.781.69杂交后代单株4124.51.791.75杂交后代单株5151.01.651.69中油桃8号102.31.561.6504-1-112112.01.711.77通过pcr扩增进一步验证本发明提取方法所获得dna的质量。以提取的桃叶片dna溶液为pcr反应模板分别进行pcr扩增，pcr扩增采用的通用引物对为：lu-tssd11(5‘-gtgaagtcccaccagtgcag-3’和5‘-tggagtcagagaggatcgtcaa-3’)和lu-tssd7(5’-agccctgtattggttccatcct-3’和5’-agaaggtagcgactccttttcct-3’)。20μlpcr扩增反应体系为：13.27μl的ddh2o、2μl的10×buffer(包含mg2+)、1.6μl(2.5mmeach)的dntp、0.13μl(5u/μl)的taq酶、1μl的模板dna。pcr扩增反应在pcr仪上进行，扩增程序为95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，34个循环；72℃10min；4℃冷却。聚丙烯酰胺凝胶电泳采用8％的聚丙烯酰胺胶200v电泳1.5h，1％硝酸银染8min后，500mlnaoh(10gnaoh加8ml甲醛)显色后用na2co3终止染色后照相(具体参考鲁振华等.桃srap_pcr反应体系建立及与半矮生型相关标记的研究[j].甘肃农业大学学报,2010,3:52～55)，结果如图7所示。用于hrm的基因分型的pcr扩增程序为95℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃20s，45个循环；72℃10min。hrm分析程序为95℃1min，40℃1min，65℃～95℃读取熔解曲线，温度分辨率0.02℃(具体参考：鲁振华等.基于hrm获得与桃tssd紧密连锁的snp标记[j].中国农业科学,2017,50(8):1505-1513)。高分辨率熔解曲线分析采用genescanning软件(version1.5)，结果如图8所示。参考图7和图8可知，采用本发明方法提取的dna的扩增条带明显、snp基因分型良好，可用于后续研究。以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本
技术领域：
的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。当前第1页12