一种用于鉴定川贝母及伪品的荧光PCR检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用与流程

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种用于鉴定川贝母及伪品的荧光pcr检测引物、探针组合物及检测方法与应用。属于分子生物学
技术领域：
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背景技术：
：药用川贝母为百合科(liliaceae)贝母属(fritillarial.)川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母或太白贝母、瓦布贝母的干燥鳞茎。按药材性状不同分别习称“松贝”、“青贝”和“炉贝”。川贝母具有清热化痰、润肺止咳的功效，药用价值极高，由于川贝母生长周期长、资源紧缺，已成为中药材中价格最昂贵的根茎类药材之一。随着需求量的增加，伊犁贝母、平贝母、轮叶贝母等作为川贝母的混伪品频繁出现，甚至葫芦科有毒植物土贝母的鳞茎也被发现冒充川贝母出售，药材质量极不稳定，直接影响到川贝母的用药安全与人的生命安全。因此对川贝母药材进行更深入的鉴定研究对于保证川贝母药材的质量及用药安全具有重要意义。传统的鉴定方法有性状鉴别、显微结构法和化学鉴定方法。但由于市场上贝母类药材品种多，药源植物来源不一、种植环境、产地和加工等因素的存在使得传统的鉴定方法具有一定的局限性，很难将川贝母与其伪品区分开。随着分子生物学技术的发展，使得中药材dna成分含量的定量溯源成为可能。目前利用聚合酶链式反应酶切琼脂糖凝胶电泳(pcr-rflp)法鉴别川贝母已经纳入2015版《药典》，该方法基于dna条形码技术准确、专属性强，可有效鉴别川贝母真伪，但同时也存在周期长，开管操作易污染等缺点；申请号为201610234695.9的专利，使用sybrgreenⅰ法用于鉴定川贝母，但该方法产生的非特异性产物较多，会导致高背景和假阳性。而本发明则克服上述现有技术的不足，在此基础上设计川贝母及伪品的通用引物及各自特异探针，利用多重多色实时荧光pcr技术，一管反应同时鉴别川贝母真伪，大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，使得川贝母鉴定结果更加特异、快速、准确、直观。技术实现要素：本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种用于鉴定川贝母及伪品的荧光pcr检测引物、探针组合物及检测方法与应用。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种用于鉴定川贝母及伪品的荧光pcr通用检测引物，其核苷酸序列如下：通用上游引物fritillariaf：5'-gcagaatcccgtgaaccatc-3'，如seqidno.1所示；通用下游引物fritillariar：5'-tccgtccaccactcgtcg-3'，如seqidno.2所示。一种用于鉴定川贝母及伪品的探针组合物，包括：(1)川贝母的特异探针，其核苷酸序列如下：川贝母的特异探针fritillariap1：5'-ccaatgacccttcgggtgcg-3'，如seqidno.3所示；(2)贝母的通用探针，其核苷酸序列如下：贝母的通用探针fritillariaup：5'-ctcgtgtgcggcgggctt-3'，如seqidno.4所示；(3)伪品贝母的特异探针，其核苷酸序列如下：伪品贝母的特异探针fritillariawp：5'-actggccctccgtgcctcgt-3'，如seqidno.5所示。作为优选的技术方案之一，上述探针组合物中3种探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为fam、hex、tamra、rox、cy5中的任一种，所述淬灭基团为dabcyl、bhq1，bhq2中的任一种，上述3种探针选需用不同的荧光修饰标记。一种用于鉴定川贝母及伪品的pcr检测试剂盒，包括上述荧光pcr通用检测引物、探针组合物和实时荧光pcr反应扩增体系。所述实时荧光pcr反应扩增体系采用20μl反应体系，包括：2×taqmanmastermix(ph值为8.9，镁离子浓度为2.5mm，4种dntp的终浓度各为250μm，taq酶的用量为1u/反应)，引物组终浓度0.1～0.5μm，探针组合物终浓度0.05～0.25μm，dna用量0.5～50ng/μl取2μl，用双蒸水补足20μl。所述pcr检测试剂盒还包括川贝母阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。上述引物、探针组合物或试剂盒在鉴定川贝母及伪品中的应用。一种用于鉴定川贝母及伪品的检测方法，具体步骤如下：(1)提取待测样本模板dna并进行质量鉴定，选择靶基因，设计引物；(2)配制pcr反应液，在4通道或4通道以上的荧光定量pcr仪上，使用上述pcr检测试剂盒进行pcr扩增；(3)结果判读：设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值δrn与扩增曲线ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线ct值来判定是否为川贝母正品。作为优选的技术方案之一，步骤(1)基于dna条形码技术原理，选择its2基因作为靶基因。作为优选的技术方案之一，步骤(2)所述pcr反应液的反应体扩增体系如表1所示：表1pcr反应扩增体系试剂名称工作浓度用量(μl)终浓度taqmanmastermix2×101×引物组2～10μm10.1～0.5μm探针组合物1～5μm10.05～0.25μmdna模板0.5～50ng/μl21～100ng双蒸水6总体积20作为优选的技术方案之一，步骤(2)所述pcr扩增程序为：95℃，2min：95℃，10s；58℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环；所述的荧光定量pcr仪为任何型号的荧光定量pcr仪，根据不同型号的pcr仪的相应要求对标记荧光号进行相应的调整。本发明的有益效果：本发明以贝母的一对通用引物对待测样本dna提取物进行pcr扩增，以川贝母的特异探针、贝母通用探针及伪品贝母特异探针，利用多重多色实时荧光pcr技术，一管反应，直观、快速地鉴定出川贝母真伪。相对于sybrgreeni法可能会产生非特异性扩增或存在引物二聚体有影响的情况，产生的非特异性产物较多，会导致高背景和假阳性，本发明以特异探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且具有扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短的特点，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测dna扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，对中草药川贝母市场的健康稳定发展具有重要的意义。附图说明图1是当fam、joe荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足ct≤35说明待检样本为川贝母；图2是当rox、joe荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足ct≤35说明待检样本为伪品贝母；图3是川贝母特异探针特异性扩增曲线图，其他伪品贝母只有joe荧光修饰探针有扩增曲线；图4是伪品贝母特异探针特异性扩增曲线图，其他川贝母只有joe荧光修饰探针有扩增曲线；图5是川贝母模板分别为50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng时的灵敏度扩增曲线图；图6是贝母通用探针在贝母模板分别为50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng时的灵敏度扩增曲线图；图7是伪品贝母特异探针在伪品贝母模板分别为50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng时的灵敏度扩增曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：实验材料：暗紫贝母、平贝母、轮叶贝母、伊犁贝母、蓝花贝母、青贝、松贝、炉贝、白术、人参、党参、生地、石斛、山药、鸡血藤、枸杞、柴胡等植物。所用试剂：植物dna提取试剂盒，dna分子量makerdl2000、电泳上样缓冲液等pcr反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成；2×taqmanmastermix为dbibioscience品牌；dna测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。所用仪器：abi7500荧光定量pcr仪为abi公司产品；takarapcr仪为宝生物工程(大连)有限公司产品；5424d型高速离心机为eppendorf公司产品。实施例11、川贝母样品及伪品样本dan提取：采用植物dan提取试剂盒提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。提取的基因组dna经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定od260/od280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μl以上，说明dna纯度较高，浓度适中，符合pcr扩增要求。2、靶基因的选择和引物组、探针组合物的设计及筛选：基于dna条形码技术，选择its2基因作为靶基因，设计贝母通用引物及通用探针、川贝母特异探针，平贝母、伊犁贝母、轮叶贝母等伪品贝母的特异探针。本发明设计了一系列贝母的通用探针、川贝母及伪品贝母特异性探针，经过多次实验的不断优化和筛选，最终筛选出特异性强、扩增效率高的最优探针组合物，引物及筛选出的探针组合物的核苷酸序列见表2。表2引物和探针序列3、荧光检测：选用20μl的实时荧光pcr反应扩增体系，反应体系见表3。表3pcr反应体系试剂名称工作浓度用量(μl)终浓度taqmanmastermix2×101×通用上游引物fritillariaf5μm10.25μm通用下游引物fritillariar5μm10.25μm川贝母特异探针fritillariap11μm10.05μm伪品贝母特异探针fritillariawp2μm10.10μm贝母通用探针fritillariaup5μm10.25μmdna模板0.5～50ng/μl21～100ng双蒸水6总体积204、pcr扩增条件为：95℃，2min；95℃，10s；58℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。5、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出δrn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线ct值，根据探针荧光信号及扩增曲线ct值来判定待测样品是否为川贝母。结果见图1，fam、joe荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足ct≤35说明待检样本为川贝母正品；图2显示rox、joe荧光修饰探针同时有扩增曲线时，且满足ct≤35说明待检样本为伪品贝母。实施例2特异性验证利用本发明设计的引物和探针组合物，分别以暗紫贝母、平贝母、新疆贝母、伊犁贝母、蓝花贝母、青贝、松贝、炉贝、白术、人参、党参、生地、石斛、山药、鸡血藤、枸杞、柴胡等植物总基因组dna为模板，进行实时荧光pcr检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表4及图3和图4，结果表明本研究所设计的探针组合物及引物具有很强的特异性。表4特异性验证试验注：n为阴性实施例3灵敏度实验将川贝母的基因组dna定量到50ng，按5×梯度稀释，每个梯度均取2.0μl为模板量，(即：10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng)进行实时荧光定量pcr检测，评估本发明的检测限。结果见图5、图6、图7，表明本方法定量检测限为0.08ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。实施例4实际样本测试使用本发明提供的试剂盒及检测方法对18份贝母样品检测，并用测序结果进行验证，结果显示本方法与测序结果完全一致，本发明设计的方法，能够在1.5小时内完成对样本的准确快速鉴别，且灵敏度高，相比形态学及液相方法更加准确可靠，灵敏、快速。实际样本测试统计结果见表5。表5实际样本测试注：n为阴性上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。sequencelisting<110>山东省农业科学研究院生物技术研究中心<120>一种用于鉴定川贝母及伪品的荧光pcr检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用<130>2017<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcagaatcccgtgaaccatc20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2tccgtccaccactcgtcg18<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ccaatgacccttcgggtgcg20<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4ctcgtgtgcggcgggctt18<21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