MTHFR‑C677T、rs1801133位点基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

snp(singlenucleotidepolymorphism)：个体间基因组dna序列同一位置单个核苷酸变异所引起的多态性。snp所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，可由单个碱基转换、颠换、插入或缺失引起，并且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1％。一般来说，一个snp位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。snp是继rflp和str后的第三代分子标记，具有数量多、分布广和遗传稳定等特点。它与许多疾病直接相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。因此，snp分析对于群体遗传学、疾病相关基因的研究、新药研究、临床检验和分子诊断等领域有着重要作用。

分子信标(molecularbeacon)是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新型核酸荧光探针，其与靶序列结合会发生结构的变化从而影响荧光信号。一种在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在这种结构下，荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，所以不会产生荧光。在高温变性或之后的退火杂交过程中，这种结构被破坏，导致荧光基团远离淬灭基团，荧光便能被激发并被监测仪器探测。

叶酸(folicacid)也叫维生素b9，是一种水溶性维生素。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。叶酸在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素b12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人体缺少叶酸可导致红血球的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白血球减少。叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。如果在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可引起胎儿神经管发育缺陷，而导致畸形。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，mthfr)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，与mtrr一起，维持叶酸正常代谢。另外，还参与维持体内正常的同型半胱氨酸水平。mthfr和mtrr基因突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症。对于mthfr基因异常的人，mthfr酶活性明显降低，造成叶酸代谢障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高，这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。mthfr最常见的两个单核苷酸多态性677c>t和1298a>c，在中国人群中的发生率约为45.2％和18.6％。mtrr常见的突变位点为66a>g，在中国人群中的发生率约为25.7％。通过对叶酸代谢相关酶mthfr和mtrr基因位点进行检测，可以对个人叶酸代谢能力进行评估，可以辅助临床医生对孕妇预产期新生儿神经管缺陷以及心血管疾病发病风险进行评估，从而指导叶酸个体化使用。

mthfr(c677t，rs1801133)野生型基因型为c/c，其突变基因型有杂合子c/t和纯合子t/t两种。野生型c/c患者对药物的代谢属于正常代谢型，杂合子c/t患者对药物的代谢类型属于中等代谢型，纯合子t/t患者对药物的代谢类型属于慢代谢型。通过对mthfr(c677t)基因位点的检测，得出被测者是何种基因型，从而指导医生尽早的进行精确用药，提高药物使用有效性，降低毒副作用。

如今，叶酸代谢酶基因位点(mthfr和mtrr)的检测产品主要是通过pcr-芯片杂交法、荧光pcr法或者测序法等来实现，但这些技术需要抽取被测者的血液，再提取dna等，从抽血到提取纯化dna至少需要4个小时，整个检测过程至少要耗时8小时以上，这些方法具有有痛有创、操作复杂、洁净环境、专业操作、速度慢、时间长等特点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可在无痛环境下取样，操作简单、成本低且检测快速、时间短的mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测所涉及的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法，从而为个体化用叶酸提供指导，减小胎儿畸形风险。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的试剂盒，

包括pcr反应液；pcr反应液的原料及终浓度为，

dna聚合酶2.05u/μl；

dntps0.1-0.5mm；

5xpcr缓冲液0.5-1.5x；

mgcl21-2.5mm；

十二烷基硫酸钠0.0005-0.015％(w/v)；

聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％(w/v)；

上游引物0.2-0.7μm；

下游引物0.2-0.7μm；

突变型分子信标0.2-0.7μm；

野生型分子信标0.2-0.7μm；

且其用于检测细胞样品。

采用本发明技术方案的mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的试剂盒，以细胞为样本，以荧光分子信标法为基础，结合细胞裂解液(十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚)对mthfr-c677t、rs1801133进行检测分析。用细胞裂解液在反应过程中直接裂解细胞并释放出细胞核中dna。在现有的pcr反应中，以细胞直接作为模板的pcr反应，通常无法彻底裂解细胞，并且裂解后的细胞碎片及一些细胞内容物(如蛋白酶)对pcr反应有抑制，最终导致分型结果不稳定，甚至失败。因此，在未加裂解液的情况下，直接加入细胞作为模板，会造成细胞裂解不彻底，并且细胞裂解之后的细胞碎片以及一些蛋白酶会对pcr反应造成阻碍，造成实验失败。本发明的细胞裂解液可直接溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质对pcr反应的影响。因此在最大释放dna的同时还消除了细胞中其他成分对pcr反应的部分阻碍作用。

由实验可知，pcr反应液的原料、特异性引物及分子信标的终浓度范围为上述范围时检测结果均正确。其中，5x反应缓冲液1x的原料为5x反应缓冲液，指的是初始浓度为5倍的反应缓冲液，1x是指的应用的终浓度。

本发明具有无需采取血液样本，直接刮取口腔粘膜脱落细胞，无痛无创；无需专业人员，操作简便，简单培训，普通环境，床旁取样，方便快捷；约1小时后出结果等优点。在为被测者减少痛苦的同时，也能为医生尽早精准用药争取时间。

进一步，所述的pcr反应液的原料终浓度为：

dna聚合酶2.05u/μl；

dntps0.2mm；

5xpcr缓冲液1.1x；

mgcl22.5mm；

十二烷基硫酸钠0.005％(w/v)；

聚乙二醇辛基苯基醚0.01％(w/v)；

上游引物和下游引物的终浓度均为0.7μm；

突变型分子信标的终浓度为0.7μm；

野生型分子信标的终浓度为0.6μm。

由实验可知，pcr反应液的原料终浓度范围为上述范围时检测结果最准确，成功率最高。

进一步，所述的细胞样品为口腔黏膜脱落细胞。本发明以直接刮取的口腔黏膜脱落细胞为样本，操作方便。

进一步，还包括有提纯的人类基因组dna基因序列。试剂盒中包括质控品，为提纯的人类基因组dna基因序列，是在测定时为了做平行试验，来测定试剂结果的有效性。

本申请还提出另一个技术方案，本发明试剂盒中的mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的引物，

上游引物5’-3’的基因序列为：aagcacttgaaggagaaggt；

下游引物5’-3’的基因序列为：aaagcggaagaatgtgtcag。

本申请还提出另一个技术方案，试剂盒中引物检测的mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的分子信标，

野生型分子信标的5’-3’的基因序列为：cgtgcagaaatcggctcccgcagtgcacg；

突变型分子信标的5’-3’的基因序列为：cgcgacgaaatcg+actcccgcagacgtcgcg；

+为锁核酸修饰的碱基；

且野生型分子信标和突变型分子信标基因序列的5’端或3’端分别设有荧光基团和与荧光基团配合的淬灭基团。

本技术方案使用了分子信标分子信标，分子信标为一种在5’和3’末端可自身形成由5-8个碱基组成的发夹结构的双标记寡核苷酸分子信标。即为上述分子信标的基因序列和结构。自由状态时，发夹结构的两个末端使荧光分子与淬灭分子靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭。当分子信标与细胞的基因序列完全互补的靶标序列结合形成双链杂交体时，茎结构互补区的碱基对被分开，荧光分子和淬灭分子之间距离增大，这时分子信标的荧光几乎100％恢复。这种设计能有效地增加分子信标的特异性，提高对mthfr-c677t、rs1801133检测的正确性。

检测的原理为：在mthfr(c677t)基因突变位点两侧保守区域设计一对引物，并在突变位点序列处设计两个分子信标，mthfr(c677t)突变型分子信标、mthfr(c677t)野生型分子信标，mthfr(c677t)野生型分子信标与未突变序列结合，mthfr(c677t)突变型分子信标与突变位点序列结合。野生型分子信标、突变型分子信标5’端用荧光素标记，3’端用淬灭基团标记。然后，通过刮取口腔粘膜脱落细胞，放入检测试剂中，将试剂放入qpcr仪中，并运行pcr程序，由于pcr反应混合液中含有细胞裂解液，细胞裂解液能够充分裂解口腔黏膜脱落细胞，并释放dna，在引物和dna聚合酶等的作用下进行pcr扩增，在pcr退火阶段，野生型分子信标与未突变的序列结合，而突变型分子信标与有突变位点的序列结合，结合后，荧光基团远离淬灭基团，此时发出的荧光被实时荧光定量检测仪记录下来，从而通过荧光的颜色可判断出所检测基因的基因型。

进一步，所述的荧光基团为6-fam标记基团，所述的淬灭基团为bhq1标记基团；

或者荧光基团为alexafluor594标记基团，所述的淬灭基团为bhq2标记基团。为本发明中所使用的两种荧光基团和淬灭基团，当然，也可用其他荧光基团和与其配合的淬灭基团代替，不影响检测结果。

本申请还提出另一个技术方案，利用上述的引物、分子信标及试剂盒进行的mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测方法，操作方法为，

(1)取样前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

(2)取取样装置的取样部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次，上下为1次；

(3)取样后将取样装置的取样部插入pcr反应液中，混匀；

(4)取1μl提纯的人类基因组dna加入到另一支pcr反应液中，混匀；

(5)将完成加样的pcr反应液放入定量pcr仪中，运行反应程序。

进一步，定量pcr仪的反应程序为：

a、预变性：温度95℃，5min，1个循环；

b、变性：95℃，8s；

c、退火及延伸：58℃，35s；

d、b及c程序操作50个循环。

进一步，所述的定量pcr仪为双通道，激发波长分别为450-500nm和550-600nm。

附图说明

图1是本发明分子信标的作用原理图；

图2是本发明实施例一的第一个样品检测扩增曲线图；

图3是本发明实施例一的第二个样品检测扩增曲线图；

图4是本发明实施例一的第三个样品检测扩增曲线图；

图5是本发明实施例一的质控品的检测扩增曲线图；

图6是本发明实施例二的第一个样品检测扩增曲线图；

图7是本发明实施例二的第二个样品检测扩增曲线图；

图8是本发明实施例二的第三个样品检测扩增曲线图；

图9是本发明实施例二的质控品的检测扩增曲线图；

图10是本发明实施例三的第一个样品检测扩增曲线图；

图11是本发明实施例三的第二个样品检测扩增曲线图；

图12是本发明实施例三的第三个样品检测扩增曲线图；

图13是本发明实施例三的质控品的检测扩增曲线图；

图14是本发明实施例四的第一个样品检测扩增曲线图；

图15是本发明实施例四的第二个样品检测扩增曲线图；

图16是本发明实施例四的第三个样品检测扩增曲线图；

图17是本发明实施例四的质控品的检测扩增曲线图。

具体实施方式

以下是本发明mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测试剂盒中的各实施例的原料终浓度，实施例如表1所示：

表1

以下为本发明mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的具体操作方式：

一、细胞裂解液的配制

表1中的细胞裂解液组分浓度为pcr反应体系中的最终浓度，此浓度太小，会造成加样的不准确性。因此在配置时，可将终浓度扩大，再稀释。

所有试剂配制均在灭菌后的超净工作台进行。

(1)实施例一中200x细胞裂解液的配制

裂解液的配置方法：使用1.5ml的离心管，加入10ul十二烷基硫酸钠sds和1.88ul聚乙二醇辛基苯基醚tritonx-100，再加入988.12ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使sds的终浓度达到0.1％，使tritonx-100的终浓度达到0.2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。

(2)实施例二、实施例四中200x细胞裂解液的配制

裂解液的配置方法：使用1.5ml的离心管，加入100ulsds和18.78ultritonx-100，再加入881.22ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使sds的终浓度达到1％，使tritonx-100的终浓度达到2％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。

(3)实施例三中200x细胞裂解液的配制

使用1.5ml的离心管，加入300ulsds和56.34ultritonx-100，再加入643.66ul无核酸酶的水至总体积1000ul，使sds的终浓度达到3％，使tritonx-100的终浓度达到6％，即为200x的细胞裂解液，然后震荡混匀，-4℃保存。

上游引物5’-3’的基因序列为：aagcacttgaaggagaaggt；

下游引物5’-3’的基因序列为：aaagcggaagaatgtgtcag。

野生型分子信标5’-3’的基因序列为：

6-fam标记-cgtgcagaaatcggctcccgcagtgcacg-bhq1标记；

突变型分子信标5’-3’的基因序列为：

alexafluor594标记-cgcgacgaaatcg+actcccgcagacgtcgcg-bhq2标记；

+为锁核酸修饰的碱基。

上述原料，除特异性引物、分子信标、细胞裂解液外，均购自上海普洛麦格生物制品有限公司。特异性引物由上海占标生物科技有限公司合成；分子信标由上海占标生物技术有限公司合成。

二.pcr反应液配制

实施例一、二、三、四的反应液配制信息如表2所示，质控品测试的反应液配制如表3所示。所有配制均在灭菌后的超净工作台进行。

表2

表3

三、mthfr-c677t、rs1801133基因型检测；

每个实施例按照23.5ul的反应体系各配制9支试剂和一支质控品试剂，每个被测者检测3次重复(一次一支反应液)，该质控品的mthfr-c677t、rs1801133表型为ct。以上所指的终浓度是指各组分在23.5ul体系中的浓度，实施例四是对实施例二的重复，试剂配制完成后-20℃避光保存；

(1)取样前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾液；

(2)取出一次性使用无菌拭子(专利授权公告号：cn205359515u)及反应液，拔掉反应液塞子及拭子端盖；

(3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，实施例一、二、三、四均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜；

(4)取样后立即将拭子插入反应液中，按压顶部使其与试剂管密封，避光暂存，而后轻弹试剂管使样本与反应液充分混匀；

步骤(1)～(4)在20s内完成操作，切勿中断；

(5)用移液器取1μl质控品加入到另一支反应液中，轻弹试剂管并混匀；

(6)将完成加样的反应液放入jy-1000a型荧光pcr仪器(专利授权公告号：cn103820306b)中，并运行表4中程序。

表4

(7)得到扩增曲线和荧光颜色，分析结果。

四、结果分析：

因为人类基因组为二倍体，每一基因座位上含有两个等位基因。结果共有三种，分别为“野生cc”、“杂合ct”、“突变tt”。其中阴性结果是“cc”，阳性结果是“ct”、“tt”。

附图1是分子信标作用原理图；

实施例一的结果为：

由附图2可知：只有c线有指数增长，而t线没有指数增长，因此检测结果是野生型cc，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由附图3可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由附图4可知：只有t线有指数增长，而c线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型tt，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致叶酸代谢低；

由附图5可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，该基因型属于中等代谢型，表明所检测质控品的表型正确；

由此，可从图2、图3和图4中分析得出mthfr(c677t，rs1801133)的基因型，从而可得出，患者对叶酸的代谢类型。

实施例二的结果为：

由附图6可知：只有c线有指数增长，而t线没有指数增长，因此检测结果是野生型cc，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由附图7可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由附图8可知：只有t线有指数增长，而c线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型tt，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致叶酸代谢低；

由附图9可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，该基因型属于中等代谢型，表明所检测质控品的表型正确；

由此，可从附图6、附图7和附图8中分析得出mthfr(c677t，rs1801133)的基因型，从而可得出，患者对叶酸的代谢类型。

实施例三的结果为：

由附图10可知：只有c线有指数增长，而t线没有指数增长，因此检测结果是野生型cc，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由附图11可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由附图12可知：只有t线有指数增长，而c线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型tt，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致叶酸代谢低；

由附图13可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，该基因型属于中等代谢型，表明所检测质控品的表型正确；

由此，可从附图10、附图11和附图12中分析得出mthfr(c677t，rs1801133)的基因型，从而可得出，患者对叶酸的代谢类型。

通过上述三个实施例结果可看出，三个实施例均能正确分析出mthfr(c677t，rs1801133)的基因型，但实施例二中三种基因型荧光值均明显优于实施例一和实施例三。故确定实施例二中的pcr反应系统为最优，后期再对实施例二重复一次，即为实施例四。

实施例四的结果为：

由附图14可知：只有c线有指数增长，而t线没有指数增长，因此检测结果是野生型cc，提示所检测基因表达或活性可能正常，该基因型为正常代谢型；

由附图15可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，提示所检测基因活性可能下降，该基因型属于中等代谢型；

由附图16可知：只有t线有指数增长，而c线没有指数增长，表示检测结果是纯合变异型tt，提示所检测基因活性明显下降或可能丧失，其活性下降或丧失可能导致叶酸代谢低；

由附图17可知：c线和t线都有指数增长，表示检测结果是杂合变异型ct，该基因型属于中等代谢型，表明所检测质控品的表型正确；

由此，可从附图14、附图15和附图16中分析得出mthfr(c677t，rs1801133)的基因型，从而可得出患者对叶酸的代谢类型，其结果稳定可靠，成功率为100％。

核苷酸序列表如下：

<110>重庆京因生物科技有限责任公司

<120>mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

aagcacttgaaggagaaggt

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

aaagcggaagaatgtgtcag

<210>3

<211>29

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221misc_binding

<400>3

cgtgcagaaatcggctcccgcagtgcacg

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcgacgaaatcg+actcccgcagacgtcgcg。

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

<110>重庆京因生物科技有限责任公司

<120>mthfr-c677t、rs1801133基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

aagcacttgaaggagaaggt

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

aaagcggaagaatgtgtcag

<210>3

<211>29

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

cgtgcagaaatcggctcccgcagtgcacg

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcgacgaaatcg+actcccgcagacgtcgcg。