一种癌症联合诊断标记物及其用途的制作方法

文档序号:11193132阅读:412来源:国知局
一种癌症联合诊断标记物及其用途的制造方法与工艺
本发明属于肿瘤分子生物学领域,具体涉及一种癌症联合诊断标记物、癌症联合诊断标记物的用途,和基于其设计的引物、检测探针、检测芯片和试剂盒。
背景技术
:甲状腺癌(thyroidcarcinoma)是最常见的甲状腺恶性肿瘤,是来源于甲状腺上皮细胞的恶性肿瘤。其发病率约占全身恶性肿瘤的1.3%-1.5%,在内分泌系统疾病中排第一,是临床上的常见病、多发病,且保持逐年升高趋势。绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞,按病理类型可分为乳头状癌(60%)、滤泡状腺癌(20%)、未分化癌(15%)、髓样癌(7%)。其中乳头状癌较早出现颈淋巴结转移,但预后较好;滤泡状腺癌肿瘤生长较快,属中度恶性,易经血运转移;未分化癌预后很差,平均存活时间3-6个月。甲状腺癌的诊断与鉴别诊断目前仍是困扰临床医师的一个重要课题。随着甲状腺癌分子诊断的发展,对分化型甲状腺癌的个性化治疗渐渐走入人们的视线。然而目前在甲状腺癌中发现的一系列指征肿瘤状态的分子指标,例如:braf突变,ras(kras,hras,nras)和re-ptc重排并不足以满足临床上的需求。甲状腺癌的发病率与死亡率之间存在较大差异,甲状腺癌的病情进展相对缓慢,生存时间较长,多数甲状腺癌患者预后较好,但仍有少数甲状腺癌患者因肿瘤局部侵犯,或肿瘤远处转移而最终死于甲状腺癌。以最常见的乳头状甲状腺癌为例,其预后大多良好,但是术后10年的复发转移风险仍有约30%,并且发病机制尚不清楚。甲状腺癌转移方式一般包括三种,甲状腺癌内扩散:癌细胞沿组织间隙、淋巴管、血管侵入邻近正常的甲状腺组织;淋巴结转移:癌细胞沿胸锁乳突肌深部在颈内静脉周围及喉前、气管前淋巴结转移,患侧病变亦可转移至对侧颈淋巴结,或纵隔淋巴结或全身淋巴结;血行转移:癌细胞进入血液循环转移至全身,如肺、肝、胸腔、骨骼等处。乳头状甲状腺癌作为甲状腺癌的常见类型,其颈淋巴转移率为20%-90%。淋巴结转移的诊断与治疗在甲状腺癌诊治中具有广泛的应用价值。在人类基因组的转录本当中,90%以上的基因并不具备编码蛋白的能力,他们往往被转录成非编码rna(non-codingrna,ncrna)。依据核苷酸的长度,我们把ncrna又分为两大类:分别为核苷酸长度少于200nt的短链非编码rna和核苷酸长度大于200nt的长链非编码rna(lncrna)。lncrna一度曾被认为是基因转录时的“噪音”和“垃圾”,并不具有特定的生物学功能。随着这些年的研究发现,lncrna在多种类型肿瘤细胞的增殖、克隆、凋亡、侵袭、转移以及药物耐药等方面均发挥着重要的作用,同时由于lncrna具有显著的肿瘤组织特异性,为癌症临床诊断提供了无创、快捷和低成本的筛查手段。随着lncrna研究的兴起,人们开始关注甲状腺癌中lncrna的表达及调控方式,以期完善对甲状腺的发生发展机制的理解,实现精准医疗的目标。长链非编码rna是肿瘤早期诊断和基因治疗研究的热点,找到甲状腺癌异常表达的长链非编码rna并将其应用于诊断,具有非常重要的实用价值。《长链非编码rnah19对促进甲状腺癌转移的影响》(王龙强,武汉市中心医院甲状腺乳腺外科,中华实验外科杂志,2015)观察到了一种长链非编码rna(1ncrna)h19在甲状腺癌的进展过程中的影响。h19通过提供mir-675,结合于cdh13基因,阻断cdh13表达,进而促进甲状腺癌细胞的侵袭和迁移能力。《alongnon-codingrna,ptcsc3,asatumorsuppressorandatargetofmirnasinthyroidcancercells》鉴定了非编码rna乳头状甲状腺癌易感性候选物3(lncrnaptcsc3)。该lncrna转染甲状腺癌细胞后可引起甲状腺癌细胞增殖抑制,细胞周期阻滞和细胞凋亡增加。上述文献分别阐述了lncrnah19或lncrnaptcsc3作为甲状腺癌的分子诊断标记物的潜能,但是无论是lncrnah19还是lncrnaptcsc3,将其单独应用于甲状腺癌检测时,都存在检测的灵敏度低、特异性差的问题,在甲状腺癌的转移诊断中,易出现假阳性或假阴性,无法有效应用于甲状腺癌的诊断、预后评估或疗效监测,为临床癌症诊断和治疗提供可靠信息。技术实现要素:为此,本发明要解决的技术问题在于解决现有技术中甲状腺癌的检测标记物检测灵敏度低、特异性差,无法为甲状腺癌的诊断、预后评估或疗效监测提供有效信息;从而提供一种灵敏度高、特异性强的癌症联合诊断标记物。本发明提供了一种癌症联合诊断标记物,所述癌症联合诊断标记物包括lncrnah19和lncrnaptcsc3。所述的癌症联合诊断标记物,所述lncrnah19的cdna序列如seqidno.1所示,所述lncrnaptcsc3的cdna核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明提供了上述的癌症联合诊断标记物在制备癌症诊断、癌症预后评估和/或癌症治疗监测的试剂中的用途。所述的用途,所述癌症为甲状腺癌。所述的用途,所述癌症诊断为甲状腺癌淋巴结转移诊断。本发明提供了一种用于癌症诊断的引物组,所述引物组包括基于上述的癌症联合诊断标记物设计的引物。所述的引物组,所述引物组包括如下所述引物:lncrnah19-f,其核苷酸序列如seqidno.3所示;lncrnah19-r,其核苷酸序列如seqidno.4所示;lncrnaptcsc3-f,其核苷酸序列如seqidno.5所示;lncrnaptcsc3-r,其核苷酸序列如seqidno.6所示。lncrnah19-f’,其核苷酸序列如seqidno.7所示;lncrnah19-r’,其核苷酸序列如seqidno.8所示;lncrnaptcsc3-f’,其核苷酸序列如seqidno.9所示;lncrnaptcsc3-r’,其核苷酸序列如seqidno.10所示。本发明提供了一种用于癌症诊断的检测探针组,所述检测探针组包括基于所述的癌症联合诊断标记物设计的检测探针。所述的检测探针组,所述检测探针组包括如下所述探针:lncrnah19-p,其核苷酸序列如seqidno.11所示;lncrnaptcsc3-p,其核苷酸序列如seqidno.12所示。所述的检测探针组,所述检测探针的5’端连接有报告荧光基团,3’端连接有淬灭荧光基团;所述报告荧光基团选自fam、hex或cy5,所述淬灭荧光基团选自tamra、bhq-1、bhq-2或bhq-3。本发明提供了一种用于癌症诊断的检测芯片,所述检测芯片包括上述的检测探针。本发明提供了一种用于癌症诊断的试剂盒,所述试剂盒包括所述的引物、所述的检测探针和/或所述的检测芯片。所述的用于癌症诊断的试剂盒的使用方法,包括以下步骤:(1)提取样本总rna,将总rna反转录为cdna;(2)以cdna作为qpcr的模板,应用所述引物、所述检测探针或所述的检测芯片,分别检测样本中所述lncrnah19和所述lncrnaptcsc3的表达量。所述的用于癌症诊断的试剂盒的使用方法,所述样本选自肿瘤组织、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、眼泪或外泌体。本发明相对现有技术具有如下优点:(1)本发明提供的癌症联合诊断标记物,包括lncrnah19和lncrnaptcsc3。通过分别检测lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达量,然后利用数学方法得到两者的联合检测预测值,以联合检测预测值为变量,根据不同阈值(即变量值)对癌症诊断的特异性和灵敏度绘制roc曲线,并计算auc值,最终根据auc值、灵敏度和特异性对癌症样本进行分类,应用于癌症的诊断;将lncrnah19和lncrnaptcsc3作为标记物对癌症进行联合检测,其检测的特异性强、灵敏度高,能够有效避免单独以lncrnah19或lncrnaptcsc3基因作为癌症检测标记物时易出现的假阳性或假阴性结果,为癌症的诊断、预后或疗效监测提供可靠信息。(2)本发明提供的癌症联合诊断标记物能够应用于制备癌症诊断、癌症预后评估和/或癌症治疗监测的试剂,其中所述的癌症为甲状腺癌,所述的癌症诊断为甲状腺癌的淋巴结转移诊断。利用lncrnah19和lncrnaptcsc3基因所制备的试剂,在应用于甲状腺癌患者检测时具有准确度高的优点,能够为甲状腺癌淋巴结转移的诊断、甲状腺癌预后,以及治疗效果的评估提供重要的参考信息,便于提供及时、针对性的治疗,提高患者的存活率和生存质量。(3)本发明提供了用于癌症诊断的引物组,是基于癌症联合诊断标记物设计的,能够特异性检测lncrnah19和lncrnaptcsc3基因在细胞或组织中的表达水平,进而可以对甲状腺癌淋巴结转移进行诊断,检测的准确度高。(4)本发明提供的检测探针为荧光标记的探针,能够采用qpcr技术对lncrnah19和lncrnaptcsc3基因进行定量检测,具有特异性和灵敏度高、时间短、操作简单及效率高的优点。(5)本发明提供的癌症诊断的检测芯片,包括上述的检测探针,将其应用于检测甲状腺癌患者体内lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达情况,具有检测特异性高、灵敏度强,以及适用于大通量筛查的优点。(6)本发明提供的癌症诊断的试剂盒,包括上述的引物组、上述的检测探针和/或上述的检测芯片,能够特异性检测lncrnah19和lncrnaptcsc3基因的表达情况,检测结果准确度高,在甲状腺癌淋巴结转移、预后和疗效监测中具有较高的应用价值。(7)本发明提供的用于癌症诊断的试剂盒的使用方法,在样本检测中的用途,其中的检测样本能够取自外周血、尿液、唾液或眼泪等,具有取材方便、创伤小或无创伤,以及安全等优点。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1中所检测的lncrnah19和lncrnaptcsc3在甲状腺癌淋巴结非转移和转移患者中不同的表达水平;图2为本发明实施例2中所检测的lncrnah19和lncrnaptcsc3在甲状腺癌淋巴结非转移和转移患者中不同的表达水平;图3为本发明实施例3中lncrnah19和lncrnaptcsc3联合检测的roc曲线;图4为本发明对比例1中lncrnah19单独检测的roc曲线、lncrnaptcsc3单独检测的roc曲线,以及lncrnah19和lncrnaptcsc3联合检测的roc曲线;图5为本发明对比例2中lncrnabancr单独检测的roc曲线,以及lncrnabancr和ptcsc3联合检测的roc曲线;图6为本发明对比例3中lncrnabancr、h19和ptcsc3联合检测的roc曲线;具体实施方式以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式,除非另外说明,本发明中所公开的实验方法均采用本
技术领域
常规技术,所有引物合成由(生工生物工程(上海)股份有限公司)完成,实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。如反转录试剂盒购自takara,sybr购自takara。实施例1本实施例提供一种测定样本中lncrnah19和lncrnaptcsc3表达量的方法,具体包括以下步骤:1、样本的采集在江苏省原子医学研究所附院江原医院随机采取41例乳头状甲状腺癌患者的手术后组织样本,选取其肿瘤组织以及距离肿瘤组织1cm以上的组织作为肿瘤临近正常组织,分别检测lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达量。2、检测乳头状甲状腺癌患者的肿瘤组织和肿瘤临近正常组织中lncrnah19以及lncrnaptcsc3的表达量:1)细胞总rna的提取(1)取肿瘤组织和肿瘤临近正常组织各50mg,分别用pbs(ph为7.4)清洗,加入1mltrizol,移入1.5mlep管中,混匀,静置5min;(2)12000rpm,4℃离心10min;(3)加入200μl氯仿,剧烈摇晃15s,静置5min;(4)12000rpm,4℃离心15min;小心将上层水相移入新的1.5mlep管中,加入等体积的异丙醇,混匀后放入-20℃下1小时;(5)12000rpm,4℃离心10min,小心弃上清;(6)加入1ml的体积浓度为75%乙醇(depc水配置)洗涤沉淀,加入乙醇后,将rna沉淀弹起漂洗;(7)12000rpm,4℃离心10min,倒出液体,剩余的少量液体短暂离心,然后用枪头吸出,注意不要吸弃沉淀;(8)室温晾干,用30μl的depc(焦碳酸二乙酯)水溶解,测浓度。2)去除基因组dna的反应,使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystemkit,将步骤1)中提取的细胞总rna配制为表1所示的混合体系,将混合体系在42℃下静置2min,去除rna中混有的基因组dna。表1去除dna的反应混合体系试剂使用量5*gdnaeraserbuffer2μlgdnaeraser1μltotalrna1μgrnasefreeh2oupto10μl3)使用rtase反转录试剂盒,将冷藏储存的反转录试剂盒取出后,放置恢复至室温(20-25℃),将步骤2)中获得的组织总rna反转录为cdna,组织总rna反应液为10μl,反转录的反应程序为:37℃保持15min,85℃保持5s,4℃恒温静置,所述反转录的扩增体系如下所示:表2反转录扩增体系试剂使用量5×primescriptbuffer2μlprimescriptrtenzymemixi0.5μloligodtprimer(50μm)0.5μlrandom6mers(100m)0.5μltotalrna2μlrnasefreeddh2o4.5μl4)构建阳性标准品质粒(1)以步骤3)中所得的cdna为模板,采用lncrnah19的扩增引物lncrnah19-f和lncrnah19-r扩增得到101bp的目标片段,其中上游引物lncrnah19-f的序列如seqidno.3所示,下游引物lncrnah19-r的序列如seqidno.4所示。pcr产物纯化(qiagen,german)回收目标片段并连接到pmd18-t(购自takara)克隆载体,然后转化到dh5α感受态细胞,筛选阳性克隆提取质粒dna,得到阳性标准品pmd18-t-lncrnah19。(2)以步骤3)中所得的cdna为模板,采用lncrnaptcsc3的扩增引物lncrnaptcsc3-f和lncrnaptcsc3-r扩增得到226bp的目标片段,其中上游引物lncrnaptcsc3-f的序列如seqidno.5所示,下游引物lncrnaptcsc3-r的序列如seqidno.6所示。pcr产物纯化(qiagen,german)回收目标片段并连接到pmd18-t(购自takara)克隆载体,然后转化到dh5α感受态细胞,筛选阳性克隆提取质粒dna,得到阳性标准品pmd18-t-lncrnaptcsc3。5)反转录反应后,以步骤3)中所得的cdna为模板,选择premixextaqii试剂盒(购自takara)进行qpcr操作,检测组织中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达情况,每个样本设置至少3个平行对照组,以gapdh作为内参,同时设置ddh2o阴性对照和阳性标准品对照(pmd18-t-lncrnah19和pmd18-t-lncrnaptcsc3);lncrnah19扩增的上游引物lncrnah19-f的序列如seqidno.3所示,下游引物lncrnah19-r的序列如seqidno.4所示。lncrnaptcsc3扩增的上游引物lncrnaptcsc3-f的序列如seqidno.5所示,下游引物lncrnaptcsc3-r的序列如seqidno.6所示;内参gapdh扩增的上游引物gapdh-f序列为5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’,gapdh扩增的下游引物gapdh-r序列为5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。qpcr的反应体系i如下所示,为减少平行复孔间的人为误差,试剂需同时配置每个引物所需的总量再分加至已加入相应cdna的孔中。每孔的总体积为20μl,此过程务必在三十分钟内完成:表3qpcr反应体系i用微孔板盖盖好板或是用相应的封口膜封住96孔板,离心使得所加试剂均位于孔板底部,孔壁上无残留;荧光定量pcr使用abi公司开发的实时荧光定量pcr仪进行检测。反应程序为:95℃保持30s,(95℃保持15s,60℃保持30s),40个循环,60℃保持5min。癌症组织和正常组织中lncrnah19和lncrnaptcsc3的检测结果如图1所示,甲状腺淋巴结转移患者中的lncrnah19表达量高于甲状腺淋巴结转移非转移的患者,而甲状腺淋巴结转移患者中的lncrnaptcsc3表达量低于甲状腺淋巴结转移非转移的患者,表明lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达水平与甲状腺癌淋巴结转移具有密切的相关性。实施例2本实施例提供一种应用检测探针测定样本中lncrnah19和lncrnaptcsc3表达量的方法,具体包括以下步骤:1)构建阳性标准品质粒应用实施例1中所示的阳性标准品质粒的构建方法,利用引物lncrnah19-f’和lncrnah19-r’扩增lncrnah19片段,连接至pmd18-t,得到阳性标准品质粒pmd18-t-lncrnah19-2;利用引物lncrnaptcsc3-f’和lncrnaptcsc3-r’扩增lncrnaptcsc3片段,连接至pmd18-t,得到阳性标准品质粒pmd18-t-lncrnaptcsc3-2。2)以实施例1中所得的cdna为模板,选择premixextaqtm试剂盒(购自takara)进行qpcr操作,检测组织中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达情况,每个样本设置至少3个平行对照组,以gapdh作为内参,同时设置ddh2o阴性对照和阳性标准品对照(pmd18-t-lncrnah19-2和pmd18-t-lncrnaptcsc3-2);lncrnah19的检测探针lncrnah19-p的序列如seqidno.11所示,探针5’端标记fam,3’端标记tamra;lncrnah19扩增的上游引物lncrnah19-f’的序列如seqidno.7所示,下游引物lncrnah19-r’的序列如seqidno.8所示。lncrnaptcsc3的检测探针lncrnaptcsc3-p的序列如seqidno.12所示,探针5’端标记fam,3’端标记tamra;lncrnaptcsc3扩增的上游引物lncrnaptcsc3-f’的序列如seqidno.9所示,下游引物lncrnaptcsc3-r’的序列如seqidno.10所示;内参gapdh的检测探针gapdh-p序列为5’-gtgctaagcagttggtggtgcagga-3’,探针5’端标记fam,3’端标记tamra;gapdh扩增的上游引物gapdh-f序列为5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’,gapdh扩增的下游引物gapdh-r序列为5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。qpcr的反应体系ii如下所示,为减少平行复孔间的人为误差,试剂需同时配置每个引物所需的总量再分加至已加入相应cdna的孔中。每孔的总体积为20μl,此过程务必在三十分钟内完成:表4qpcr反应体系ii试剂使用量premixextaq(2×)10μlpcrforwardprimer,10μm0.4μlpcrforwardprimer,10μm0.4μl荧光探针,10μm0.8μlroxreferencedye(50×)0.4μlcdna模板2μlddh2o6.0μltotal20μl用微孔板盖盖好板或是用相应的封口膜封住96孔板,离心使得所加试剂均位于孔板底部,孔壁上无残留;荧光定量pcr使用abi公司开发的实时荧光定量pcr仪进行检测。反应程序为:95℃保持30s,(95℃保持15s,60℃保持30s),40个循环,60℃保持5min。癌症组织和正常组织中lncrnah19和lncrnaptcsc3的检测结果同实施例1中的检测结果如图2所示:甲状腺淋巴结转移患者中的lncrnah19表达量高于甲状腺淋巴结转移非转移的患者,而甲状腺淋巴结转移患者中的lncrnaptcsc3表达量低于甲状腺淋巴结转移非转移的患者,进一步验证了lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达水平与甲状腺癌淋巴结转移具有密切的相关性。实施例3本实施例提供一种联合检测样本中的lncrnah19和lncrnaptcsc3,以提高样本分类准确性的方法,具体包括以下步骤:1、用qpcr分别检测出样本中与甲状腺癌淋巴结转移具有密切相关性的lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达量。2、用数学分析方法对步骤1中测得的样本中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达情况进行统计学处理,在此基础上获得具有样本分类意义的分级标准。这样的数学方法优选由计算机完成,本实施例中用这些数据绘制roc曲线,从而对个体的样本进行分类。roc曲线全称为受试者工作特征曲线(receiveroperatorcharacteristiccurve),又称为接收者操作特性曲线,主要用于临床生化诊断试验。roc曲线是反映真阳性率(灵敏度,又称敏感性,sensitivity)和假阳性率(1-特异性,specificity)连续变量的综合指标,是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值(阈值或临界值,cut-offvalue,是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量,从而计算出一系列灵敏度和特异性,再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制的曲线,曲线下面积(auc)越大,诊断准确性越高。在roc曲线上,最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值。roc曲线auc值在1.0和0.5之间。在auc>0.5的情况下,auc越接近于1,说明诊断效果越好。auc在0.5~0.7时有较低准确性,auc在0.7~0.9时有一定准确性,auc在0.9以上时有较高准确性。roc曲线的评价方法与传统的评价方法不同,根据实际情况,允许有中间状态,可以把试验结果分为多个有序分类,比如:正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级。上述有序分类,对于疾病的诊断而言,可分为:阴性、不确定、阳性。进一步地,对于甲状腺癌诊断而言,可分为:转移、不转移。本实施例中的具体检测步骤如下:(1)分别测定样本中lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达量;(2)根据所测得的lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达量通过二分类logistic回归计算新的联合检测预测值;(3)以联合检测预测值为变量,根据不同的阈值(也即联合检测预测值)对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出roc曲线,并计算曲线下面积auc;(4)按照期望的灵敏度和特异性,对测定样本进行分类(转移或不转移)。roc曲线的绘制可以使用现有
技术领域
的软件或系统,比如=medcalc9.2.0.1医学统计软件、spss9.0、r0cp0wer.sas、designr0c.for、multireader_p0wer.sas,create—roc.sas>gbstatv10.0(dynamicmicrosystems,inc.silverspring,md,usa)等等。本实施例中以lncrnah19和lncrnaptcsc3的表达量所计算的联合检测预测值为变量,使用spss软件绘制的roc曲线并计算曲线下面积(auc)。roc曲线如图3所示,联合检测lncrnah19和lncrnaptcsc3诊断甲状腺癌淋巴结转移的auc=0.79,p<0.01。当阈值为0.33(联合检测预测值)时,诊断甲状腺癌淋巴结转移的灵敏度为0.67,特异性为0.89,实际诊断甲状腺癌淋巴结转移的准确性好。将lncrnah19和lncrnaptcsc3作为甲状腺癌淋巴结转移的联合诊断标记物,具有特异性强、灵敏度高的优点,应用其检测甲状腺癌淋巴结转移,能够显著提高检测结果的准确性,为甲状腺癌患者的诊断、预后,以及治疗效果的评估提供重要的参考信息,便于提供及时、针对性的治疗,提高患者的存活率和生存质量,因此联合检测h19和ptcsc3具有很大的开发价值。实施例4本实施例提供了一种用于癌症诊断的试剂盒,试剂盒包括:(1)分别用于检测lncrnah19和lncrnaptcsc3的引物,具体的为实施例2中所述的用于检测lncrnah19表达量的上游引物lncrnah19-f和下游引物lncrnah19-r,以及检测lncrnaptcsc3表达量的上游引物lncrnaptcsc3-f和下游引物lncrnaptcsc3-r;上述的试剂盒还包括:(2)qpcr反应混合液i,qpcr反应混合液i包括实施例1中表3所示的反应体系;(3)lncrnah19标准品i,实施例1中构建的载体pmd18-t-lncrnah19或包括上述载体的基因工程菌;(4)lncrnaptcsc3标准品i,实施例1中构建的载体pmd18-t-lncrnaptcsc3或包括上述载体的基因工程菌;(5)内参gapdh以及内参的检测引物gapdh-f、gapdh-r,gapdh-f:5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’、gapdh-r:5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。本发明提供的试剂盒能够应用于肿瘤组织、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、眼泪或外泌体中lncrnah19和lncrnaptcsc3表达量的检测,进一步,由于lncrnah19和lncrnaptcsc3作为联合诊断标记物具有检测的灵敏度高和特异性强的优点,本实施例提供的试剂盒能够对测定样本是否为甲状腺癌淋巴结转移进行有效的判定;进而为甲状腺癌淋巴结转移的诊断、甲状腺癌的预后或治疗效果的监测提供可靠的信息。实施例5本实施例提供了一种用于癌症诊断的试剂盒,试剂盒包括:(1)分别用于检测lncrnah19和lncrnaptcsc3的检测探针与扩增引物,具体地为实施例2中提供的检测探针lncrnah19-p、lncrnaptcsc3-p、lncrnah19的扩增引物lncrnah19-f’和lncrnah19-r’,以及lncrnaptcsc3的扩增引物lncrnaptcsc3-f’和lncrnaptcsc3-r’;上述的试剂盒还包括:(2)qpcr反应混合液ii,qpcr反应混合液ii包括实施例2中表4所示的反应体系;(3)lncrnah19标准品ii,实施例2中构建的载体pmd18-t-lncrnah19-2或包括上述载体的基因工程菌;(4)lncrnaptcsc3标准品ii,实施例2中构建的载体pmd18-t-lncrnaptcsc3-2或包括上述载体的基因工程菌;(5)内参gapdh以及内参的检测探针gapdh-p和扩增引物gapdh-f、gapdh-r,gapdh-p:5’-gtgctaagcagttggtggtgcagga-3’,gapdh-f:5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’、gapdh-r:5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’。本发明提供的试剂盒能够应用于肿瘤组织、全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、眼泪或外泌体中lncrnah19和lncrnaptcsc3表达量的检测,由于lncrnah19和lncrnaptcsc3作为联合诊断标记物具有检测的灵敏度高和特异性强的优点,本实施例提供的试剂盒能够对测定样本是否为甲状腺癌淋巴结转移进行有效的判定;进而为甲状腺癌淋巴结转移的诊断、甲状腺癌的预后或治疗效果的监测提供可靠的信息。对比例1使用spss软件分别对lncrnah19和lncrnaptcsc3测量值为变量,根据不同的阈值对淋巴结转移诊断的灵敏度和特异性绘制出roc曲线,并计算曲线下各自面积auc;绘制出roc曲线并计算曲线下面积(auc)。如图4所示,lncrnah19和lncrnaptcsc3诊断甲状腺癌淋巴结转移的auc值分别如下:lncrnah19auc=0.56;p=0.54和lncrnaptcsc3auc=0.61;p=0.27。因此,单独以lncrnah19或lncrnaptcsc3作为标记物检测甲状腺癌淋巴结转移,标记物的灵敏度和特异性低,检测的准确性低,易出现假阳性或假阴性的检测结果。因此,lncrnah19或lncrnaptcsc3的单独检测无法指示乳头状甲状腺癌淋巴结转移。对比例2以bancr单独测量值为变量,并使用spss软件对bancr和lncrnaptcsc3测量值进行线性回归处理得到两者联合检测的预测率,再以此预测率为变量,根据不同的阈值对淋巴结转移诊断的灵敏度和特异性绘制出roc曲线,并计算曲线下面积auc;绘制出roc曲线并计算曲线下面积(auc),如图5所示,单独检测bancr和联合检测bancr和ptcsc3诊断甲状腺癌淋巴结转移的auc分别为:bancrauc=0.60,p=0.28;联合检测bancr和lncrnaptcsc3的auc=0.61,p=0.24。相比联合检测lncrnah19和lncrnaptcsc3,单独检测bancr和联合检测bancr和lncrnaptcsc3均不能有效地指示乳头状甲状腺癌淋巴结转移。对比例3使用spss软件对bancr、lncrnaptcsc3和lncrnah19测量值进行线性回归处理得到两者联合检测的预测率,以此预测率为变量,根据不同的阈值对淋巴结转移诊断的灵敏度和特异性绘制出roc曲线,并计算曲线下面积auc;绘制出roc曲线并计算曲线下面积(auc),如图6所示联合检测bancr、lncrnaptcsc3和lncrnah19诊断甲状腺癌淋巴结转移的auc=0.62,p=0.19。因此,联合检测lncrnaptcsc3和lncrnah19的检测准确性优于联合检测bancr、lncrnaptcsc3和lncrnah19,将lncrnaptcsc3和lncrnah19作为诊断甲状腺癌淋巴结转移的联合标记物,有利于甲状腺癌淋巴结转移的诊断、预后,以及甲状腺癌治疗效果的监测。显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。sequencelisting<110>江苏原子医学研究所<120>一种癌症联合诊断标记物及其用途<130>wxha201700008<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>2362<212>dna<213>人工序列<400>1agttagaaaaagcccgggctaggaccgaggagcagggtgagggagggggtgggatgggtg60gggggtaacgggggaaactggggaagtggggaaccgaggggcaaccaggggaagatgggg120tgctggaggagagcttgtgggagccaaggagcaccttggacatctggagtctggcaggag180tgatgacgggtggaggggctagctcgaggcagggctggtggggcctgaggccagtgagga240gtgtggagtaggcgcccaggcatcgtgcagacagggcgacatcagctggggacgatgggc300ctgagctagggctggaaagaagggggagccaggcattcatcccggtcacttttggttaca360ggacgtggcagctggttggacgaggggagctggtgggcagggtttgatcccagggcctgg420gcaacggaggtgtagctggcagcagcgggcaggtgaggaccccatctgccgggcaggtga480gtcccttccctccccaggcctcgcttccccagccttctgaaagaaggaggtttaggggat540cgagggctggcggggagaagcagacaccctcccagcagaggggcaggatgggggcaggag600agttagcaaaggtgacatcttctcggggggagccgagactgcgcaaggctggggggttat660gggcccgttccaggcagaaagagcaagagggcagggagggagcacaggggtggccagcgt720agggtccagcacgtggggtggtaccccaggcctgggtcagacagggacatggcaggggac780acaggacagaggggtccccagctgccacctcacccaccgcaattcatttagtagcaggca840caggggcagctccggcacggctttctcaggcctatgccggagcctcgagggctggagagc900gggaagacaggcagtgctcggggagttgcagcaggacgtcaccaggagggcgaagcggcc960acgggaggggggccccgggacattgcgcagcaaggaggctgcaggggctcggcctgcggg1020cgccggtcccacgaggcactgcggcccagggtctggtgcggagagggcccacagtggact1080tggtgacgctgtatgccctcaccgctcagcccctggggctggcttggcagacagtacagc1140atccaggggagtcaagggcatggggcgagaccagactaggcgaggcgggcggggcggagt1200gaatgagctctcaggagggaggatggtgcaggcaggggtgaggagcgcagcgggcggcga1260gcgggaggcactggcctccagagcccgtggccaaggcgggcctcgcgggcggcgacggag1320ccgggatcggtgcctcagcgttcgggctggagacgaggccaggtctccagctggggtgga1380cgtgcccaccagctgccgaaggccaagacgccaggtccggtggacgtgacaagcaggaca1440tgacatggtccggtgtgacggcgaggacagaggaggcgcgtccggccttcctgaacacct1500taggctggtggggctgcggcaagaagcgggtctgtttctttacttcctccacggagtcgg1560cacactatggctgccctctgggctcccagaacccacaacatgaaagaaatggtgctaccc1620agctcaagcctgggcctttgaatccggacacaaaaccctctagcttggaaatgaatatgc1680tgcactttacaaccactgcactacctgactcaggaatcggctctggaaggtgaagctaga1740ggaaccagacctcatcagcccaacatcaaagacaccatcggaacagcagcgcccgcagca1800cccaccccgcaccggcgactccatcttcatggccaccccctgcggcggacggttgaccac1860cagccaccacatcatcccagagctgagctcctccagcgggatgacgccgtccccaccacc1920tccctcttcttctttttcatccttctgtctctttgtttctgagctttcctgtctttcctt1980ttttctgagagattcaaagcctccacgactctgtttcccccgtcccttctgaatttaatt2040tgcactaagtcatttgcactggttggagttgtggagacggccttgagtctcagtacgagt2100gtgcgtgagtgtgagccaccttggcaagtgcctgtgcagggcccggccgccctccatctg2160ggccgggtgactgggcgccggctgtgtgcccgaggcctcaccctgccctcgcctagtctg2220gaagctccgaccgacatcacggagcagccttcaagcattccattacgccccatctcgctc2280tgtgcccctccccaccagggcttcagcaggagccctggactcatcatcaataaacactgt2340tacagcaaaaaaaaaaaaaaaa2362<210>2<211>1152<212>dna<213>人工序列<400>2aaactccttcagacttctcagtactcaagacatctcaagtttttgaagagtaaagtataa60aatactggcaggggtgggtagggggaacaggataaattggtgatggcccagaaaaaatat120ccagggggatcgcatttttcttctccaaagcaaaacagaattcataactgaaagaggaat180agagaaagaggaaaaaagtgatctgggacctgttgtttttcttgcatcccatttctactc240tgcctgtgagtgaagactgttgtggaaaagtcaactggagagaccaggtcaaaggccaag300cagaagaggaattaggcttaagactgcactgagagggaacactagaccatggtggcaaaa360tggccgaataggagcagctccagtctacagctcccagggagattaatgcaaaagatggag420tctcgacacgttgcccaagctgttctcaaactccagggcttgaacaatcttcccaccttg480gcctcccaaggcactggaattacagagacagtgctctgcagggagtctaccactgtgatg540gttaatactgagtgtcaacttgattggattgaaggatgcaaagtattgttcctgggtgtg600tctgtgagggtgttgccaaaggagattaacatttgagtcagtgggctgggaaaggtagac660ccagccgtaatctaggtgggcaccatctaatcagctgccagcacagctagaagataaagt720aggcagaaaaacatgaaaacattagactggcctagcctctgagcctacatctttctccca780tgctggatgctccctgcccttgaacatcagactccaagtttttcagttttgggactggga840ctcactatccttgctcctcagcttgcagacagcctattgtgggaccttatgatcatgtga900gttaatacttaatacataaatatatatatatacacacacacatatacacacacacacaca960catatatatatacacacacacacacatatatatatatatctgtccctctagagaaccctg1020actaatacaactactaataaaaattggggcaaaagacattgattgggtattgtaagtagg1080ttatgctcacagtagcaatatctcttaagactttttaaaagacttcctaataaaagagat1140ttaaaatacagc1152<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3tgctgcactttacaaccactg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4atggtgtctttgatgttgggc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tcaaactccagggcttgaac20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6attacggctgggtctacct19<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7ccagccaccacatcatcccaga22<210>8<211>26<212>dna<213>人工序列<400>8ctccctcttcttctttttcatccttc26<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列<400>9tgaacatcagactccaagtttttc24<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10cagcctattgtgggaccttat21<210>11<211>13<212>dna<213>人工序列<400>11gggatgacgccgt13<210>12<211>16<212>dna<213>人工序列<400>12tcactatccttgctcc16当前第1页12
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