单管巢式PCR反应体系和扩增方法与流程

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种单管巢式pcr扩增方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)是用于扩增dna链的特定区域的技术。dna链可以是单个基因、基因的仅仅一部分或非编码序列。大部分pcr方法通常扩增多达10k碱基对(kilobasepair，kb)的dna片段，但一些技术允许扩增大小达40kb的片段(cheng等，1994，procnatlacadsci.91：5695-5699)。

现有技术为提高pcr扩增特异性提供了一种巢式pcr扩增方法。巢式pcr扩增反应在两个接连的反应中使用两组不同引物。在一扩反应中，使用第一引物对靶标区域dna片段进行一阶段pcr扩增产生中间产物，该中间产物可能还含有从非靶标区域扩增的产物。然后将中间产物用于起始二扩反应，所述二扩反应使用第二引物对靶标区域dna片段进行二阶段pcr扩增产生目标产物。通常，第二引物对的结合位点位于第一引物对以内。巢式pcr通常在一个试管中进行一扩反应，然后将中间产物的等分试样转移到第二试管中进行二扩反应。现有技术巢式pcr扩增方法的中间产物在两个试管之间移转会增加扩增产物对环境的污染，甚至导致后续试验结果出现严重偏差。因此，急需一种单管巢式pcr扩增方法，用于消除现有技术巢式pcr扩增方法的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种单管巢式pcr扩增方法，用于克服双管巢式pcr扩增方法的技术问题。

一种单管巢式pcr反应体系，其包括双链dna模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补，所述外引物用于在第一退火温度下对变性解链的dna模板扩增并获得中间产物，所述内引物用于在第二退火温度下对变性解链的中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度下形成引物双链结构。

进一步的，所述引物双链结构包括引物发卡结构或引物二聚体结构。

进一步的，所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物双链结构为第一外引物和第二外引物之间形成的双链结构。

进一步的，所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物发卡结构包括第一外引物或第二外引物自身形成的双链结构。

进一步的，所述第一退火温度的范围可以是65-72℃，所述第二退火温度的范围是50-62℃。

进一步的，所述第一退火温度为65度，所述第二退火温度为52度。

一种单管巢式pcr扩增方法，其包括：

建立反应体系，所述反应体系中包括双链dna模板、外引物对和内引物对，所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补；

进行一扩反应，在第一退火温度下通过外引物对实现对变性解链的dna模板扩增并获得中间产物；

进行二扩反应，在第二退火温度下通过内引物对中间产物扩增并获得目标产物，所述外引物在第二退火温度形成引物双链结构。

进一步的，所述引物双链结构包括引物发卡结构或引物二聚体结构。

进一步的，所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物双链结构为第一外引物和第二外引物之间形成的双链结构。

进一步的，所述外引物对包括第一外引物和第二外引物，所述引物发卡结构包括第一外引物或第二外引物自身形成的双链结构。

相对于现有技术，本发明单管巢式pcr扩增方法构建的反应体系中，外引物的5’端包括互补序列，其在二扩反应阶段较低退火温度例如52℃时，会相互自连接形成引物双链结构，所述引物双链结构可以是引物发卡结构，例如第一外引物之间形成的二聚体或第二外引物之间形成的二聚体，也可以是引物之间二聚体，例如第一外引物和第二外引物之间形成的二聚体。因此二扩反应阶段只有内引物对才可正常工作对中间产物进行扩增形成目标产物。本发明的单管巢式pcr扩增方法反应体系构建简单，反应过程无需将中间产物重新分装，不仅减少了现有技术巢式pcr扩增方法的技术问题，还保证了单管扩增后目标产物的纯度较高。

附图说明

图1为本发明单管单管巢式pcr扩增方法的反应原理图。

图2为实验一结果的page胶电泳图。

图3为实验二结果的page胶电泳图。

图4为实验三结果的page胶电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

请参考图1，本发明提供一种单管巢式pcr扩增方法，包括以下步骤：

s1，建立反应体系，所述反应体系包括双链dna模板、外引物对和内引物对。所述外引物从5’端到3’端包括互补序列和靶区结合序列，所述靶区结合序列远离互补序列的末端与所述互补序列的碱基互补。所述外引物的靶区结合序列用于在第一退火温度下对变性解链的dna模板扩增形成中间产物，所述内引物用于在第二退火温度下对变性解链的中间产物扩增形成目标产物，所述外引物对的互补序列用于在第二退火温度下与靶区结合序列形成引物双链结构,所述引物双链结构可以是引物发卡结构，也可以是引物二聚体结构。本实施例中，s1步骤构建的反应体系可以制成单管巢式pcr扩增试剂盒。

s2，进行一扩反应，在第一退火温度下通过外引物对对变性解链的dna模板扩增，获得中间产物。本实施例中，所述第一退火温度高于60度，较佳地，所述第一退火温度的范围可以是65-72℃。

s3,进行二扩反应，在第二退火温度下通过内引物对对变性解链的中间产物模板扩增，获得目标产物，所述外引物的互补序列和靶区结合序列在第二退火温度下形成引物双链结构。本实施例中，所述第二退火温度的范围可以是50-62℃，较佳地，所述第二退火温度比第一退火温度低10-15℃。本实施例中，所述外引物的互补序列和靶区结合序列形成引物双链结构的温度范围可以是45-57℃，较佳地，所述外引物的互补序列和靶区结合序列形成引物双链结构的温度比内引物对的第二退火温度低0-5℃。

一实施例中，以扩增mthfr基因rs1801133位点的片段为例，分别提供三种外引物对进行实验对照。

第一外引物对用于现有技术巢式pcr的反应体系，其包括第一外引物seqidno:1、第二外引物seqidno:2，第一引物对的第一外引物seqidno:1和第二外引物seqidno:2没有设置互补序列。第一引物对引物序列及工作退火温度可参考下表1。

第二外引物对用于本发明单管巢式pcr扩增的一个实施例，其包括第一外引物seqidno:3、第二外引物seqidno:4，第一外引物seqidno:3和第二外引物seqidno:4在第二退火温度49.5℃下可形成引物二聚体结构，第二外引物对的相关引物序列及工作退火温度可参考下表2。第二外引物对的引物二聚体结构形成的方式为：所述第一外引物seqidno:3的互补序列gagtgctgag在第二退火温度49.5℃下与第二外引物seqidno:4的靶区结合序列末端ctcagcactc形成引物双链结构。所述第二外引物seqidno:4的互补序列cttgcacc在第二退火温度49.5℃下与第一外引物seqidno:3的靶区结合序列末端ggtgcaag形成引物双链结构。

第三外引物对用于本发明单管巢式pcr扩增的另一实施例，其包括第一外引物seqidno:5、第二外引物seqidno:6，第一外引物seqidno:5和第二外引物seqidno:6在第二退火温度53.8℃和51.3℃下可分别形成引物发卡结构，第三外引物对的相关引物序列及工作退火温度可参考下表3。第三外引物对的引物发卡结构形成的方式为：所述第一外引物seqidno:5的互补序列cttgcac在第二退火温度53.8℃下与自身序列末端gtgcaag形成引物发卡结构。所述第二外引物seqidno:6的互补序列gagtgc在第二退火温度51.3℃下与自身的靶区结合序列末端gcactc形成引物发卡结构。

试验一

实验目的：验证上述三种外引物对的扩增效果，确认上述三种外引物对在高温退火条件下可正常扩增目标基因片段。

体系配置：用上述三种外引物对分别在三个试管中配置三个反应体系，每个反应体系配置参见下表4，每个反应体系包括：longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；25ng/μl的人类全血dna分子1.0μl；10μmol/l的第一外引物0.4μl；10μmol/l的第二外引物0.4μl；8.2μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应条件：94℃条件下持续4分钟，一个循环；94℃条件下持续20秒，65℃条件下持续20秒，72℃条件下持续30秒，一共30个循环；72℃条件下持续3分钟一个循环，获得目标产物，目标产物保存于10℃环境中，具体参考表5。

电泳结果：如图2所示泳道1,3,5为各引物对的空白，泳道2,4,6为各引物对的基因组扩增产物。seqidno:1和seqidno:2：439bp；seqidno:3和seqidno:4：457bp；seqidno:5和seqidno:6：452bp，图2电泳结果说明所述三种外引物对在高温退火下都能正常扩增mthfr基因rs1801133位点的片段，获得对应基因片段扩增后的目标产物。

试验二

实验目的：验证各外引物对在第二退火温度下对二扩反应的干扰。

体系配置：取巢式pcr一扩反应的产物（中间产物）的稀释液作为二扩反应的模板，不同试管中加入不同浓度的外引物对和固定浓度的内引物对构建多个反应体系，每个反应体系的不同之处仅在于外引物对和浓度不同，具体配置参见下表6。

反应体系一、五、九为外引物空白对照，分别包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；空白对照一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；10μmol/l的第一外引物seqidno:10.4μl；10μmol/l的第二外引物seqidno:20.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系二包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；10μmol/l的第一外引物seqidno:10.4μl；10μmol/l的第二外引物seqidno:20.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系三包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；1μmol/l的第一外引物seqidno:10.4μl；1μmol/l的第二外引物seqidno:20.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系四包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；0.1μmol/l的第一外引物seqidno:10.4μl；0.1μmol/l的第二外引物seqidno:20.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系六包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；10μmol/l的第一外引物seqidno:30.4μl；10μmol/l的第二外引物seqidno:40.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系七包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；1μmol/l的第一外引物seqidno:30.4μl；1μmol/l的第二外引物seqidno:40.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系八包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；0.1μmol/l的第一外引物seqidno:30.4μl；0.1μmol/l的第二外引物seqidno:40.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系十包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；10μmol/l的第一外引物seqidno:50.4μl；10μmol/l的第二外引物seqidno:60.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系十一包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；1μmol/l的第一外引物seqidno:50.4μl；1μmol/l的第二外引物seqidno:60.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应体系十二包括longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；一扩反应的产物稀释液（稀释100倍）1.0μl；0.1μmol/l的第一外引物seqidno:50.4μl；0.1μmol/l的第二外引物seqidno:60.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中。

反应条件：94℃条件下持续2分钟，一个循环；94℃条件下持续10秒，52℃条件下持续20秒，72℃条件下持续10秒，一共30个循环；72℃条件下持续3分钟一个循环，获得目标产物，目标产物保存于10℃环境中，具体参考表7。

电泳结果：如图3所示，泳道1,5,9:各外引物对的空白；泳道2,6,10：外引物浓度为10um的扩增产物；泳道3,7,11：外引物浓度为1um的扩增产物；泳道4,8,12：外引物浓度为0.1um的扩增产物。泳道1-4为普通引物对seqidno:1和seqidno:2的结果，高浓度时主要为439bp产物，随浓度降低其他产物逐渐增加，目的产物占少数；泳道5-8为引物对seqidno:3和seqidno:4的结果，高浓度时略微有其他产物，主产物为目的产物；泳道9-12为引物对seqidno:5和seqidno:6的结果，高浓度时略微有其他产物，主产物为目的产物。图3所示结果说明第二外引物对seqidno:3、seqidno:4和第三外引物对seqidno:5、seqidno:6在低温退火下能形成引物双链结构并显著降低对二扩反应的干扰。

实验三

实验目的：验证本发明一管式巢式pcr的扩增效果。

体系配置：用上述三种外引物对分别在三个试管中配置三个反应体系，每个反应体系包括：longtaq混合液（深圳华因康基因科技有限公司生产）10μl；25ng/μl的人类全血dna分子1.0μl；10μmol/l的第一外引物0.4μl；10μmol/l的第二外引物0.4μl；10μmol/l的第一内引物seqidno:70.4μl；10μmol/l的第二内引物seqidno:80.4μl；7.4μl去离子水；混匀并离心，然后将离心管置于pcr仪中,每个反应体系配置参见下表8。

反应条件：94℃条件下持续4分钟，一个循环；94℃条件下持续20秒，65℃条件下持续20秒，72℃条件下持续30秒，一共15个循环；72℃条件下持续3分钟一个循环，获得中间产物，一扩反应结束。然后94℃条件下持续2分钟，一个循环；94℃条件下持续10秒，52℃条件下持续20秒，72℃条件下持续10秒，一共25个循环；72℃条件下持续3分钟一个循环，二扩反应结束，获得目标产物保存于10℃环境中，具体参考表9。

电泳结果：如图4所示泳道1,3,5：各引物对的空白，泳道2,4,6：各引物对的基因组扩增产物。seqidno:1和seqidno:2：显示四条带；seqidno:3和seqidno:4：显示为目的带；seqidno:5和seqidno:6：显示为目的带，图4电泳结果说明具有互补序列的外引物对较普通外引物能更好的实现一管式巢式pcr的扩增。

相对于现有技术，本发明单管巢式pcr扩增方法构建的反应体系中，外引物的5’端包括互补序列，其在二扩反应阶段较低退火温度例如52℃时，会相互自连接形成引物双链结构，所述引物双链结构可以是引物发卡结构，例如第一外引物之间形成的二聚体或第二外引物之间形成的二聚体，也可以是引物之间二聚体，例如第一外引物和第二外引物之间形成的二聚体。因此二扩反应阶段只有内引物对才可正常工作对中间产物进行扩增形成目标产物。本发明的单管巢式pcr扩增方法反应体系构建简单，反应过程无需将中间产物重新分装，不仅减少了现有技术巢式pcr扩增方法的技术问题，还保证了单管扩增后目标产物的纯度较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>广州康昕瑞基因健康科技有限公司

<120>单管巢式pcr反应体系和扩增方法

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