本发明属于抗癌药物技术领域，具体涉及2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物及其盐类化合物、制备方法和应用。
背景技术：
癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病之一。近30年来，我国癌症发生率正处于快速上升期，癌症发病率约为200/10万人，每年新发病例达320万例以上，死亡约270多万，在治患者700万人以上。
目前癌症的主要治疗手段仍然是手术治疗、放射治疗及药物治疗，但在很大程度上仍是以药物治疗为主。因此，研究开发新的抗癌药物具有重要意义。
传统的抗肿瘤药物活性强，但缺乏选择性，毒性大。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的进展，对肿瘤发病机理有了更多的认识，找到了许多抗癌药物作用的新靶点，如表皮生长因子(egfr)酪氨酸激酶、pi3ks，btk等。
在多数肿瘤细胞中，一些激酶呈现高表达或过度激活。针对这一特点，已经开发了吉非替尼、伊马替尼、埃罗替尼、埃克替尼、索拉非尼、舒尼替尼和拉帕替尼等激酶抑制剂，用作抗癌药物。但是，吉非替尼等药物应用于临床后发现其有效率并不高，有些患者使用后产生获得性耐药。因此，研发新的高效低毒的抗癌药物具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物及其盐和应用。该类化合物结构新颖，具有显著的抑制egfr酪氨酸激酶的活性，具有明显的体内、外抗肿瘤活性，可应用于抗癌药物制剂的制备，而且其合成原料易得、合成方法容易实现。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物，该化合物的结构式为：
式中，r1为取代氨基；
r2为芳基、取代的芳基、芳杂环基、取代的芳杂环基、环烷基、饱和杂环基或取代的甲基，其中，取代的甲基中的取代基为芳基、取代的芳基、芳杂环基、取代的芳杂环基、环烷基或饱和杂环基；
r3为取代氨基；
x为nh或o。
优选地，所述r1为二甲基氨基、二乙基氨基、1-吡咯烷基、1-哌啶基、4-吗啉基、丙烯酰氨基取代的-1-吡咯烷基、丙烯酰氨基取代的-1-哌啶基、1-丙烯酰基取代的吡咯烷基氨基或者丙烯酰基取代的哌啶基氨基。
优选地，所述r2中，芳基为苯基；取代的芳基为氟和/或氯取代的苯基、三氟甲基取代的苯基或者甲氧基取代的苯基；杂芳基为吡唑基、咪唑基或吡啶基；取代的杂芳基为1-烷基取代的吡唑基或取代的吡啶；环烷基为环己基或环戊基；饱和杂环基为四氢吡喃基、吗啉基或四氢呋喃基。
优选地，所述r2为苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3,4-二氟苯基、3-三氟甲基苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、苄基、吡啶-2-基甲基、吡啶-3-基甲基、吡啶-4-基甲基、4-四氢吡喃基、四氢吡喃-4-基甲基、环己基甲基、4-甲氧基苄基、4-氟基苄基或n-甲基-吡唑-4基。
优选地，所述r3为4-甲基-1-哌嗪基、4-乙基-1-哌嗪基、n-甲基-n-(2-二甲氨基乙基)氨基、4-二甲氨基-1-哌啶基或丙烯酰氨基。
优选地，所述化合物为如下化合物中的一种：
2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物的合成方法，包括以下步骤：
步骤一：在叔胺存在下，2,4,6-三氯吡啶并[3,4-d]嘧啶与r1-h在溶剂中搅拌得到4-取代-2,6-二氯吡啶并[3,4-d]嘧啶，即中间体a；
步骤二：在酸催化下，中间体a与芳胺或取代的芳胺反应；或者，在碱存在下，中间体a与r2-oh、环烷基取代的胺、饱和杂环基取代的胺或取代的甲基取代的胺反应；或者，中间体a与杂芳基胺或取代的杂芳基胺通过buchwald反应；反应完成后分离获得中间体b或c；
步骤三：在钯催化剂、有机膦配体和碱存在下，中间体b或c与2-氨基吡啶类化合物反应，可生成2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物p。
合成路线如下：
优选地，所述的叔胺为三乙胺、二异丙基乙胺、dbu或吡啶；所述的钯催化剂为醋酸钯或三(二亚苄基丙酮)二钯；所述的有机膦配体为2-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽或1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦；所述的碱为碳酸钾、碳酸铯或氢化钠。
所述的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物的可药用盐，所述可药用盐为包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、醋酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、樟脑磺酸盐、苯甲酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、羟乙磺酸盐、琥珀酸盐或甲磺酸盐。
2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物或其可药用盐在制备抗癌药物制剂中的应用。
优选地，所述抗癌药物制剂是能够抑制双突变或三突变的egfr的药物制剂。更进一步地，三突变的egfr是l858r/t790m/c797s的egfr；双突变的egfr是l858r/t790m的egfr。
优选地，所述抗癌药物制剂为片剂、胶囊剂或注射剂，其中每片、每粒或每支制剂中含50～500mg的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物或其可药用盐。
优选地，所述抗癌药物制剂还包括辅料，辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。进一步优选地，辅料包括淀粉、糊精、葡萄糖、乳糖、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、果胶、环糊精、土温-80、聚乙烯醇、硬脂酸镁和滑石粉中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明将吡啶并[3,4-d]嘧啶作为药物骨架，提供的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物或其盐类化合物结构新颖、易于合成。
本发明提供的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物或其盐类化合物具有抑制表皮生长因子受体(egfr)酪氨酸激酶的活性，对于单突变(l858r)、双突变(l858r/t790m)和三突变(l858r/t790m/c797s)的egfr均有明显的抑制活性，可用于与egfr突变相关的癌症的治疗。
本发明提供的化合物具有抑制人肺癌细胞a549、hcc827、h1975等肿瘤细胞增殖的活性，比如化合物44对a549、hcc827和h1975的ic50分别为0.95μmol·l-1、0.008μmol·l-1和0.49μmol·l-1。而在同样条件下，阳性药奥希替尼(azd9291)对a549、hcc827和h1975的ic50值分别为11.5、0.025和0.35μmol·l-1。
本发明提供的化合物具有显著的体内抗肿瘤活性。
本发明提供的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶类化合物及其盐类化合物，能够应用于制备抗癌药物制剂，其中每片或粒或支该药物制剂中含有50～500mg。在利用本发明给出的活性化合物制备抗癌药物制剂时，可以将该药物制成片剂、胶囊剂或注射剂。这些药物制剂可按照各种制剂的常规制备工艺制成。对于片剂或胶囊剂，优选的含量为50～300mg。并且本发明涉及的口服制剂中可含有药用辅料，包括添加剂、稳定剂、增溶剂、润滑剂、崩解剂等，如淀粉、糊精、葡萄糖、乳糖、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、果胶、环糊精、土温-80、聚乙烯醇、硬脂酸镁、滑石粉等。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本申请文件中，展示了本发明所合成的化合物中的部分代表性化合物及其制备方法。具体代表化合物的编号、结构和表征列举在表1中，其制备方法在具体实施例中进行展示。
表1：代表化合物的编号、结构和表征
实施例1：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物1)
步骤一：2,6-二氯-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体a1)的合成
向250ml茄型瓶中加入2,4,6-三氯吡啶并[3,4-d]嘧啶(2.50g，10.66mmol)，将其用四氢呋喃溶解后，加入dipea(2.8ml，15.99mmol)，磁力搅拌下滴加四氢吡咯(1.0ml，11.73mmol)，滴加过程中不断有黄色固体析出，滴毕，室温搅拌4h，旋转蒸发蒸除溶剂，残余物用水悬浮，有大量黄色固体析出，抽滤，滤饼水洗，干燥得中间体a1，淡黄色固体粉末，2.61g，收率91.0％。1hnmr(400mz,cdcl3)δ8.98(s,1h,ar-h),7.94(s,1h,ar-h),3.98(s,4h,nch2),2.13(s,4h,ch2)。
步骤二：2-苯氨基-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体b1)的合成
向100ml茄型瓶中加入2,6-二氯-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体a1)(1.00g，3.72mmol)，对甲苯磺酸(0.77g，4.48mmol)和仲丁醇(30ml)，磁力搅拌下加入苯胺(0.370ml，4.08mmol)，氩气保护下回流4h，回流过程中不断有黄色固体析出，旋转蒸发蒸除溶剂，残余物用碳酸氢钠水溶液悬浮，有大量固体析出，超声均匀后抽滤，水洗滤饼，干燥得中间体b1，淡黄色固体粉末，1.20g，收率99.2％。1hnmr(400mz,cdcl3)δ8.75(s,1h,ar-h),7.80(s,1h,ar-h),7.70(d,j＝7.7hz,2h,ar-h),7.34(t,j＝8.0hz,2h,ar-h),7.16(s,1h,nh),7.04(t,j＝7.4hz,1h,ar-h),3.91(s,4h,nch2),2.09(t,j＝6.5hz,4h,ch2)。
步骤三：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物1)的合成
向50ml茄型瓶中加入2-苯氨基-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体b1)(50mg,0.15mmol)，2-氨基-5-(4-甲基-1-哌嗪基)吡啶(38mg，0.20mmol)，pd(oac)2(4mg，0.015mmol)，x-phos(14mg，0.030mmol)，cs2co3(122mg，0.38mmol)和1,4-二氧六环(10ml)，混合物于氩气保护下回流3h，旋转蒸发蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离，得化合物1，黄色固体粉末，36mg，收率48.6％。
实施例2：2-(3-氟苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物2)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例3：2-(3-氯-4-氟苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物3)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例4：2-(n-甲基-4-吡唑胺基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物4)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例5：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(4-(n-甲基-n-二甲氨基乙基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物5)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例6：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物6)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例7：2-苯氨基-4-二甲胺基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物7)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末，收率65.8％。
实施例8：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物8)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例9：2-(3-氯-4-氟苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物9)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末，收率11.0％。
实施例10：2-苯氨基-4-哌啶基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物10)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末，收率52.1％。
实施例11：2-苯氨基-4-吗啉基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物11)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例12：2-苯氨基-4-哌啶基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物12)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例13：2-苯氨基-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物13)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例14：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物14)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例15：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物15)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例16：2-(3-氯-4-氟苯氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物16)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例17：2-(3,4-二氟苯氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物17)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例18：2-(4-氟苯氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物18)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例19：2-(3-吡啶氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物19)
2-(3-吡啶氨基)-4-吗啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体b2)的合成
向50ml茄型瓶中加入4-吗啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(500mg,1.75mmol)，3-氨基吡啶(150mg，1.58mmol)，pd(oac)2(40mg，0.18mmol)，xant-phos(314mg，0.53mmol)，cs2co3(1.42g，4.38mmol)和乙二醇二甲醚(30ml)，混合物于氩气保护下回流2.5h，旋转蒸发蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离，得化合物中间体b2，淡黄色固体粉末，202mg，收率37.4％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.92(s,1h,ar-h),8.62(d,j＝8.5hz,1h,ar-h),8.30(dd,j＝4.9,1.0hz,1h,ar-h),8.05(bs,1h,nh),7.79–7.71(m,1h,ar-h),7.56(s,1h),7.02–6.94(m,1h,ar-h),3.91–3.87(m,4h,och2),3.84–3.80(m,4h,nch2)。
参考化合物1的制备步骤中的步骤三，用中间体b2替换中间体b1，制得化合物19，黄色固体粉末，收率31.4％。
实施例20：2-(3-吡啶氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物20)
方法同化合物19的制备，黄色固体粉末。
实施例21：2-(2-吡啶氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物21)
方法同化合物19的制备，黄色固体粉末。
实施例22：2-苄氨基-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物22)
2-苄氨基-4-吗啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体b3)的合成
向100ml茄型瓶中加入2,6-二氯-4-吗啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(100mg，0.35mmol)，苄胺(41μl，0.39mmol)，碳酸钾(121mg，0.88mmol)，二甲基亚砜，催化量的碘化钾和四丁基碘化铵，混合物于120℃油浴中搅拌3h，将反应混合物倒入水中，用乙酸乙酯(30ml×2)萃取，合并乙酸乙酯相，依次用水(30ml×3)和饱和食盐水(30ml×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去乙酸乙酯，残留物经硅胶柱色谱分离，得黄色油状物，乙醇重结晶得中间体b3，黄色固体粉末，70mg，收率56.0％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.75(s,1h,ar-h),7.47(s,1h,ar-h),7.38–7.27(m,5h,ar-h),5.40(bs,1h,nh),4.69(d,j＝5.6hz,2h,nhch2),3.85–3.69(m,8h,och2+nch2)。
参考化合物1的制备步骤中的步骤三，用中间体b3替换中间体b1，制得化合物22，黄色固体粉末，收率43.0％。
实施例23：2-(2-吡啶基甲氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物23)
方法同化合物22的制备，黄色固体粉末。
实施例24：2-(3-吡啶基甲氨基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物24)
方法同化合物22的制备，黄色固体粉末。
实施例25：2-苯氨基-4-吗啉基-6-(1-甲基-4-吡唑氨基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物25)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例26：2-(3-吡啶氧基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物26)
2-(3-吡啶基氧基)-4-吗啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体c1)的合成
向100ml圆底烧瓶中加入2,6-二氯-4-吗啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(200mg，0.70mmol)，3-羟基吡啶(67mg，0.70mmol)，碳酸钾(100mg，1.76mmol)和dmf(10ml)。混合物于60℃油浴中搅拌5h，旋转蒸发除去dmf，残余物经硅胶柱色谱分离得中间体c1，淡黄色固体粉末，125mg，收率51.9％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.86(s,1h,ar-h),8.60(d,j＝2.4hz,1h,ar-h),8.52(d,j＝4.3hz,1h,ar-h),7.65(s,1h,ar-h),7.62(ddd,j＝8.3,2.6,1.4hz,1h,ar-h),7.40(dd,j＝8.3,4.8hz,1h,ar-h),3.93–3.89(m,4h,och2),3.88–3.83(m,4h,nch2)。
2-(3-吡啶氧基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物26)的合成。
参考化合物1的制备步骤中的步骤三，用中间体c1替换中间体b1，制得化合物26，黄色固体粉末，收率73.9％。
实施例27：2-(4-四氢吡喃氧基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物27)
2-(4-四氢吡喃氧基)-4-吗啉基-吡啶并[3,4-d]嘧啶(中间体c2)的合成
将4-羟基四氢吡喃(72mg，0.77mmol)和四氢呋喃(10ml)加入圆底烧瓶中，搅拌下分批加入氢化钠(56mg，60％，1.40mmol)，混合物在氩气保护下于室温搅拌30min，加入4-吗啉基2,6-二氯吡啶并[3,4-d]嘧啶(200mg，0.70mmol)，室温搅拌过夜，旋转蒸发除去四氢呋喃，残余物经硅胶柱色谱分离得中间体c2，黄色固体粉末，171mg，收率69.5％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.90(s,1h,ar-h),7.60(s,1h,ar-h),5.40–5.27(m,1h,och),4.14–4.02(m,2h,och2),3.97–3.85(m,8h,och2+nch2),3.71–3.59(m,2h,och2),2.20–2.09(m,2h,ch2),1.99–1.89(m,2h,ch2)。
参考化合物1的制备步骤中的步骤三，用中间体c2替换中间体b1，制得化合物27，黄色固体粉末。
实施例28：2-(四氢吡喃-4-甲氧基)-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物28)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例29：2-(四氢吡喃-4-氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物29)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例30：2-环己基甲氧基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物30)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例31：2-苄氧基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物31)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例32：2-(3-吡啶甲氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物32)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例33：2-(4-吡啶甲氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物33)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例34：2-(4-甲氧基苄氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物34)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例35：2-(4-氟苄氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物35)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例36：2-(4-氟苄氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物36)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例37：2-(4-氟苄氧基)-4-二甲氨基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物37)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例38：(s)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-吡咯烷基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物38)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例39：(r)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-吡咯烷基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物39)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例40：(s)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-哌啶基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物40)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例41：(r)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-哌啶基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物41)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例42：(s)-2-苯氨基-4-(1-丙烯酰基-3-吡咯烷基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物42)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例43：(r)-2-苯氨基-4-(1-丙烯酰基-3-吡咯烷基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物43)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例44：(s)-2-苯氨基-4-(1-丙烯酰基-3-哌啶基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物44)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例45：(r)-2-苯氨基-4-(1-丙烯酰基-3-哌啶基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物45)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例46：2-苯氨基-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物46)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例47：2-(3-氟苯氨基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物47)
方法同化合物1的制备，黄色固体粉末。
实施例48：2-苄氧基-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物48)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例49：2-(4-氟苄氧基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物49)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。收率35.0％。
实施例50：2-(4-(四氢吡喃)甲氧基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物50)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。收率27.6％。
实施例51：2-(4-(四氢吡喃)氧基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物51)
方法同化合物27的制备，黄色固体粉末。
实施例52：2-苯氨基-4-吗啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶盐酸盐(化合物52)
将化合物13溶解于四氢呋喃，加入1.2倍摩尔量的浓盐酸，密封，混合物于室温度搅拌过夜，抽滤，干燥得化合物52。ei-ms：526.5(m+h+)。
实施例53：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶甲磺酸盐(化合物53)
方法同化合物52的制备。
实施例54：抑制egfr-酪氨酸激酶活性的测定
方法：将待测定化合物分别用dmso溶解配制成10mmol/l的母液，逐级稀释，得到浓度为1μmol/l的溶液，并将5μl待测定的不同药物或dmso分别加入酶反应体系中。酶反应体系的组成为：40mmol/ltris，ph7.4，10mmol/lmgcl2，0.1mg/mlbsa，1mmol/ldtt，10μmol/latp，egfr(l858r)或egfr(l858r/t790m)25mg/l，底物为0.2mg/mlpoly(glu,tyr)，反应体系的终体积为50μl，而药物的终浓度为100nmol/l。反应体系置于30℃反应40min后，加入终止液终止反应，并用荧光素酶的方法检测体系内的atp含量，在md-spectramaxm5多功能酶标仪上检测化学发光信号，化学发光信号的强度与反应体系的酶的活性成反比。将检测到的化学发光信号值代入公式：
抑制率＝[1-((lu酶-lu本底)/lu药物-lu本底)]×100％
式中：lu药物表示给药组，lu本底表示空白组(不加酶不加药)，lu酶表示溶剂对照组。
实验测定的结果展示在表2中。
表2.部分化合物在浓度为100nmol/l时对酶活性的抑制率(％)
“-”表示未测定。
实施例55：体外抗癌活性的验证
为了验证本发明合成的及其盐类化合物的抗癌活性，以azd9291为阳性对照药物，采用体外mtt法测定了化合物1-53对人肺癌细胞hcc827、h1975生长抑制作用。
验证方法：将肿瘤细胞hcc827培养在含10％小牛血清的rpmi1640培养基中，内含青霉素有100u·ml-1，链霉素100μg·ml-1，于37℃、5％co2培养箱中传代培养。取0.25％胰酶消化贴壁的肿瘤细胞，用含10％小牛血清的rpmi1640培养液配制细胞悬液，浓度为6×103个细胞/毫升。于96孔培养板内每孔接种200μl(约含1000个肿瘤细胞)，37℃培养24h。给药组加入不同浓度药物，每药设定10、3.33、1.0、0.33和0.10μmol·l-15个浓度梯度，每组设3个平行孔。对照组加入与药等体积的溶剂，置于37℃、5％co2培养箱中培养72h后弃去培养液，每孔加入20μl5mg·ml-1的mtt溶液，孵育4h后，弃去上清液，每孔加入dmso150μl，轻度振荡后用酶标仪在570nm下测定光密度值(od)。
结果计算：
以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，按照下式求药物对肿瘤细胞的抑制率：
并进一步采用线性回归法求出半数抑制浓度(ic50)。
测定结果显示，化合物1-53对hcc827的ic50为0.008-5.17μmol·l-1；对h1975的ic50为0.44-5.63μmol·l-1；对a549的ic50值为0.16-8.39μmol·l-1。阳性药奥希替尼(azd9291)对hcc827、h1975和a549的ic50值分别为0.025、0.35和11.5μmol·l-1。
实施例56：体内抗癌活性的验证
为了验证本发明提供化合物的体内抗癌活性，我们采用小鼠s180移植瘤模型，灌胃给药，考察了化合物53的体内抗癌活性。
验证方法：昆明种小鼠，雄性，体重20-23g。取出小鼠腹腔接种s180后第8天的腹水，用生理盐水以1:1比例稀释，制成s180细胞混悬液。用注射器在每只小鼠右腋窝皮下接种0.1ml。接种次日，将小鼠随机分为3组，每组8只，分别为：
1)空白对照组(nmp/peg400/h2o)
2)化合物53低剂量组(5.0mg·kg-1)
3)化合物53高剂量组(15.0mg·kg-1)
将化合物53用nmp/peg400/h2o(体积比为1:5:4)溶解。接种后第二天开始按上述给药方案灌胃给药，一日一次，连续给药8天。给药当日记为d1，给药体积为10ml·kg-1体重。每日给药前记录小鼠体重。停药次日(d9)将小鼠处死，剥离出瘤块，剔除其他组织后称重。
结果：化合物53在剂量为5.0mg·kg-1和15.0mg·kg-1时，对小鼠体内s180移植瘤的生长抑制率分别为52.5％和80.3％。
结论：本发明提供的化合物53具有明显的体内抗癌活性。
实施例57：急性毒性试验
化合物53用nmp、peg400和水溶解，以不同的剂量，给昆明种小鼠一次性灌胃给药，观察7天。结果表明：本发明中编号53的化合物给药剂量为300mg·kg-1时，小鼠活动正常。试验结果表明本发明提供的化合物毒性很小。