一种环介导等温扩增法检测对虾白斑综合症病毒的方法与流程

本发明涉及水生动物病原微生物检测，尤其是涉及一种环介导等温扩增法检测对虾白斑综合症病毒的方法。

背景介绍

对虾白斑综合症(whitespotsyndromevirusdisease)是一类严重的对虾传染性疫病，因部分濒死对虾的头胸甲部位出现白色斑点，而得名。然而，亦有部分虾体变红，而不出现白斑。对虾白斑综合症的病原是对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)，该病原不仅可感染对虾，如斑节对虾penaeusmonodon，日本囊对虾marsupenaeusjaponicas和凡纳滨对虾litopenaeusvannamei等，也在其他淡水和海水的甲壳动物中检测和发现，如蟹类和小龙虾等(loetal,1996.whitespotsyndromebaculovirus(wsbv)detectedinculturedandcapturedshrimp,crabsandotherarthropods.diseasesofaquaticorganisms,27:215-225)。斑节对虾和日本囊对虾的整个生活史不同阶段均可受该病毒感染，在3～10d对虾死亡率可高达100％，经济损失严重。例如，1993年，中国发生对虾白斑综合症流行，导致当年对虾产量下降70％，引起全球水产业的高度关注。目前，在全球范围内，野生和养殖的对虾中均有报道检测到wssv，该病已然成为一种全球范围内的对虾疫病。因此，国际兽疫局(officeinternationaldesepizooties,oie)将其列为必须申报的疫病，2008年中国农业部也将其列为一类动物疫病(第1125号公告)。此外，该病不仅严重威胁着甲壳动物养殖业，也给海洋生态造成一定的破坏。目前，对虾白斑综合症病毒的检测方法，主要有组织切片、免疫分析、杂交和pcr等。其中，巢式pcr是oie所认可的对虾白斑综合症病毒检测方法(http://www.oie.int/en/),该方法可以特异性检测出对虾白斑综合症病毒，且灵敏度高。然而，该方法需要控温精确价格高昂的pcr仪、电泳设备以及具有较强专业知识的技术人员，限制了其在对虾养殖过程中的推广应用。为了有效防控该疫病，需要开发仪器成本更低廉，且使用更方便的wssv检测方法。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是日本学者notomi等(notomietal.2000.loop-mediatedisothermalamplificationofdna.nucleicacidsresearch,28(12):e63)首先提出的一种恒温条件下快速核酸扩增的新技术。该技术的工作原理：在60～65℃时，双链dna处于变性和延伸性的动态平衡，此时，任何一个引物向双链dna的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会被解离，变成单链。基此，通过设计针对靶基因不同区域的4条特异性引物，在具有链置换活性dna聚合酶(如bst、gsp等)作用下，在恒温条件下(60～65℃)进行链置换反应，可实现1h内对靶核酸序列超过10⁹倍的扩增效果。由于lamp是对同一段dna链上互补序列的周而复始扩增，故形成多种长短不一的茎环结构和花椰菜样结构的dna混合物，所以，扩增产物的琼脂糖电泳图呈阶梯条带状。同时，在lamp阳性反应过程中，随着核酸的大量形成，其副产物焦磷酸根可与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁(白色沉淀)，离心后，肉眼可观察到白色沉淀(morietal,“real-timeturbidimetryoflampreactionforquantifyingtemplatedna,”journalofbiochemicalandbiophysicalmethods,2004，59(2):145-157)。此外，由于lamp阳性反应产物为大量dna，故可通过添加与核酸结合的荧光染料，在紫外光下可观察到颜色变化(gotoetal,colorimetricdetectionofloop-mediatedisothermalamplificationreactionbyusinghydroxynaphtholblue[j].biotechniques,2009，46(3):167-172)。lamp方法的主要优点是在恒温条件下实现核酸序列的特异性扩增，因而无须控温精确、价格高昂的pcr仪或热循环仪。此外，因为其对核酸扩增的效率高、特异性强、灵敏度高、操作简便和快捷等，所以，具有良好的野外适应性，在资源有限的基层实验室进行核酸检测的应用前景。近年该方法已被广泛应用于病原微生物、转基因相关检测和胚胎性别鉴定等核酸诊断领域。

目前，在白斑综合症病毒检测中已有lamp技术的应用的报道，例如冯华等和何琳等利用wssv的保守囊膜蛋白vp28基因为靶序列，建立lamp检测技术，通过开管添加sybrgreeni染料再进行荧光显色，以检测靶基因的扩增情况(冯华等，对虾白斑综合症病毒lamp检测方法的建立，中国兽医科学，2011，41(7)：707-711；何琳等,白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立，水产学报，2010，34(4)：598-603)。有关对虾白斑综合症病毒的专利有两个，即：黄倢等“对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂及检测方法”的专利，该专利以白斑综合征病毒的保守基因为靶基因，建立lamp检测技术，通过反应后添加genefinder^tm以检测靶基因的扩增情况(中华人民共和国国家知识产权局，发明专利申请号200810139949.4；公开号：cn10372714a)；谢芝勋等“检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物及其应用”，该专利以对虾白斑综合片病毒基因组保守区orf120序列设计引物，主要通过钙黄绿素：氯化锰作为显色剂，建立可视化wssv-lamp检测方法。上述对虾白斑综合症病毒的lamp检测方法，涉及反应后额外添加试剂，或阴阳性反应产物反应液的色差变化不大等问题，可能导致结果判读的困难或者误判。有研究报道，在核酸等温扩增反应过程中，伴随着靶基因扩增产物的积累过程中，也产生了大量的[h⁺]，使反应体系ph下降(tanneretal,2015.visualdetectionofisothermalnucleicacidamplificationusingph-sensitivedyes.biotechniques,2015,58(2):59-68)，因此可利用ph敏感的指示剂以判断lamp反应是否发生。目前，尚未见ph指示剂应用于对虾白斑综合症病毒的lamp检测的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种环介导等温扩增法检测对虾白斑综合症病毒的方法。

本发明包括以下步骤：

1)基因组提取；

在步骤1)中，所述基因组提取的具体方法可为：

采用gb/t28630.2-2012提供的方法进行基因组提取、对虾白斑综合症病毒(wssv)pcr检测试剂盒的方法或采用其他商品化试剂盒提取基因组dna；

所述采用gb/t28630.2-2012提供的方法进行基因组提取的具体方法如下：采集对虾的肌肉、鳃和肝胰腺等组织约100mg，加入300μlctab溶液研磨匀浆，后转移到1.5ml离心管中，再加入450μlctab溶液充分混匀，于25℃静置2h，再加入600μl酚-三氯甲烷-异戊醇到组织样品中，充分混匀，12000r/min，离心5min，吸取上清至新的1.5ml离心管中，加入700μl酚-三氯甲烷-异戊醇到组织样品中，充分混匀，12000r/min，离心5min；吸取上清于新的1.5ml离心管中，加入900μl预冷的无水乙醇(-20℃)，混匀并静置，并于-20℃放置8h以上，12000r/min，离心30min，弃去上清，将离心管倒置在吸水纸上，37℃干燥20min，加入10μl超纯水，作为dna模板；

所述采用对虾白斑综合症病毒(wssv)pcr检测试剂盒提取基因组dna的具体方法可采用厦门鹭隆生物科技发展有限公司，mbk-001的方法；

所述采用其他商品化试剂盒提取基因组dna的具体方法可采用天根生化科技有限公司或generay公司提取基因组dna的方法。

2)制备阳性对照；

在步骤2)中，所述制备阳性对照的方法可为：

以阳性wssv的dna为模板，以f3和b3为引物进行pcr扩增，pcr反应体系(20μl)：2×gotaq@greenmastermix(promega)10μl，引物各0.5μl，模板各1.0μl，超纯水8μl，反应程序：94℃1min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32个循环；72℃10min。产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，经过胶回收后，连接进行pmd18t载体，转化感受态细胞，测序验证，提取阳性质粒作为阳性对照，-20℃保存，备用。

3)制备阴性对照：超纯水；

4)样品检测及结果判定。

在步骤4)中，所述样品检测及结果判定的具体方法可为：取基因组dna1μl加入到lamp反应体系中，在63℃60min，95℃3min后，通过以下方式判定结果：肉眼观察，若lamp反应体系颜色与阳性对照相近，变成黄色(除no.2指示剂为酒红色)则为阳性反应，表明待检测样品含有wssv；若lamp反应体系颜色与阴性对照相近，即保持反应体系原有的颜色(no.1指示剂为军绿色，no.2指示剂橙黄色，no.3指示剂为红色)则为阴性反应，表明待检样品中没有wssv。备选：琼脂糖凝胶电泳：2％琼脂糖凝胶中120v电压下，电泳40min，eb染色或sybrgreeni染色后，在紫外灯下观察到大小不一的条带状产物，即为阳性反应，反之，没有条带状产物，为阴性反应；所述lamp反应体系为缓冲液体系，体积5～50μl，以25μl反应体系为例：10×buffer(80～120μm(nh4)2so4，300～700μmkcl，60～120μmmgso4，0.1％～1.5％tween-20或triton-100)2.5μl，外引物f3和b3各0.5μl，内引物fip和bip各4μl，4×dntps(20～100mm)1.4μl，模板2μl，超纯水8.1μl，bstdna合成酶1μl，染料1μl，1mkoh调整体系ph为7.5～9.5；反应程序为60℃5min，63℃60min，95℃3min。

本发明提供了一组检测对虾白斑综合症病毒的环介导等温扩增引物组合，包括外引物和内引物，所述外引物为f3和b3，所述内引物为fip和bip，对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus,wssv)引物序列如表1所示。不同引物的最适用量比：外引物︰内引物为1︰(6～8)；引物浓度范围：1～50μm，最适浓度为10μm。

表1

三种指示剂的配方及其用量范围参见表2。

表2

本发明根据对虾白斑综合症病毒囊膜基因的保守序列，设计了lamp引物，建立lamp反应体系，并通过在lamp反应中添加不同的ph指示剂，以达到通过肉眼观察颜色变化判定靶基因被有效扩增的目的。

闭管式可视化快速检测对虾白斑综合症病毒的方法，因为反应产物无须通过电泳和/或添加入荧光染料等鉴定，降低了lamp产物的污染风险。

附图说明

图1为本发明实施例lamp反应后，不同指示剂的颜色变化情况。在图1中，1，2为指示剂1；3，4为指示剂2；5，6为指示剂3；1，3，5为阳性反应结果；2，4，6为阴性反应结果。

图2为本发明实施例lamp反应后的凝胶电泳结果。加样同图1。

图3为本发明实施例的灵敏度检测结果。在图3中，以指示剂3为例，1～5分别是10倍稀释的基因组模板，6为阴性对照，结果显示：最低检测深度为40copies/μl

具体实施方式

实施例1：新型环介导等温扩增技术对样品的检测

1、基因组提取：

(1)采用gb/t28630.2-2012提供的方法进行基因组提取：具体操作如下：

采集对虾的肌肉、鳃和肝胰腺等组织约100mg，加入300μlctab溶液研磨匀浆，后转移到1.5ml离心管中，再加入450μlctab溶液充分混匀，于25℃静置2h。加入600μl酚-三氯甲烷-异戊醇到组织样品中，充分混匀，12000r/min，离心5min。吸取上清至新的1.5ml离心管中，加入700μl酚-三氯甲烷-异戊醇到组织样品中，充分混匀，12000r/min，离心5min。吸取上清于新的1.5ml离心管中，加入900μl预冷的无水乙醇(-20℃)，混匀并静置，并于-20℃放置8h以上。12000r/min，离心30min，弃去上清，将离心管倒置在吸水纸上，37℃干燥20min。加入10μl超纯水，作为dna模板。

(2)对虾白斑综合症病毒(wssv)pcr检测试剂盒(厦门鹭隆生物科技发展有限公司，mbk-001)的方法，提取基因组dna。

(3)利用其他商品化试剂盒(天根生化科技有限公司，或generay公司)提取基因组dna。

置于-20℃保存，备用。

2、阳性对照的制备：以阳性wssv的dna为模板，以f3和b3为引物进行pcr扩增。pcr反应体系(20μl)：2×gotaq@greenmastermix(promega)10μl，引物各0.5μl，模板各1.0μl，超纯水8μl。反应程序：94℃1min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32个循环；72℃10min。产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，经过胶回收后，连接进行pmd18t载体，转化感受态细胞，测序验证，提取阳性质粒作为阳性对照，-20℃保存，备用。

3、阴性对照制备：超纯水。

4、样品检测及结果判定：取基因组dna1μl加入到lamp反应体系中，在63℃60min，95℃3min后，通过以下方式判定结果：肉眼观察。若lamp反应体系颜色与阳性对照相近，变成淡黄色(除no.2指示剂为酒红)则为阳性反应，表明待检测样品含有wssv；若lamp反应体系颜色与阴性对照相近，即保持反应体系原有的颜色(no.1指示剂为军绿色，no.2指示剂橙黄色，no.3指示剂为红色)则为阴性反应，表明待检样品中没有wssv(参见图1)。备选：琼脂糖凝胶电泳：2％琼脂糖凝胶中120v电压下，电泳40min，eb染色或sybrgreeni染色后，在紫外灯下观察到大小不一的条带状产物，即为阳性反应，反之，没有条带状产物，为阴性反应(参见图2)。

实施例2：对虾白斑综合症病毒的闭管式可视化的环介导等温扩增技术的特异性

以pcr检测为阳性的样本30份和阴性的样本20份(对虾白斑综合症病毒(wssv)pcr检测试剂盒，厦门鹭隆生物科技发展有限公司提供；和gb/t28630.2-2012检测结果一致)，相应的对虾组织总dna为模板；或副溶血弧菌(vibrioparahemolyticus)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila，b11、b14和b48)、维氏气单胞菌(a.veronii)、豚鼠气单胞菌(a.caviae)、2株金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)和肺炎克雷伯氏杆菌(klebsiellapneumoniae)的基因组为模板，利用优化的lamp反应体系和反应程序，以实施例一所制备的阴性和阳性对照为参比。通过实施例一中的肉眼观察变化和电泳检测以判断所检测样品的结果。结果显示，仅30份wssv阳性标本的检测结果为阳性，其余均为阴性结果，与预期结果相同，即表明该方法特异性强。

实施例3：对虾白斑综合症病毒的闭管式可视化的环介导等温扩增技术的灵敏度

以对虾白斑综合症病毒阳性质粒为模板，进行10倍比稀释，模板中靶基因的拷贝数为4×10⁶、4×10³、4×10²、4×10¹、4×10⁰(copy/μl)，和阴性对照，同时采用优化的lamp反应体系及程序进行lamp反应，反应体系为10μl。通过实施例一中的肉眼观察变化和电泳检测以判断所检测样品的结果。结果显示，靶基因拷贝数大于或等于4.18×10¹(copy/μl)的模板，检测结果均为阳性，4×10⁰(copy/μl)偶尔出现阳性结果，阴性对照的结果均呈现为阴性反应，说明该方法的灵敏度为40(copy/μl)(参见图3)。

本发明的wssv-lamp检测技术的优势：

1)本发明在lamp反应起始到结果判断定均在完全闭管状态，无需开管检测反应产物。

2)本发明提供了多种优选的指示剂，其阳性和阴性反应结果的颜色差异大，难以发生结果误判。

3)本发明根据gb/t28630.2-2012的wssv保守序列设计lamp引物，与国标pcr检测方法的结果符合率高。

4)本发明的检测方法特异性强：对副溶血弧菌、绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞、豚鼠气单胞菌等多种病原，均无阳性扩增结果。

5)灵敏度高，基因组dna最低检出率为40copies/μl。

6)该方法结合简易的基因组核酸提取技术，具有良好野外及资源有限的基层实验室检测应用的前景。

序列表

<110>集美大学

<120>一种环介导等温扩增法检测对虾白斑综合症病毒的方法

<130>2017-06-19

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>对虾白斑病毒（whitespotsyndromevirus）

<400>1

ctatcaggccaacaagct18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus)

<400>2

tgacaataacgtcgaggtt19

<210>3

<211>50

<212>dna

<213>对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus,wssv

<400>3

ggagggaagatcctgttactctagatattagtgacaaacattacgtgatg50

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus)

<400>4

tggactgaaatgagaatgaactcccatgccagagttggagag42