本发明涉及生物发酵
技术领域：
，尤其涉及一种牛樟芝菌丝体的培养方法。
背景技术：
：牛樟芝(antrodiacamphorata)隶属于担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，薄孔菌属，是一种珍稀药用真菌，素有“药中之王”、“森林中之红宝石”的美誉。牛樟芝主要生理活性成分为多糖和三萜类物质，其中牛樟芝多糖具有提高免疫力、抑制癌细胞、改善心血管循环系统、防止动脉硬化等功效作用。药理研究表明牛樟芝三萜具有多种生物活性，如保肝、调节免疫、抑制血管新生、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等。牛樟芝作为一种新发现的药用真菌表现出广阔的应用前景。由于野生牛樟芝生长缓慢，资源短缺，无法满足社会需求。目前，人工培育牛樟芝技术尚未成熟，特别是工厂化生产牛樟芝的关键技术亟待突破，具有巨大的研究价值。目前牛樟芝人工培育技术大致可以分为液体发酵法、固体培养法、椴木栽培法三种。液体发酵法：利用500公升甚至吨级以上的液体发酵罐进行牛樟芝樟芝菌种液体发酵以收取菌丝体；培养时间短，约七至十四天左右；但无法取得野生樟芝特有的三萜类。固体培养法：将牛樟芝樟芝菌种以太空包进行菌丝体培养。太空包含有纤维物、醣类、五谷杂粮类等；能获得与野生牛樟芝樟芝外形相似但不一样的成分，培养时间三个月以上；培养成本高。椴木栽培法：利用牛樟芝原有宿主牛樟树椴木为培养基栽培牛樟芝；能获得与野生樟芝相同之成分，功效相同，避免野生牛樟树被盗伐；但培养时间长达2-3年，培养成本高。综上所述的三种培育方法，存在以下的不足之处：1)采用液体发酵法生产出的牛樟芝菌丝体三萜类含量极低，药用价值低；2)采用固体培养法生产牛樟芝菌丝体培养周期较长，易污染，成功率低，培养成本高；3)采用椴木栽培法生产与野生牛樟芝品质相当的产品，须采用牛樟木作为培植菌木。然而牛樟树已列为中国台湾珍稀树种(一级保护)，原料来源十分困难，且牛樟树的种植条件要求较高，生长周期长，工厂化生产受到限制。技术实现要素：有鉴于此，本发明实施例提供了一种牛樟芝菌丝体的培养方法，主要目的是解决牛樟芝菌丝体培养周期长、成功率低及药用价值低的问题。为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：一方面，本发明实施例提供了一种牛樟芝菌丝体的培养方法，所述方法包括以下步骤：将牛樟芝菌种接种在斜面培养基上进行活化与提纯，得到活化好的母种；将所述活化好的母种接种到液体摇瓶培养基中进行静置培养，待菌丝萌发且无污染后进行搅拌培养，获得摇瓶种；将所述摇瓶种接种到发酵培养基上进行发酵培养，得到发酵菌丝体；将所述发酵菌丝体作为液体菌种接种到人工合成固体培养基质上并发酵培养30-90天，得到樟芝菌丝体。作为优选，所述斜面培养基由以下原料组成：马铃薯100g/l-200g/l、葡萄糖10g/l-20g/l、玉米粉10g/l-50g/l、蛋白胨2g/l-5g/l、硫酸镁0.1g/l-1g/l、磷酸二氢钾0.2g/l-2g/l、vb110g/l-50mg/l、琼脂粉16g/l-20g/l；所述将樟芝菌种接种在斜面培养基上进行活化与提纯的培养温度为25℃-30℃。作为优选，所述摇瓶培养的培养温度为25℃-33℃，所述摇瓶培养为静置培养3-4天；所述搅拌培养是将摇瓶放置于磁力搅拌器上进行培养，所述搅拌培养的培养温度为25℃-33℃，所述搅拌培养的培养时间为6-10天。作为优选，所述液体摇瓶培养基由以下原料组成：马铃薯汁10g/100ml-50g/100ml、葡萄糖1g/100ml-4g/100ml、玉米粉1g/100ml-5g/100ml、蛋白胨0.2g/100ml-1g/100ml、硫酸镁0.01g/100ml-0.1g/100ml、磷酸二氢钾0.02g/100ml-0.2g/100ml、vb10.001g/100ml-0.01g/100ml及琼脂粉0.01g/100ml-0.2g/100ml。作为优选，所述发酵培养是在发酵罐中进行，所述发酵罐的罐压为0.02mpa-0.08mpa；所述发酵培养的通气量为1:0.2-2.0；所述发酵培养的接种量为1％-10％，所述发酵培养的培养温度为25℃-33℃，所述发酵培养的培养时间为3-13天。作为优选，所述发酵培养基由以下原料组成：马铃薯汁10g/100ml-50g/100ml、葡萄糖1g/100ml-4g/100ml、玉米粉1g/100ml-5g/100ml、蛋白胨0.2g/100ml-1g/100ml、硫酸镁0.01g/100ml-0.1g/100ml、磷酸二氢钾0.02g/100ml-0.2g/100ml、vb10.001g/100ml-0.01g/100ml、琼脂粉0.01g/100ml-0.2g/100ml。作为优选，将所述发酵菌丝体作为液体菌种接种到人工合成固体培养基质上并发酵培养30-90天得到樟芝菌丝体的具体步骤包括：配制固体培养基质：按以下配方准备各原料：小麦42％-98.7％、石膏0.1％-5％、白糖0.1％-3％、黄豆粉0.1％-20％、香樟木屑1％-30％；将饱满的干小麦浸泡洗净后煮到熟而不烂，晾晒沥干水，分别将石膏、白糖、黄豆粉和香樟木屑放入小麦里混合得到所述固体培养基质；灭菌：对所述固体培养基质进行高压蒸汽灭菌；接种：将灭菌后的固体培养基质冷却至常温，再将所述发酵菌丝体作为液体菌种接种到常温的固体培养基质上；发酵培养：将接种后的固体培养基质置于黑暗环境中发酵培养30-90天，即得到樟芝菌丝体。作为优选，所述固体培养基质的含水量为50％-60％；所述灭菌的压力为0.1mpa-0.15mpa，所述灭菌的温度为121℃-130℃，所述灭菌的时间为1.5h-2.5h；所述发酵菌丝体作为液体菌种接种到常温的固体培养基质上的接种量为1％-10％；所述固体培养基质在黑暗环境中的发酵温度为25℃-33℃，发酵湿度为30％-60％，培养环境中每天通风1-3次，每次10-30分钟。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用固液结合法生产牛樟芝菌丝体，既克服了液体发酵法生产牛樟芝菌丝体药用价值低的缺点，又克服了固体培养法和椴木栽培法生产牛樟芝周期长和成功率低的缺点；采用本发明的方法生产出的牛樟芝菌丝体与野生牛樟芝成份组成一致，无论外观、香气、苦味与成分组成等均能完全取代野生牛樟芝；而且本发明方法适用于规模化、工厂化生产牛樟芝菌丝体。具体实施方式为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。实施例1按以下配方准备各原料制备斜面培养基：马铃薯100g/l、葡萄糖10g/l、玉米粉10g/l、蛋白胨2g/l、硫酸镁0.1g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、vb110mg/l、琼脂粉16g/l；将牛樟芝菌种接种在上述制备好的斜面培养基上进行活化与提纯，培养温度为25℃，得到活化好的母种；按以下配方准备各原料制备液体摇瓶培养基：马铃薯汁10g/100ml、葡萄糖1g/100ml、玉米粉1g/100ml、蛋白胨0.2g/100ml、硫酸镁0.01g/100ml、磷酸二氢钾0.02g/100ml、vb10.001g/100ml及琼脂粉0.05g/100ml；将上述活化好的母种接种到液体摇瓶培养基中进行摇瓶培养，上述摇瓶培养的培养温度为25℃，静置培养4天，待菌丝萌发且无污染后将摇瓶放置于磁力搅拌器上进行搅拌培养，上述搅拌培养的培养温度为25℃，培养时间为8天，获得摇瓶种；按以下配方准备各原料制备发酵培养基：马铃薯汁10g/100ml、葡萄糖1g/100ml、玉米粉1g/100ml、蛋白胨0.2g/100ml、硫酸镁0.01g/100ml、磷酸二氢钾0.02g/100ml、vb10.001g/100ml、琼脂粉0.05g/100ml；将上述摇瓶种接种到发酵罐内的发酵培养基上进行发酵培养，上述发酵罐的罐压为0.03mpa，通气量为1:0.5(具体是指1分钟的通气量除以发酵罐的液体的体积)，接种量为1％，培养温度为25℃，培养时间为7天，得到发酵菌丝体；将上述发酵菌丝体作为液体菌种接种到人工合成固体培养基质上并发酵培养，步骤为：配制固体培养基质：按以下配方准备各原料：小麦92％、石膏1％、白糖1％、黄豆粉3％、香樟木屑3％；将饱满的干小麦浸泡洗净后煮到熟而不烂，晾晒沥干水，分别将石膏、白糖、黄豆粉和香樟木屑放入小麦里混合均匀装入聚丙烯袋里或瓶里，得到上述固体培养基质，其含水量为50％；灭菌：对上述固体培养基质进行高压蒸汽灭菌，灭菌压力为0.1mpa，灭菌温度为123℃，灭菌时间为1.5h；接种：将灭菌后的固体培养基质冷却至常温，再将上述发酵菌丝体作为液体菌种接种到常温的固体培养基质上，接种量为1％；发酵培养：将接种后的固体培养基质置于黑暗环境中发酵，发酵温度为25℃，发酵湿度为30％，培养环境中每天通风3次，每次15分钟，发酵培养60天，即得到樟芝菌丝体。实施例2按以下配方准备各原料制备斜面培养基：马铃薯200g/l、葡萄糖15g/l、玉米粉30g/l、蛋白胨4g/l、硫酸镁0.5g/l、磷酸二氢钾1g/l、vb130mg/l、琼脂粉18g/l；将樟芝菌种接种在上述制备好的斜面培养基上进行活化与提纯，培养温度为28℃，得到活化好的母种；按以下配方准备各原料制备液体摇瓶培养基：马铃薯汁20g/100ml、葡萄糖1g/100ml、玉米粉3g/100ml、蛋白胨1g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、磷酸二氢钾0.1g/100ml、vb10.005g/100ml及琼脂粉0.1g/100ml；将上述活化好的母种接种到液体摇瓶培养基中进行摇瓶培养，上述摇瓶培养的培养温度为28℃，静置培养3天，待菌丝萌发且无污染后将摇瓶放置于磁力搅拌器上进行搅拌培养，上述搅拌培养的培养温度为28℃，培养时间为7天，获得摇瓶种；按以下配方准备各原料制备发酵培养基：马铃薯汁30g/100ml、葡萄糖3g/100ml、玉米粉1g/100ml-5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、磷酸二氢钾0.1g/100ml、vb10.01g/100ml、琼脂粉0.1g/100ml；将上述摇瓶种接种到发酵罐内的发酵培养基上进行发酵培养，上述发酵罐的罐压为0.05mpa，通气量为1:1，接种量为5％，培养温度为27℃，培养时间为6天，得到发酵菌丝体；将上述发酵菌丝体作为液体菌种接种到人工合成固体培养基质上并发酵培养，步骤为：配制固体培养基质：按以下配方准备各原料：小麦78％、石膏1％、白糖1％、黄豆粉10％、香樟木屑10％；将饱满的干小麦浸泡洗净后煮到熟而不烂，晾晒沥干水，分别将石膏、白糖、黄豆粉和香樟木屑放入小麦里混合均匀装入聚丙烯袋里或瓶里，得到上述固体培养基质，其含水量为55％；灭菌：对上述固体培养基质进行高压蒸汽灭菌，灭菌压力为0.15mpa，灭菌温度为122℃，灭菌时间为2.0h；接种：将灭菌后的固体培养基质冷却至常温，再将上述发酵菌丝体作为液体菌种接种到常温的固体培养基质上，接种量为5％；发酵培养：将接种后的固体培养基质置于黑暗环境中发酵，发酵温度为27℃，发酵湿度为45％，培养环境中每天通风3次，每次30分钟，发酵培养45天，即得到樟芝菌丝体。实施例3按以下配方准备各原料制备斜面培养基：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、玉米粉50g/l、蛋白胨5g/l、硫酸镁1g/l、磷酸二氢钾2g/l、vb150mg/l、琼脂20g/l；将樟芝菌种接种在上述制备好的斜面培养基上进行活化与提纯，培养温度为30℃，得到活化好的母种；按以下配方准备各原料制备液体摇瓶培养基：马铃薯汁50g/100ml、葡萄糖4g/100ml、玉米粉5g/100ml、蛋白胨1g/100ml、硫酸镁0.1g/100ml、磷酸二氢钾0.2g/100ml、vb10.01g/100ml及琼脂粉0.15g/100ml；将上述活化好的母种接种到液体摇瓶培养基中进行摇瓶培养，上述摇瓶培养的培养温度为33℃，静置培养3天，待菌丝萌发且无污染后将摇瓶放置于磁力搅拌器上进行搅拌培养，上述搅拌培养的培养温度为28℃，培养时间为6天，获得摇瓶种；按以下配方准备各原料制备发酵培养基：马铃薯汁50g/100ml、葡萄糖4g/100ml、玉米粉5g/100ml、蛋白胨1g/100ml、硫酸0.1g/100ml、磷酸二氢钾0.2g/100ml、vb10.01g/100ml、琼脂粉0.15g/100ml；将摇瓶种接种到发酵罐内的发酵培养基上进行发酵培养，发酵罐的罐压为0.08mpa，通气量为1:2.0，接种量为10％，培养温度为28℃，培养时间为4天，得到发酵菌丝体；将发酵菌丝体作为液体菌种接种到人工合成固体培养基质上并发酵培养，步骤为：配制固体培养基质：按以下配方准备各原料：小麦56％、石膏2％、白糖2％、黄豆粉20％、香樟木屑20％；将饱满的干小麦浸泡洗净后煮到熟而不烂，晾晒沥干水，分别将石膏、白糖、黄豆粉和香樟木屑放入小麦里混合均匀装入聚丙烯袋里或瓶里，得到上述固体培养基质，其含水量为51％；灭菌：对固体培养基质进行高压蒸汽灭菌，灭菌压力为0.15mpa，灭菌温度为121℃，灭菌时间为2.5h；接种：将灭菌后的固体培养基质冷却至常温，再将上述发酵菌丝体作为液体菌种接种到常温的固体培养基质上，接种量为10％；发酵培养：将接种后的固体培养基质置于黑暗环境中发酵，发酵温度为33℃，发酵湿度为58％，培养环境中每天通风3次，每次30分钟，发酵培养30天，即得到樟芝菌丝体。斜面培养基、摇瓶培养基、发酵培养基及人工合成固体培养基质均可在其各自配方范围内自由组合，各组分之和为100％。各培养温度、培养时间及接种量等均可在可选范围内根据实际情况调整。上述实验采用的樟芝菌种来自于中国台湾。本发明首次将牛樟芝液体发酵法和固体培养法结合起来，使这两种培养方法优势互补，克服了它们的缺点，在较短时间内获得大量的牛樟芝菌丝体，又不失药用价值。本发明在牛樟芝的固体培养基质中加入适量的黄豆粉和香樟树木屑能显著提高牛樟芝菌丝体中三萜类的含量，在以谷类为主要的基质中加入豆类和牛樟芝的近缘宿主香樟，使配方营养全面可培育出与野生牛樟芝具有相同药用价值的菌丝体。培养90天的牛樟芝菌丝体可达到野生牛樟芝的药用价值。本发明在牛樟芝的固体培养基质中加入等量不同的氮源以测其中三萜类化合物含量：麸皮、玉米粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏和黄豆粉,配方中的其它成分不变，发酵完成后测定添加不同氮源后牛樟芝菌丝体中三萜类化合物的含量，测量结果如下表1。表1.牛樟芝固体培养基质中加入等量不同氮源后菌丝体中三萜类化合物的含量名称添加量(g/kg)牛樟芝菌丝体中三萜类化合物的含量(mg/g)麸皮109.765玉米粉108.070酵母膏1011.700蛋白胨1010.548牛肉膏1010.809黄豆粉1017.787通过表1可以看出固体培养基质中添加黄豆粉能显著提高牛樟芝菌丝体三萜类化合物的含量。本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。当前第1页12