检测黄曲霉毒素B1的凝血酶联核酸适配体及检测方法与流程

本发明属于分析检测领域，涉及一种检测黄曲霉毒素b1的凝血酶联核酸适配体及检测方法。

背景技术：

黄曲霉毒素b1(aflatoxinb1，afb1)是一种毒性很强的真菌毒素，被摄入体内可以导致癌症。afb1的灵敏检测在食品安全、环境健康、质量监控等领域具有重要意义。目前常用的定量分析afb1的方法，主要包括色谱法和免疫分析法等。色谱法往往需要昂贵复杂的仪器设备，往往需要与荧光检测器或质谱检测器联用，测试成本高。免疫分析则需要采用针对afb1的免疫抗体，用于选择性分析afb1，构建分析传感方法，但是免疫抗体在制备和稳定性等方面存在局限性，制备费用高，不便于储存和运输，容易变性。

核酸适配体(aptamer)是从随机的寡聚核苷酸文库中筛选得到可以与目标分子特异结合的单链核酸分子。核酸适配体是一种新型的亲和配体，具有很多优点，例如筛选制备相对简单容易，制备成本低，容易引入功能团，具有较高的热稳定性等。核酸适配体的序列已知后，可以通过化学合成的方法制备，纯度高，批间重现性好，而且热稳定性好。核酸适配体在分析传感、疾病治疗等领域具有很大的应用潜力。黄曲霉毒素b1的核酸适配体已经被成功筛选得到，因此采用黄曲霉毒素b1的核酸适配体发展检测方法也成为可能。

凝血酶(thrombin)分子是血液中一种重要的酶分子，可以特异性地水解特定序列的多肽分子。利用凝血酶的核酸适配体可以特异性的捕获凝血酶，并进行分析检测。凝血酶分子可以催化水解特定的多肽小分子底物分子产生相应的信号变化。凝血酶分子具有很好的催化活性，而且容易获得。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测黄曲霉毒素b1的凝血酶联核酸适配体、试剂盒及检测方法。

本发明首先提供了一种既能够特异性结合黄曲霉毒素b1又能够特异性结合凝血酶的核酸适配体a。

所述核酸适配体a由能够与黄曲霉毒素b1特异性结合的核酸适配体a1和能够与凝血酶特异性结合的核酸适配体a2连接而成。所述核酸适配体a1为序列表中序列8所示的单链dna；所述核酸适配体a2为序列表中序列7所示的单链dna。

其中，所述连接可为直接首尾相连或者通过linker首尾相连；所述linker为3-6个核苷酸t，具体如3个t或者6个t。

所述直接首尾相连可为所述核酸适配体a1的3’末端与所述核酸适配体a2的5’末端直接相连，或者所述核酸适配体a2的3’末端与所述核酸适配体a1的5’末端直接相连。相应的，所述通过linker首尾相连可为通过所述linker将所述核酸适配体a1的3’末端与所述核酸适配体a2的5’末端相连，或者通过所述linker将所述核酸适配体a2的3’末端与所述核酸适配体a1的5’末端相连。

更加具体的，在本发明中，所述核酸适配体a为如下任一：

(a1)序列表中序列1所示的单链dna；

(a2)序列表中序列2所示的单链dna；

(a3)序列表中序列3所示的单链dna；

(a4)序列表中序列4所示的单链dna；

(a5)序列表中序列5所示的单链dna；

(a6)序列表中序列6所示的单链dna。

本发明所提供的用于检测黄曲霉毒素b1的凝血酶联核酸适配体，具体是将凝血酶与前文所述的核酸适配体a特异性结合后制得的。

本发明所提供的用于检测黄曲霉毒素b1的试剂盒，其中含有经bsa-afb1偶联物修饰的微孔板和如下(b1)或(b2)：

(b1)前文所述的核酸适配体a和凝血酶；

(b2)前文所述的凝血酶联核酸适配体。

其中，所述经bsa-afb1偶联物修饰的微孔板是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将含有bsa-afb1偶联物(sigmaaldrich公司，产品编号为a6655)的0.1mna2co3溶液(ph9.6)加入到微孔板(吸光光度检测法所采用的微孔板为透明的96孔板。荧光检测法所采用的微孔板为黑色的96孔板)的板孔中，4℃下温育12小时，然后经洗涤、封闭制得所述经bsa-afb1偶联物修饰的微孔板。更加详细的步骤可参见实施例2。

所述核酸适配体a或所述凝血酶联核酸适配体或所述试剂盒在检测黄曲霉毒素b1中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的检测黄曲霉毒素b1的方法，其原理如下：牛血清白蛋白(bsa)-afb1偶联物(bsa-afb1)被修饰到微孔板的微孔表面，从而将afb1修饰到微孔板的基底上。溶液中待测的afb1分子与固定在微孔板上的afb1分子与凝血酶标记的核酸适配体探针竞争性地结合。当待测溶液中不存在afb1时，凝血酶标记的核酸适配体探针只与微孔板基底上的afb1结合，凝血酶被修饰到微孔板的基底上。随着待测溶液中afb1的增多，修饰到微孔板上的凝血酶分子逐渐减少。修饰保留在微孔板基底上的凝血酶选择性催化水解特定的多肽底物生成产物，产生检测信号。根据所用的底物不同，可以产生相应的荧光信号或吸光度信号。根据检测信号的变化可以实现对afb1的检测。

所述检测黄曲霉毒素b1的方法，具体为方法i或方法ii：

所述方法i为荧光检测法，具体可包括如下步骤：

(c1)将前文所述的凝血酶联核酸适配体与待测溶液混合，得混合溶液。

(c2)将所述混合液加入到经bsa-afb1偶联物修饰的微孔板中进行温育，然后弃上清。

(c3)向所述经bsa-afb1偶联物修饰的微孔板中加入凝血酶的荧光多肽底物，进行酶反应，酶反应结束后测定荧光信号的强度值，从而实现对所述待测溶液中黄曲霉毒素b1的检测(既可为定量检测，也可为定性检测)。

所述方法ii为吸光光度检测法，具体可包括如下步骤：

(d1)将前文所述的凝血酶联核酸适配体与待测溶液混合，得混合溶液。

(d2)将所述混合液加入到经bsa-afb1偶联物修饰的微孔板中进行温育，然后弃上清。

(d3)向所述经bsa-afb1偶联物修饰的微孔板中加入凝血酶的生色多肽底物，进行酶反应，酶反应结束后测定吸光度值，从而实现对所述待测溶液中黄曲霉毒素b1的检测(既可为定量检测，也可为定性检测)。

在步骤(c2)和(d2)中，进行所述温育的条件均可为4℃温育30分钟。

在步骤(c3)和(d3)中，进行所述酶反应的条件均可为37℃反应2小时。

在步骤(c2)和(c3)之间，以及步骤(d2)和(d3)之间，还包括洗涤的步骤。

在所述方法i中，当为定量检测时，步骤(c3)具体可按照如下确定所述待测溶液中黄曲霉毒素b1的含量：当所述酶反应结束后，将所测定的荧光信号的强度值代入标准曲线方程，从而计算所述待测溶液中黄曲霉毒素b1的含量；所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知浓度的黄曲霉毒素b1标准品溶液替代所述待测溶液进行步骤(c1)-(c3)，测得各浓度的黄曲霉毒素b1标准品溶液对应的荧光信号的强度值，从而获得黄曲霉毒素b1的浓度与荧光信号的强度值之间的标准曲线方程。当为定性检测时，步骤(c3)具体可按照如下确定所述待测溶液中是否含有黄曲霉毒素b1：当所述酶反应结束后，若所测定的荧光信号的强度值显著低于对照值，则所述待测溶液中含有或候选含有黄曲霉毒素b1；反之，则所述待测溶液中不含有或候选不含有黄曲霉毒素b1。其中，所述对照值为用不含有黄曲霉毒素b1的溶液替代所述待测溶液进行步骤(c1)-(c3)所测得的荧光信号的强度值。

在所述方法ii中，当为定量检测时，步骤(d3)具体可按照如下确定所述待测溶液中黄曲霉毒素b1的含量：当所述酶反应结束后，将所测定的吸光度值代入标准曲线方程，从而计算所述待测溶液中黄曲霉毒素b1的含量；所述标准曲线方程按照如下获得：用系列已知浓度的黄曲霉毒素b1标准品溶液替代所述待测溶液进行步骤(d1)-(d3)，测得各浓度的黄曲霉毒素b1标准品溶液对应的吸光度值，从而获得黄曲霉毒素b1的浓度与吸光度值之间的标准曲线方程。当为定性检测时，步骤(d3)具体可按照如下确定所述待测溶液中是否含有黄曲霉毒素b1：当所述酶反应结束后，若所测得的吸光度值显著低于对照值，则所述待测溶液中含有或候选含有黄曲霉毒素b1；反之，则所述待测溶液中不含有或候选不含有黄曲霉毒素b1。其中，所述对照值为用不含有黄曲霉毒素b1的溶液替代所述待测溶液进行步骤(d1)-(d3)所测得的吸光度值。

在本发明的实施例中，所述凝血酶的荧光多肽底物具体为rhodamine110，bis-(p-tosyl-l-glycyl-l-prolyl-l-arginineamide)；所述凝血酶的生色多肽底物具体为n-p-tosyl-gly-pro-arg-p-nitroanilide。

本发明具有如下的优点和效果：

本发明采用凝血酶作为标记，利用凝血酶催化水解底物分子产生检测信号。将凝血酶的核酸适配体和afb1的核酸适配体偶联在一起，得到的核酸分子与凝血酶反应制得凝血酶标记的核酸适配体。凝血酶分子容易获得、催化反应活性高。凝血酶的适配体具有高亲和力和选择性，凝血酶的适配体序列短，通过化学合成法很容易将凝血酶的核酸适配体和afb1的适配体偶联在一起。本发明利用核酸适配体作为识别分子可以充分发挥核酸适配体在分析传感中的优势，如易制备、成本低、稳定性高、便于储存和运输等优势。利用凝血酶的不同类型的底物分子，可以分别建立荧光检测法和吸光光度法。本发明的方法具有易操作、灵敏度高等特点。利用凝血酶联核酸适配体法本发明实现了对afb1的灵敏检测。

附图说明

图1为不同序列探针对应的信号响应。

图2为利用凝血酶联核酸适配体荧光法检测afb1。

图3为利用凝血酶联核酸适配体吸光光度法检测afb1。

图4为利用凝血酶联核酸适配体荧光法检测afb1的选择性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

黄曲霉毒素b1，英文名为aflatoxinb1，简写为afb1，分子式为c17h12o6，cas号为1162-65-8，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#1042。

赭曲霉毒素a，英文名为ochratoxina，简写为ota，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#5012。

赭曲霉毒素b，英文名为ochratoxinb，简写为otb，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#5021。

伏马毒素b1：英文名为fumonisinb1，简写为fb1，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#2031。

伏马毒素b2：英文名为fumonisinb2，简写为fb2，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#2041。

玉米赤霉烯酮：英文名为zearalenone，简写为zae，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为std#4012。

透明的96孔板：corning公司，产品编号costar3590。

黑色的96孔板：thermofisherscientific公司，型号nuncmaxisorp。

牛血清白蛋白(bsa)：sigmasigmaaldrich公司。

bsa-afb1偶联物：sigmaaldrich公司，产品编号为a6655。

凝血酶：humanα-thrombin，haematologictechnologiesinc公司。

生色多肽底物：n-p-tosyl-gly-pro-arg-p-nitroanilideacetatesalt，sigmaaldrich公司。

荧光多肽底物：rhodamine110，bis-(p-tosyl-l-glycyl-l-prolyl-l-arginineamide)，invitrogen公司。

封闭溶液：10mmtris-hcl(ph7.5)，20mmmgcl2，50mmnacl和10mg/mlbsa。

结合反应缓冲溶液：10mmtris-hcl(ph7.5)，20mmmgcl2，50mmnacl和1mg/mlbsa。

洗涤溶液：10mmtris-hcl(ph7.5)，20mmmgcl2，50mmnacl和0.1％(体积百分含量)tween-20。

多功能酶标仪：synergyh1microplatereader,biotek,usa。

实施例1、单链核酸分子的制备

既能够特异性结合黄曲霉毒素b1又能够特异性结合凝血酶的核酸适配体(单链dna分子)通过化学合成方法制备。凝血酶适配体(序列7)和afb1适配体(序列8)通过两种不同的方式偶联在一起，凝血酶适配体的3’端和afb1适配体的5’端连接在一起，两者之间加入不同数目的核苷酸t(序列1-3)。或者，afb1适配体的3’端和凝血酶适配体的5’端连接在一起，两者之间加入不同数目的t，制得相应单链核酸分子(序列4-6)。上述单链核酸分子由生工生物工程(上海)股份有限公司制备合成得到。

序列1：5'-agtccgtggtagggcaggttggggtgactgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccc-3'(简称为th-0t-a32)；

序列2：5'-agtccgtggtagggcaggttggggtgacttttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccc-3'(简称为th-3t-a32)；

序列3：5'-agtccgtggtagggcaggttggggtgactttttttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccc-3'(简称为th-6t-a32)；

序列4：5'-gggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccagtccgtggtagggcaggttggggtgact-3'(简称为a32-0t-th)；

序列5：5'-gggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgccctttagtccgtggtagggcaggttggggtgact-3'(简称为a32-3t-th)；

序列6：5'-gggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttttttagtccgtggtagggcaggttggggtgact-3'(简称为a32-6t-th)。

实施例2、制备afb1-bsa偶联物修饰的微孔板

吸光光度检测法所采用的微孔板为透明的96孔板。荧光检测法所采用的微孔板为黑色的96孔板。100微升含有10μg/mlbsa-afb1偶联物的0.1mna2co3溶液(ph9.6)加入到微孔板的板孔中，4℃下温育12小时。150微升洗涤溶液洗3次，然后加入300微升封闭溶液，37℃下温育1小时，封闭板孔。300微升洗涤溶液洗一次，制得afb1-bsa偶联物修饰的微孔板。

实施例3、考察不同序列探针的信号响应

将相同浓度的实施例1制备的各单链核酸分子与凝血酶在结合反应缓冲溶液中在4℃下温育30分钟，凝血酶结合到单链核酸分子上，分别制得在不同序列探针上标记了凝血酶的凝血酶联核酸适配体，然后采用荧光检测法考察不同序列探针对应的信号响应。100微升结合缓冲液中包含afb1(10nm或0nm)和10nm凝血酶标记的单链核酸分子作为待测溶液，溶液加入到实施例2制备得到的bsa-afb1偶联物包被的黑色微孔板的微孔中，4℃下温育30分钟。然后，弃去上清液，用洗涤溶液洗涤3次(每次每孔加入300微升洗涤溶液)。微孔中加入100微升荧光多肽底物溶液(0.027mm)，37℃下反应2小时。采用多功能酶标仪测定525nm处的荧光强度(485nm激发光)，

结果如图1所示。然后，比较不同序列核酸探针对应的检测信号，其中空白样品对应的样品中不含有afb1产生较高的荧光信号，而10nmafb1的样品都使荧光信号显著降低，表明溶液中afb1会与微孔表面包被的afb1竞争，使微孔表面上修饰的凝血酶分子减少。结果表明不同序列的核酸探针分子都可以用于检测afb1，信号响应的程度有些不同。

实施例4、利用凝血酶联核酸适配体荧光法检测afb1

将相同浓度的实施例1制备的单链核酸分子th-3t-a32(序列2)与凝血酶在结合反应缓冲溶液中在4℃下温育30分钟，凝血酶结合到th-3t-a32上。100微升结合缓冲液中包含不同浓度的afb1和10nm凝血酶标记的th-3t-a32作为待测溶液，溶液加入到实施例2中制备得到的bsa-afb1偶联物包被的黑色微孔板的微孔中，4℃下温育30分钟。然后，弃去上清液，用洗涤溶液洗涤3次(每次每孔加入300微升洗涤溶液)。微孔中加入100微升荧光多肽底物溶液(0.027mm)，37℃下反应2小时。采用多功能酶标仪测定525nm处的荧光强度(485nm激发光)。每种afb1浓度设置2个重复处理，结果取平均值。

结果见图2，随着afb1浓度增加，检测信号逐渐下降，检测限为0.49nm，检测范围为0.49nm到250nm。

实施例5、利用凝血酶联核酸适配体吸光光度法检测afb1

将相同浓度的实施例1制备的单链核酸分子th-3t-a32(序列2)与凝血酶在结合反应缓冲溶液中在4℃下温育30分钟，凝血酶结合到th-3t-a32上。100微升结合缓冲液中包含不同浓度的afb1和10nm凝血酶标记的th-3t-a32作为待测溶液，溶液加入到实施例2中制备得到的bsa-afb1偶联物包被的透明微孔板的微孔中，4℃下温育30分钟。然后，弃去上清液，用洗涤溶液洗涤3次(每次每孔加入300微升洗涤溶液)。微孔中加入100微升生色多肽底物溶液(0.37mm)，37℃下反应2小时。采用多功能酶标仪测定405nm处的吸光度。每种afb1浓度设置2个重复处理，结果取平均值。

结果见图3，随着afb1浓度的增加，检测信号逐渐降低，检测限为0.49nm，检测范围为0.49nm到125nm。

实施例6、利用凝血酶联核酸适配体荧光法检测afb1的选择性

将相同浓度的实施例1制备的单链核酸分子th-3t-a32(序列2)与凝血酶在结合反应缓冲溶液中在4℃下温育30分钟，凝血酶结合到th-3t-a32上。100微升结合缓冲液中包含不同样品和10nm凝血酶标记的th-3t-a32作为待测溶液，溶液加入到实施例2中制备得到的bsa-afb1偶联物包被的黑色微孔板的微孔中，4℃下温育30分钟。然后，弃去上清液，用洗涤溶液洗涤3次(每次每孔加入300微升洗涤溶液)。微孔中加入100微升荧光多肽底物溶液(0.027mm)，37℃下反应2小时。采用多功能酶标仪测定525nm处的荧光强度(485nm激发光)。每种样品设置2个重复处理，结果取平均值。

结果如图4所示，afb1浓度为10nm，其余待测物(ota，otb，fb1，fb2，和zae)浓度均为100nm。空白样品对应的信号高，而afb1存在时信号显著降低。当其他待测物(ota，otb，fb1，fb2，和zae)存在时，所得信号与空白样品对应的信号接近。当100nm其他待测物(ota，otb，fb1，fb2，或zae)与10nmafb1共存时，不影响检测afb1。结果表明检测方法检测afb1具有很好的选择性，其他考察的待测物不影响检测afb1。

<110>中国科学院生态环境研究中心

<120>检测黄曲霉毒素b1的凝血酶联核酸适配体及检测方法

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