GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及gdf11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。

背景技术：

生长分化因子-11(growthdifferentiationfactor11，gdf-11)，又称为骨形态发生蛋白-11，属于转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ，tgf-β)超家族的一种分泌性蛋白。tgf-β超家族包括转化生长因子(tgf-βs)、骨形态发生蛋白(bmps)、生长分化因子(gdfs)等亚家族，广泛存在于从线虫到哺乳类动物之中，在机体的免疫调节、细胞生长和分化、细胞外基质的合成和贮存、胚胎发育、创伤修复等方面都发挥着重要的作用。作为tgf-β超家族成员，gdf-11在胚胎发育中也发挥着举足轻重的作用。gdf-11先后在尾芽、肢芽、背根神经节、脊索背侧区、成齿质细胞、嗅上皮、视网膜和脑的特定区域、前肠及后肾间充质中表达，参与中轴骨骼模式图的形成，牙髓细胞的分化，软骨的形成，胰腺的发育，肌细胞的生成及神经再生等过程。新近的研究还发现gdf-11具有明显的抑制甚至逆转心脏、骨骼肌等器官老化，改善大脑认知的作用。

中国专利申请(cn105770860a)公开了生长分化因子-11在促进糖尿病伤口愈合中的用途，属于医药技术领域。本发明通过建立由有效浓度的链脲佐菌素(stz)诱导的i型糖尿病小鼠伤口模型，评估了生长分化因子-11对糖尿病小鼠伤口模型伤口愈合情况的影响，研究发现生长分化因子-11可以促进糖尿病小鼠伤口的愈合，且其愈合速度均高于阳性对照组(egf)和空白对照组。因此，本发明的提出为糖尿病伤口愈合治疗提供了一种有效的技术手段。

目前gdf11对于骨髓干细胞成骨方面的影响仍不能确定，但是gdf11对于脂肪来源的间充质干细胞成骨分化的影响尚无报道。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了gdf11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。

所述gdf11可以促进成骨诱导液的成骨能力，也能够单独诱导脂肪间充质干细胞成骨分化。

本发明利用基因工程技术构建pet-22b-gdf11的bl21原核表达菌，其中所用pcr引物为：gdf11-f5'aaaaagacagctatcgcga3'为上游引物gdf11-r5'cccaagcttgccggatccttaagagca3'为下游引物，上下游引物中分别引入了bamhi和hindiii酶切位点。本发明以人来源的正常细胞的cdna为模板pcr扩增得到gdf11片段，利用bamhi和hindiii酶对pet-22b质粒以及gdf11pcr片段经行酶切，连接，转化入大肠杆菌bl21，通过对氨苄抗性的筛选挑出转化成功的单克隆菌，扩大培养后提取质粒，并作为模板进行菌落pcr，在300bp左右有目的条带出现。以及再次使用bamhi和hindiii双酶切出现了一条5000bp以上的条带，为pet-22b(5500bp左右)质粒，还有一条300bp左右的gdf11目的条带。通过测序最终表明构建的pet-22b-gdf11质粒是成功的。

本发明通过发酵生产、镍柱分离纯化，最终得到纯度较高的gdf11蛋白。

本发明通过茜素红染色以及成骨相关基因蛋白的检测探究gdf11对脂肪干细胞成骨分化影响，结果发现gdf11添加浓度为600ng/ml，900ng/ml时，有明显的染红的钙结节的形成。其中900ng/ml的效果最好，染得颜色最深。表明高浓度的gdf11有诱导ascs的成骨分化的能力，其中900ng/ml的gdf11诱导效果最好。通过q-pcr的数据可以发现添加900ng/ml的gdf11，7天时成骨相关的基因alp，ost，runx2都显著的上调，而14天时ost有明显的上调，而alp以及runx2有较明显的上调。westernblot的数据也表明，通过添加900ng/mlgdf11可以使ascs的alp，runx2蛋白表达量上调，同时还可以诱导骨形成蛋白opn的表达。

此外，本发明通过bmp信号通路研究初步探讨了gdf11诱导成骨分化的分子机制。通过westernblot实验发现，gdf11(900ng/ml)在1h，6h以及12h时可以磷酸化ascs的smad1/5/8。接着使用smad1/5/8通路抑制剂(ldn-193189)进行实验，发现抑制剂在200ng/ml时可以完全抑制gdf11对ascs磷酸化的smad1/5/8激活作用。另外，本发明将gdf11和抑制剂同时加入ascs完全培养基，相比于只添加gdf11组，基本不会促进ascs的成骨分化。说明gdf11确实是通过smad1/5/9这条通路刺激ascs的成骨分化。本发明为gdf11的临床应用奠定了理论基础。具有潜在治疗骨质疏松药物的开发应用。

附图说明

图1是实验技术路线流程图；

图2是pet-22b表达质粒图谱；

图3是pet-22b-gdf11质粒构建及鉴定图谱(a)gdf11扩增片段m：marker；1、2gdf11片段(b)菌落pcr，m：marker；1、2：gdf11片段(c)双酶切鉴定m：marker；1：质粒酶切；

图4是gdf11蛋白诱导表达(a)gdf11蛋白诱导m：marker；1：未加诱导剂；2：添加1mmoliptg(b)gdf11包涵体检测m：marker；1：上清；2：包涵体；

图5是gdf11蛋白表达条件优化(a)不同浓度的iptg对gdf11表达的影响；(b)不同时间和温度对gdf11表达的影响；

图6是gdf11蛋白分离纯化(a)gdf11过柱分离m：maker；1：未处理样品；2：过柱废液；3：30mm咪唑；4：100mm咪唑；5：200mm咪唑；6、300mm咪唑(b)gdf11复性纯化m：maker；1，2：gdf11复性液；

图7是ascs提取与表面标记鉴定；

图8是ascs诱导分化(a)未处理ascs；(b)成软骨分化；(c)成脂分化(d)成骨分化；

图9是不同浓度的gdf11联合成骨诱导液处理ascs14天后对成骨分化的影响cell：未处理；osteogenic：成骨诱导液；b+gdf11浓度(成骨诱导液+33.3ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、900ng/ml)；

图10是不同浓度的gdf11对ascs成骨分化的影响；

图11是gdf11诱导ascs成骨相关基因的表达，cell：对照组；gdf11：gdf11900ng/ml；

图12是成骨相关蛋白表达cell：对照组；实验组：gdf11900ng/ml；

图13是(a)900ng/ml的gdf11处理ascs1h、6h、12h后p-smad1/5/8蛋白表达；(b)ldn-193189抑制gdf11诱导smad1/5/8蛋白的磷酸化；(c)cell：对照组；gdf11：gdf11900ng/ml；g+l：gdf11+200ng/mlldn-193189

具体实施方式

下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1利用基因工程技术构建pet-22b-gdf11的bl21原核表达菌

(一)gdf11片段扩增

(1)pcr：gdf11-f5'aaaaagacagctatcgcga3'为上游引物gdf11-r5'cccaagcttgccggatccttaagagca3'为下游引物，以人来源的正常细胞的cdna为模板pcr扩增gdf11片段。扩增的体系如下表1所示：

表1pcr扩增体系

pcr反应体系如下表2所示：

表2pcr反应体系

按上述条件扩增gdf11dna片段。

(2)琼脂糖核酸电泳

①琼脂糖凝胶的配制：往锥形瓶中先加入取事先称量的0.3g琼脂粉，再添加事先稀释的1×的30mltae缓冲液，最终为1％的凝胶液。使用微波炉加热溶解琼脂粉，加热条件为高火1min。取出加热后的锥形瓶放入冷水槽内冷却至50℃左右，用手握住不会烫手。再加入1μl的eb摇晃均匀后快速导入板槽中，记住不要有气泡，最后插上梳子，等待其凝固后备用。

②上样：取上述pcr产物50μl加入10×loadingbuffer2μl，用枪吹打均匀。拔出上述凝固的琼脂糖凝胶的梳子，转移入电泳槽，电泳槽中的缓冲液需要没过凝胶表面。用枪吸取pcr混合物轻轻加入凝胶孔中，另取10μl的dnamark加在样品左侧孔内。

③跑胶：插入电源，注意红为正极，黑为负极，电泳正反极千万不要弄错。电压调节为100v，打开电源，根据样品泳动的位置确定时间，位置为胶长的2/3处电泳时间，大概25min左右。

④观察核酸片段。跑完胶后，关闭电源，取出凝胶；打开凝胶成像仪，将凝胶置于紫外灯下合适位置，打开紫外，观测拍照。

(3)胶回收

①与紫外灯下按照marker用刀片延边缘切下包含目的基因的凝胶，放入事先称重的1.5ml离心管，再称重做好标记。这里我们使用的是omegagelextractionkit试剂盒。

②凝胶块称重后按1g凝胶加入1ml的比例加入bindingbuffer，加完后恒温器中58℃加热融化，每5min涡旋震荡一次，直到凝胶完全融为液体。

③将收集管套入废液管中，用移液器将ep管中上述溶解的液体转移收集管中，离心10000g，1min，弃废液。

④向收集管的柱子中加300μl的bindingbuffer，离心10000g，1min，弃废液。

⑤向收集管的柱子中加700μl的spwwashingbuffer，离心10000g，1min，弃废液。

⑥重复上一步。

⑦空柱离心13000g，2min，弃废液。

⑧收集管套入新的ep管上，加入20～30μl的3d水，室温静置2-3min。

⑨离心13000g，2min，最终ep管中的液体即为回收的dna样品溶液，-20℃保存。

(4)测浓度

使用微量测量仪，按仪器操作说明书测定dna浓度以及纯度。

(二)gdf11表达质粒构建

(1)双酶切：用bamhi和hindiii酶切pet-22b质粒和上述扩增的gdf11dna片段，酶切体系如下表3所示：

表3酶切体系

反应条件为37℃，8～10h。

(2)酶切后跑胶回收并测浓度。

(3)连接：用t4连接酶将酶切后的pet-22b质粒和gdf11片段连接，构建pet-22b-gdf1。连接体系如下表4所示：

表4连接体系

16℃，连接过夜，连接后将质粒导入bl21大肠杆菌。

(三)感受态制备及转化

(1)bl21感受态的制备：先接种一支5ml的不含构建质粒的bl21大肠杆菌，37℃，180rpm培养8h后，接到100ml的lb培养基中，37℃，180rpm，培养至od600＝0.5(此时菌的活力最好)；将养好的菌分装到50ml的灭菌的干净离心管中，冰浴30min；接着4000rpm，4℃，10min离心后弃上清，留菌体，加入10ml预冷的cacl2(0.1mol/l)冰浴5min；继续4000rpm，4℃，10min离心5min后弃上清，留菌体，最后加入3.2ml的预冷cacl2(0.1mol/l)以及0.8ml的50％甘油，混匀后分装，放置于-80℃备用。

(2)转化：将上述连接的质粒取10μl与上述制备的bl21感受态50μl加入到1.5ml的灭菌ep管中(轻轻摇晃均匀)，冰上放置30min后42℃水浴90s后取出放入冰中2min，再加入450μl的lb培养基，37℃，100～150rpm温育45min；取出100μl已转化的感受态细菌铺入含氨苄的lb固体培养板中，37℃培养12～16h。

(3)菌体筛选：挑单克隆菌落于新的加入氨苄的5mllb液体培养基中，37℃，180rpm摇床12h。在超净台内取出1ml的菌体于ep管内，10000rpm，离心1min，收集菌体。取30μl的3dh2o重悬菌体，100℃，10min，放入-20℃冷冻10min后常温融化，离心后取上清5μl为模板菌落pcr用来验证其质粒是否转入菌中。验证正确后保菌。

(四)重组质粒鉴定

(1)质粒提取：

①将单克隆挑选的菌种培养后，取100μl转接到另一试管中，37℃，180rpm摇菌过夜。

②菌体收集：将上述摇菌过夜的lb培养基倒入新的ep管内，离心10000g，1min，弃上清，收集细菌沉淀。

③omega公司的质粒小量抽提试剂盒按说明步骤提取质粒。

④每个ep管中加入250μlsolutioni重悬菌体，solutioni使用前加入rnasea，混匀，4℃存放，可用移液器吹打重悬。

⑤再向ep管中加入250μlsolutionii，轻轻颠倒混匀，室温静置5min，使细菌充分裂解至溶液透明。

⑥向ep管中再加入350μlsolutioniii，轻轻颠倒混匀，见白色絮状物生成即可。

⑦室温离心13000g，10min。

⑧将上一步骤离心后的上清液用移液器小心转移到质粒纯化柱中，切记不可吸取管内沉淀。离心13000g，1min，弃废液。

⑨在质粒纯化柱内加入500μlbufferhb，离心13000g，1min，弃废液。

⑩在质粒纯化柱内加入750μldnawashbuffer，离心13000g，1min，丢弃废液。注dnawashbuffer先需加入54ml无水乙醇，混匀，4℃存放。

空柱离心13000g，2min，除去残留液体。

将质粒纯化柱置于1.5ml新的ep管上，并加入50μl3d水，室温放置3-5min。

离心13000g，1min，ep管内液体即为提取质粒，测浓度。

(2)菌落pcr：

接菌至5ml的lb培养基，37℃180rpm培养过夜，取菌液于ep管中，10000rpm，1min，弃上清，收集菌体。取50μlpbs将菌体重悬，重悬后放入金属浴锅100℃，10min，再放入-20℃冷冻，反复2，3次将细胞壁破碎，使菌体内部质粒释放，最后10000rpm，1min取上清作为模板。扩增检测的体系如下表5所示：

表5pcr扩增体系

pcr反应体系参考前面步骤。

(3)双酶切鉴定：按照(二)中的步骤方法双酶切即可。

(4)提取的质粒由生工测序公司测序。

实施例2发酵生产、镍柱分离纯化得到gdf11蛋白

(1)gdf11蛋白的检测

①将挑选检测的菌接入一支5ml的lb液体培养基，37℃，180rpm培养12h。

②取1ml的菌10000rpm，离心1min，弃上清。

③加入50μl的3dh2o重悬菌体，100℃加热，10min，再在-20℃反复冻融两到三次，使菌体外的细胞壁破裂。

④在进行10000rpm，1min离心。取上清为s1，取沉淀加入10％sds溶解为s2。

⑤s1和s2分别跑胶，考马斯蓝染色，和未转染质粒的bl21大肠杆菌的溶解液比较，检测出是否有目的蛋白生成。

(2)考马斯蓝染色

①sds-page胶的配制：8％分离胶的配制(20ml)，各成分如下表6所示：

表68％分离胶成分

将分离胶用枪快速打入玻璃板的夹层中，一块板加4～5ml的下胶，之后再用75％酒精将下胶压平，之后室温放置20～30min，待分离胶凝固后再倒掉酒精，放置5min。

5％浓缩胶的配制(10ml)，各成分含量如下表7所示：

表75％浓缩胶成分含量

用枪头将配制好的浓缩胶快速灌满胶板并插入梳子，室温放置20～30min待其凝固后，放置入电泳槽中准备进行上样。

②上样：将样品加入5×的蛋白loadingbuffer，金属浴100℃，10min。用10μl移液器将样品加入胶孔内。并在样品旁边加入5μl的蛋白maker。

③电泳：连通电源，注意正反极，先60v电泳30min，压缩样品为一条直线，跑完浓缩胶，再换成120v电泳90min～120min直到跑完分离胶。

④染色：将跑完的凝胶切下来放入器皿中，加考拉斯亮蓝，放入摇床室温染色4h左右。

⑤脱色：考马斯亮蓝回收，用纯水冲洗摇晃3次，再加入脱色液，放入摇床上低速摇动，大约2h，直至背景颜色脱完，中间可以换洗脱液。

⑥拍照记录。

上述构建成功的菌体使用1mmol的iptg诱导后，如图4所示，发在35kda左右出现诱导表达的、gdf11条带。接着检测了蛋白的可溶性，收集菌体后超声破碎，离心后，分别取上清和沉淀跑胶，经考马斯亮蓝染色发现，目的蛋白存在于沉淀中。说明诱导表达的gdf11蛋白是以包涵体的形式存在。

(3)gdf11蛋白表达优化

①诱导剂的优化：为确定诱导剂的最佳浓度，使用iptg浓度分别0.5mm、1mm和1.5mm，诱导的条件都为37℃，180rpm，诱导时间都为6h，按上面的步骤处理后，使用sds-page考马斯蓝染色检测目的蛋白相对表达量，确定诱导剂的最佳浓度。

②温度时间的优化：为确定诱导时间和温度，收集30℃和37℃，180rpm，1mm的iptg诱导6h，7h，8h，9h表达菌，使用sds-page考马斯蓝染色检测目的蛋白相对表达量，确定最佳的诱导时间和温度。

由图5可知，不同浓度的iptg、时间以及温度都对gdf11的表达没有影响。

(4)gdf11蛋白分离纯化

菌体收集处理：使用发酵罐大量培养构建菌，通过沉淀离心收集菌体，收集完的菌体按一下步骤处理：

①重悬菌体：称量菌体湿重，以1：10的比例加入pbs(ph8.0)，使用振荡器重悬菌体，混匀。

②超声波破碎：将金属探头伸入液体里，冰浴低温超声。超声条件为功率15％、超声时间3s、间隙时间6s、超声总时间15min，超声次数3次。

③离心：使用高速冷冻离心机，低温4℃、17000g、30min，收集沉淀，上清、沉淀分别留样s3、s4。

④样品预处理：以1：10的比例加入样品洗液重悬沉淀。使用高速冷冻离心机离心，低温4℃、17000g、30min，收集沉淀。此步骤重复2～3次，每次上清留样s5、s6、s7，最后一次离心沉淀留样s8。

⑤尿素处理：以1：10的比例加入elutionbuffer重悬沉淀，浸泡过夜。

⑥离心：高速冷冻离心机离心，低温4℃、17000g、30min，取上清，上清和沉淀分别留样s9、s10。抽滤，留样电泳。

蛋白分离纯化：处理完的样品洗液先用滤纸粗过滤一遍，接滤液后过柱，分离纯化的柱子为ni²⁺。过柱前，先加少量水压平液面，后装上柱子，快速压入，直到没有汽包生成。接着用纯水过柱，直到柱内充满纯水(洗柱)；再用elutionbuffer过柱，直到柱内的纯水都被elutionbuffer替代为止，最后在以1.5μl/s的速度上样。样品上完后，使用30mm浓度的咪唑洗脱至od值稳定，再用100mm，200mm，300mm浓度的咪唑各洗脱一次，每次的洗脱液保留待检测。

蛋白复性：将检测含目的蛋白的洗脱液收集测浓度后，将蛋白用elutionbuffer稀释至0.05mg/ml，先将透析袋100℃煮沸10min，再装入透析袋(不得超过透析袋容积的三分之一)，分别放入4m，2m，1m，0.5m，0.05m的脲透析液中透析，每12h换一次透析液，透析完后收集透析复性液，4℃，3500rpm，45min超滤离心，浓缩蛋白后得到最终蛋白产物，过滤除菌后分装于-80℃保存备用。纯化结果，如图6所示。

试验例1通过茜素红染色以及成骨相关基因蛋白的检测探究gdf11对脂肪干细胞成骨分化影响

(一)ascs成骨诱导

(1)消化计数：将培养于t75细胞瓶中的ascs按细胞消化的方法，利用培养基将ascs吹打成悬浮状态，用细胞计数器计算密度。

(2)铺板：添加培养基将上述计数好的ascs稀释到1×10⁶个/ml，利用枪吹打均匀后接种到灭菌的细胞培养6孔板中。

(3)换液诱导：将铺好板的6孔板放入细胞培养箱内，24h后等ascs贴壁后取出换液。换液时先将原先的培养基小心沿壁小心吸出，每孔再加入1ml的pbs，轻轻摇晃后吸走，重复2次后，添加成骨诱导液2ml，放入培养箱培养，每隔3天左右换液一次。

(4)添加gdf11：将不同浓度的gdf11(33.3ng/ml，100ng/ml，300ng/ml，600ng/ml，900ng/ml)添加到ascs培养基中培养细胞。

(二)茜素红染色

细胞成骨诱导分化完后将成骨诱导液弃去，pbs洗3遍，再加入4％的多聚甲醛固定30min。弃除多聚甲醛，pbs洗两遍，再加入配好的茜素红染液染3-5min。最后除去茜素红，pbs洗两遍，拍照记录，观察其是否能够诱导脂肪干细胞成骨分化。结果发现在600ng/ml，900ng/ml时，有明显的染红的钙结节的形成。其中900ng/ml的效果最好，染得颜色最深。通过显微镜(50×)可以看到在600ng/ml，900ng/mlgdf11的诱导下形成的钙结节。表明高浓度的gdf11有诱导ascs的成骨分化的能力，其中900ng/ml的gdf11诱导效果最好(如图9所示)。

(三)成骨相关基因检测

(1)ascs总rna的抽提：一瓶t25加入trizol试剂1ml，室温静置2～3min后，将细胞吹打下来装入1.5ml的进口ep管中；ep管中加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5min。离心12000g，15min。离心后分为三层，上层澄清含有rna，中间一层为白色蛋白，底层为dna杂质。轻轻吸取上层水相(约400μl)，千万不要吸取其他层的液体，会污染rna，吸取的液体为澄清白色；将吸取的上层水相中加入等量的异丙醇(约400μl)，再轻轻吹打混匀，室温静置5min后，离心12000g，15min，离心后白色羽毛状的rna沉淀于ep管底；将上清弃去，加入1ml的75％乙醇将沉淀洗涤，离心8000g，10min；离心后，弃上清，ep管倒扣在干净的纸巾上，除去多余乙醇。静置1min，最后加入15-30μl的depc水溶解；用超微量紫外分光光度计，测定rna浓度，od260/od280值应在1.8～2.0之间。dna污染会使od＞2.0；蛋白质污染会使od＜1.8。

(2)逆转录：逆转录反应：可参照primescripttmrtreagentkit(perfectrealtime)试剂盒。其反应体系如下表8所示：

表8反应体系

逆转录条件：37℃15min；85℃5s。将逆转录的cdna做好标记，可立即进行荧光定量pcr或-20℃保存备用(保存时间不要超过一个月)。

(3)荧光定量：按试剂盒要求，其反应体系如下表9所示：

表9荧光定量pcr反应体系

按上面配置好的反应混合物加入到反应板中，每孔10μl，三个复孔，加完后4℃离心1500r/min5min，开始进行real-time，其反应条件如下表10所示：

表10real-time反应条件

由图11可以发现添加900ng/ml的gdf11，7天时成骨相关的基因alp，ost，runx2都显著的上调，而14天时ost有明显的上调，而alp以及runx2有较明显的上调。

4.4成骨相关蛋白检测

(1)蛋白浓度测定：根据之前的步骤，把不同组的ascs收集，用pbs洗涤3次，洗涤后。加入已经sds和pmsf(50:1)的裂解混合液(6孔板的一个孔加入50μl)，摇晃均匀后，使用细胞刮刮取细胞(最好在冰上经行此操作)，再用枪头将溶解细胞后的sds裂解液收集到1.5ml的ep管内。在金属浴上100℃加热10min，期间可以震荡混悬，煮完后液体会变得澄清，以10000g离心20min，后取上清液测定蛋白浓度。

bca试剂盒测定蛋白浓度的步骤如下：

①加入ddh2o到蛋白标准品中，将其稀释至100μl，其终浓度应为0.5mg/ml。

②加入a液和b液(体积50:1)混合均匀，为bca工作液，应现配现用。

③按照下表11配制蛋白标准样品，并用此绘制标准曲线。

表11蛋白标准样品配置

(4)取待测蛋白样品2ul混合加入38μlpbs，使待测样品稀释20倍，在往96孔板中加待测样品，每孔10μl，每个样品共三孔。加完样品后再加bca工作液100μl，充分混匀，37℃孵育30min，再用酶标仪测定od450值。

(5)根据样品所测的吸光值，利用标准曲线得出相应的蛋白含量(μg)，乘稀释的倍数20倍，便可得到真实蛋白浓度。将测定的蛋白样品稀释配比后加入适量的5×sdsloadingbuffer，摇匀后金属浴100℃煮10min，处理好以后便进行sds-page电泳。

②sds-page胶的配制：8％分离胶的配制(20ml)，如下表12所示：

表128％分离胶的配制

将分离胶用枪快速打入玻璃板的夹层中，一块板加4～5ml的下胶，之后再用75％酒精将下胶压平，之后室温放置20～30min，待分离胶凝固后再倒掉酒精，放置5min。

进行5％浓缩胶的配制(10ml)，具体成分如下表13所示：

表135％浓缩胶的配制

用枪头将配制好的浓缩胶快速灌满胶板并插入梳子，室温放置20～30min待其凝固后，放置入电泳槽中准备进行上样。

③跑胶转膜：电泳槽中加入电泳缓冲液，后拔出梳子，每孔可加入10μl到15μl的蛋白样品。将电源连接好进行电泳(注意正反极)。跑上胶的电泳条件为60v30min，样品跑至分离胶前都会被压成一条直线，跑到下胶时，电压改为100v。直到观察溴酚蓝到达板底部时停止电泳。接着取出胶板，撬开玻璃板，根据maker将含目的蛋白的胶切下来。利用尺子和铅笔，剪取相应大小的pvdf膜。并将膜放入甲醇中活化5min，接着按照从下往上的顺序放入一层海绵、三层滤纸、含目的蛋白的凝胶、pvdf膜、三层滤纸、一层海绵放入转膜架中，除气泡后加紧架子放到转膜槽中，加入转膜液进行转膜，恒压200ma，2h。转膜结束后将转入蛋白的pvdf膜放入tbs中清洗3次，每次5min。

④孵抗显影：将清洗好的膜放入5％脱脂奶粉的tbst中封闭，常温摇床放置1.5h；tbst洗膜3次，每次8min，洗完膜后孵育一抗，孵育条件4℃过夜；孵完一抗后用tbst液洗膜3次，每次8min，再加入加入二抗(鼠抗1：5000；兔抗1：8000)室温孵育1h；tbst洗膜3次，每次8min，洗完后将pvdf膜放到干净薄膜上，用ecl发光液用移液枪滴加到膜表面；用滤纸吸干多余的ecl液，在不含白光的环境中将pvdf膜置于暗盒中，在上面再放置三张胶片进行压片；根据蛋白发光程度的不同，压片时间不同。压完片后先后用显影液或定影液各浸泡5min左右，取出胶片后清水洗涤晾干并用扫描仪扫描。

由图12可知，通过添加900ng/mlgdf11可以使ascs的alp，runx2蛋白表达量上调，同时还可以诱导骨形成蛋白opn的表达。

试验例2通过bmp信号通路研究初步探讨了gdf11诱导成骨分化的分子机制

通过westernblot的实验发现，gdf11(900ng/ml)在1h，6h以及12h时可以磷酸化ascs的smad1/5/8，如图13a所示。接着使用smad1/5/8通路抑制剂(ldn-193189)进行实验，发现抑制剂在200ng/ml时可以完全抑制gdf11对ascs磷酸化的smad1/5/8激活，如图13b所示。将gdf11和抑制剂同时加入ascs完全培养基，相比于只添加gdf11组，基本不会促进ascs的成骨分化。说明gdf11确实是通过smad1/5/9这条通路刺激ascs的成骨分化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。