本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及用于检测α-地中海贫血的基因芯片及使用方法、试剂盒。
背景技术：
基因芯片(genechip)又称dna芯片(dnachip)、dna阵列(dnaarrays)、寡核苷酸微芯片(oligonucleotidemicro-chip)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对杂交信号的强度进行分析和处理，从而迅速得出所要的信息。目前，基因芯片技术正逐渐应用到生命科学各个领域中。
地中海贫血(thalassemia)，即珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血，是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或缺如，从而导致的一组遗传性溶血性疾病，是一组严重威胁健康的致残、致死性遗传血液病。临床表现根据病情严重程度不同而有所差异，患者主要以溶血性贫血、黄疸、肝脾肿大为主要临床特征。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，可分为α-地中海贫血、β-地中海贫血、γ-地中海贫血、δ-地中海贫血、δβ-地中海贫血和、εγδβ-地中海贫血等，其中α-地中海贫血最常见。中国南方地区人群中α-地中海贫血基因携带者检出率为2-18%，其中广西人群携带率最高，为17.55%。此病目前缺乏有效治疗手段，应用相应分析检测技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。
α-地中海贫血主要由α-珠蛋白基因发生缺失所引起，并且缺失范围具有很大的异质性，可以是仅涉及2个α-基因附近的几千个碱基对的缺失，更多的是包含2个α-基因在内的涉及几万到几十万碱基对的缺失，甚至整个α-珠蛋白基因簇的丢失。此外，还有只包含α-基因上游调控区的片段缺失。目前全球已鉴定的α-地中海贫血缺失超过20种，不同种族的α-珠蛋白基因的缺失谱不同，中国人最常见的是（--sea/）缺失突变，在广西地区该突变的携带者频率高达7.84%。目前临床上用来检测缺失型α-地中海贫血的常用方法是gap-pcr，首先利用多重gap-pcr检测中国人群3种常见α-地中海贫血缺失突变（-α3.7/）（-α4.2/）及（--sea/）；检测结果阴性的情况下，再继续检测非常见缺失类型（--thai/）及（--fil/）。但gap-pcr往往是根据已知缺失类型进行引物设计的，仅可检测已知缺失突变，检测范围十分有限，而且不能检测其他未知罕见的缺失类型，极有可能造成漏诊，导致重症患儿出生。此外，对于α-地中海贫血缺失突变也可利用多重连接探针扩增（mlpa）技术对其进行检测，虽然相较于gap-pcr而言，mlpa不但可以检测α-地中海贫血常见、非常见以及未知罕见缺失突变，但mlpa技术仍存在一定局限性，需要精确测量dna的浓度、样本容易被污染且存在一定假阳性的可能，尤其对于单个外显子缺失突变的情况，需要利用pcr的方法进行进一步的验证实验。总之，目前尚无一种快速、低成本、大通量和自动化检测α-地中海贫血缺失突变的方法。
比较基因组杂交（cgh）芯片分析技术是一种突破性技术，能够支持研究人员通过微阵列准确研究与疾病有关的染色体的变化。比较基因组杂交芯片分析的原理是在一张芯片上用两份标记不同荧光素的样品（检测样品和对照样品）同时进行杂交，从而快速而又直观地检测实验样品和对照样品之间基因组dna的拷贝数量的差异，提示样本dna在染色体特定位置存在的缺失或重复突变。因此，需要一种新的技术方案来克服现有技术的上述不足和缺点。
目前公开文献中也有关于检测α-地中海贫血的基因芯片的相关技术，下面是检索到相关的专利文献：
1、中国专利：诊断α-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒；申请号：200710074203.5；申请日：2007.04.25；申请人：亚能生物技术(深圳)有限公司；摘要：本发明涉及地中海贫血的诊断试剂，尤其涉及一种诊断α-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒。诊断α-地中海贫血的核酸膜条，用于检测α-珠蛋白基因突变/缺失的特异性寡核苷酸探针固定于基底上；诊断α-地中海贫血的试剂盒，包括：特异性扩增α-珠蛋白基因或转录本的引物，和用于检测α-珠蛋白基因突变/缺失的特异性寡核苷酸探针。本发明所述的诊断α-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒制作成本低，其检测速度快、检测结果稳定，在检测α-珠蛋白基因缺失的同时可以检测出α-珠蛋白基因突变。在产前诊断中，避免了将含有点突变的重型地贫--/αtα胎儿误诊成轻型地贫--/αα的可能性，从而避免重型地贫儿的出生，减轻巨大的家庭负担及社会成本。
2、中国专利：用于诊断地中海贫血的dna芯片；申请号02117287.0；申请日：2002.04.23；申请人：亚能生物技术(深圳)有限公司；摘要：本发明涉及用于诊断地中海贫血的dna芯片及其制备方法，提供一种用于临床诊断α-型和β-型地贫的dna芯片，芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，根据迄今已知的α-和β-球蛋白突变基因的序列，根据dna序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的dna探针。本发明的用于地中海贫血疾病诊断的dna芯片，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间。
3、中国专利：一种α-地中海贫血基因检测试剂盒；申请号201610230900.4；申请日：2016.04.14；申请人：亚能生物技术(深圳)有限公司；摘要：本发明提供了一种可同时检测4种缺失型α-地中海贫血基因(-α3.7、-α4.2、--sea和--thai)和3种非缺失α-地中海贫血基因(αcsα、αqsα和αwsα)的试剂盒，包括dna芯片、pcr反应液i和pcr反应液ii，所述dna芯片包括基底和固定于所述基底上的探针。本发明的有益效果在于：采用pcr-反向点杂交的检测原理，根据各基因型的突变或缺失位点，设计相应的扩增引物和探针，以生物素标记引物，以氨基标记探针，并以dna芯片(尼龙膜)为基底，将探针固定在尼龙膜上，通过特异性引物扩增出来的pcr产物，与固定在dna芯片上的探针进行杂交、信号显色盒判读来进行地贫的诊断。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提高α-地中海贫血的检测效率，提供一种检测α-地中海贫血的基因芯片及其使用方法、试剂盒。本发明的基因芯片及其试剂盒具有操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，需要时间短，成本低等优点。
为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一种检测α-地中海贫血的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为seqidno.1~195所示的核苷酸序列。
所述固相载体选自载玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚苯乙烯。
第二方面，本发明还涉及前述检测α-地中海贫血的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：
(1)制备样品dna片段：
取患者血液、采用常规方法抽提全基因组dna（gdna）；解冻后进行点离，加入到无核酸酶的pcr管中，补充无核酸酶的去离子水；加入酶切反应液，在pcr仪上运行如下反应程序：37℃孵育2小时，65℃孵育20分钟。反应后将反应管立即转移至冰上，取酶切产物在0.8%琼脂糖胶进行电泳，用sybrgold染色检测酶切是否完全。
(2)荧光标记上述dna片段：
随机引物加入到反应管中，在pcr仪上运行如下反应程序：95℃变性3分钟；配制标记混合母液，加入到反应管中，在pcr仪上运行如下反应程序：37℃孵育2小时，65℃孵育10分钟；对照样品gdna用cy3-dutp标记，患者样品gdna用cy5-dutp标记。
(3)纯化上述gdna标记产物：
将gdna标记产物离心后加入1×te（ph8.0），加入到标记好的纯化柱（agilentp/n5190-3391），放置于收集管中，离心，弃滤液；多次离心后收集纯化样品，并通过补充1×te（ph8.0）或浓缩机浓缩样品，用nanodrop2000uv-vis检测产量和比活。
(4)将gdna标记产物与所述基因芯片杂交：
加入无核酸酶的去离子水于10×acghblockingagent冻干粉的小瓶中，使用或保存前，置于室温60分钟，并涡旋振荡混匀；制备杂交混合母液，加入到反应管中，在pcr仪上运行如下反应程序：98℃孵育3分钟，37℃孵育30分钟，保持样品于37℃，在杂交室内进行杂交。将杂交样品混合液缓慢地以画圈的方式加到垫片垫圈内区域，将组装好的杂交室固定在旋转器上，放入67℃杂交炉中以20rpm的转速转动，杂交24小时。
(5)洗涤杂交的基因芯片，扫描芯片杂交信号：
用washbuffer1(agilentoligoacghwashbuffer1,agilentp/n5188-5221)洗涤杂交的基因芯片，并扫描芯片杂交信号，获得结果。
第三方面，本发明还涉及一种用于检测α-地中海贫血的试剂盒，该试剂盒包括前面所述“寡核苷酸探针为seqidno.1~195所示的核苷酸序列”的基因芯片。所述试剂盒还包括酶切试剂、标记物、标记产物纯化柱、杂交液和洗涤液，其中所述标记物为荧光素cy3-dutp或cy5-dutp。
本发明的有益效果是：
1、本发明的基因芯片操作步骤简单、检测特异性高，具有很好的临床意义；在控制较低成本的基础上提高其检测特异性，该芯片经多次试验后重复性高、稳定性好；检测所需的时间短，从样本抽提到获得扫描结果在两天内可完成，在很大程度上提高了检测效率，这是目前很多基因芯片所不及的。
2、本发明的基因芯片及其试剂盒适用于孕妇产前诊断及婴幼儿基因诊断，可以快速检测出α-地中海贫血患者缺失或重复突变，是阻止染色体变异重症婴儿出生的重要技术手段；本发明改进了大多数基因芯片成本高昂、操作精细复杂、速度慢、有漏诊等不足，集多种优点于一身，可大大提高α-地中海贫血的检测效率。
3、广西壮族自治区人群中α-地中海贫血基因携带率为全国最高，该技术的研发及应用将大大推进广西基因疾病的预防工作，在一定程度上可以推动广西地方经济的发展和技术的进步，在广西及全国范围内推广都有着深远的临床医学意义。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册见newyorkcoldspringharborlaboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
本实施例的基因芯片由固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为seqidno.1~195所示的核苷酸序列，所述固相载体为玻片。本实施例基因芯片的固相载体也可选用硝酸纤维素膜、硅片、尼龙膜或聚苯乙烯。本实施例的寡核苷酸探针由安捷伦公司生产，同时本实施例的基因芯片也由安捷伦公司按照常规方法生产。
本实施例基因芯片的使用方法，步骤如下：
（1）样品dna片段的制备
取患者血液、采用常规方法抽提全基因组dna（gdna）。
解冻10×restrictionenzymebuffer和bsa(见下表)，轻弹管底后点离。
对每个反应来说，将患者样本和同性别的对照样本gdna分别加入到适当的无核酸酶的pcr管中，并用无核酸酶的去离子水补充体积至10.1μl。
按照下表在冰上准备酶切混合母液：
将2.9μl酶切反应液加入到gdna反应管中，使体积达到13μl，并用移液枪上下轻轻吹打混匀。在pcr仪上运行如下反应程序：37℃孵育2小时，65℃孵育20分钟；
反应后将反应管立即转移至冰上，取2μl酶切产物在0.8%琼脂糖胶进行电泳，用sybrgold染色检测酶切是否完全，大部分酶切产物长度介于200bp-500bp。
（2）dna的荧光标记
将2.5μl随机引物加入到每个反应管中，使体积达到13.5μl，并用移液枪上下轻轻吹打混匀。在pcr仪上运行如下反应程序：95℃变性3分钟，反应后将反应管立即转移至冰上5分钟；
按照下表准备标记混合母液：
将11.5μl标记反应液加入到每个反应管中，使体积达到25μl，并用移液枪上下轻轻吹打混匀。在pcr仪上运行如下反应程序：37℃孵育2小时，65℃孵育10分钟，反应后将反应管立即转移至冰上。对照样品gdna用cy3-dutp标记，患者样品gdna用cy5-dutp标记。
（3）纯化gdna标记产物
将gdna标记产物6000g离心1分钟，向每个反应管中加入430μl的1×te（ph8.0）。将标记好的纯化柱（agilentp/n5190-3391）放置于2ml收集管中，并将gdna标记产物加入纯化柱中，关盖后，室温下14000g离心10分钟，弃滤液。再向每个纯化柱中加入480μl的1×te（ph8.0），关盖后，室温下14000g离心10分钟，弃滤液。
将纯化柱倒置于一个新的2ml收集管中，室温1000g下离心1分钟收集纯化样品。通过补充1×te（ph8.0）或浓缩机浓缩使得样品终体积达到9.5μl。每个样品管取1.5μl纯化产物，利用nanodrop2000uv-vis检测产量和比活。将8μlcy5标记的患者gdna纯化标记产物及8μlcy3标记的对照gdna纯化标记产物混合于无核酸酶的pcr管，体积达到16μl。
（4）样品的预处理
加入1350μl无核酸酶的去离子水于10×acghblockingagent冻干粉的小瓶中。使用或保存前，置于室温60分钟，并涡旋振荡混匀。
按照下表准备杂交混合母液：
将29μl杂交反应液加入到每个反应管中，使体积达到45μl，并用移液枪上下轻轻吹打混匀并点离。在pcr仪上运行如下反应程序：98℃孵育3分钟（精确时间），37℃孵育30分钟，保持样品于37℃，准备杂交。
（5）芯片杂交
在杂交室（agilentp/ng2534）底部放置一张干净的垫片，垫片标志朝上，并与杂交室底部的长方形区域对齐。将40μl杂交样品混合液缓慢地以画圈的方式加到垫片垫圈内区域。将芯片活性面（印有“agilent”标志的一面）朝下放在垫片上，确保两者相互对齐。将杂交室盖子盖在“垫片-杂交样品-芯片”三明治结构上，滑动夹具使之固定，并手动加固杂交室的夹具。垂直旋转组装好的杂交室以润湿芯片，观察气泡是否可以自由流动。如果发现静止的气泡，可以将杂交室放在桌面上通过轻轻敲打芯片或垫片使之移动。将组装好的杂交室固定在旋转器上，放入67℃杂交炉中以20rpm的转速转动，杂交24小时。
（6）芯片洗涤和扫描
室温下将washbuffer1(agilentoligoacghwashbuffer1,agilentp/n5188-5221)倒满整个染色缸1#。在染色缸2#中放入一个芯片架及一个磁力搅拌子，在室温下将足够多的washbuffer1装入染色缸2#使之足以覆盖芯片架，并将染色缸2#放在磁力搅拌器上。将染色缸3#中装入3/4体积的washbuffer2(agilentoligoacghwashbuffer1,agilentp/n5188-5222)及一个磁力搅拌子，并在37摄氏度循环水浴锅中过夜预热，将预热后的染色缸3#放在带有加热元件的磁力搅拌器上，打开加热元件，保持washbuffer2的温度于37℃，并用温度计监控温度。
从杂交炉中取出一个杂交室，并记录杂交过程中是否形成气泡以及所有气泡是否可以旋转自由。拆卸杂交室，将杂交室置于水平面上，逆时针旋转螺钉，放松杂交室夹具并移除。将三明治结构迅速转移至染色缸1#中，并保持芯片条形码面朝上。从条形码的一端撬开三明治结构。将干净镊子伸入两张玻片之间，温柔旋转镊子，轻轻分开两张玻片，让垫片落入染色缸1#的底部。将芯片迅速移至染色缸2#(washbuffer1)的芯片架上。同时避免让芯片暴露于空气中。开启磁力搅拌器搅拌，以350rpm的转速搅拌5分钟，调整转速以达到良好而不过分的搅拌。
将芯片架转移至装有washbuffer2并预热到37℃的染色缸3#中，开启磁力搅拌器搅拌至少1分钟，但不要超过2分钟。在5-10秒内缓慢将芯片架移出液面，并尽可能减少芯片上的液滴。丢弃用过的washbuffer1和washbuffer2。立即扫描芯片以减少环境中氧化剂对于信号强度的影响。
本实施例的基因芯片操作步骤简单、检测特异性高、稳定性好，该芯片多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到获得扫描结果可在两天内完成。
案例1
随机抽取我院就诊的6个α-地中海贫血临床患者样本，利用本发明的基因芯片及目前α-地中海贫血临床常规检测方法（即多重gap-pcr）进行平行双盲实验，分析结果后将两种方法的结果进行对比，检测结果如表所示：
gap-pcr方法仅1例患者检测为阳性，其余5例患者均为阴性结果，而本发明芯片检测结果均为阳性。本发明芯片检测范围大，不但可以检测已知α-地中海贫血缺失突变，同时也可以检测α-地中海贫血非常见以及未知罕见缺失突变，并且具有快速、低成本、大通量和自动化等优点。
序列表
<110>广西壮族自治区妇幼保健院
<120>一种检测α-地中海贫血的基因芯片及其使用方法、试剂盒
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