一种甘薯种薯复合病毒病（SPVD）病原的检测方法与流程

本发明涉及农作物病虫害检测技术领域，具体而言，涉及一种甘薯种薯复合病毒病(spvd)病原的检测方法。

背景技术：

甘薯复合病毒病(sweetpotatovirusdiseases，spvd)是由甘薯褪绿矮化病毒(sweetpotatochloroticstuntvirus，spcsv)和甘薯羽状斑驳病毒(sweetpotatofeatherymottlevirus，spfmv)协生共侵染甘薯引起的病毒病害。协同侵染过程中，spcsv充当激发病毒，介导两者之间的协生作用，为spfmv在植物体内的复制和运输提供了便利，使spfmv的致病性显著增强，症状也会更加明显。协同作用会促使病毒在植物中运动和积累，影响贮藏根产量，加重病毒病症状，从而造成甘薯减产、品质受损，严重时导致绝收。

目前，spvd对甘薯的危害最为广泛，易通过烟粉虱等传播媒介迅速扩散，并且物流业的发展进一步加剧了其跨区传播速度。甘薯一旦感染复合病毒病，除了脱毒繁殖外，目前尚无其他直接有效的防治方式，因而甘薯脱毒良种繁育和对良种繁育质量的检测是防控甘薯复合病毒病通过物流迅速传播的主要措施。国内外在甘薯脱毒种薯繁殖已经取得相当多的成效，然而目前对脱毒效果检测和种薯的质量把控有待加强。由于表型鉴定、生理指标检测等方法所需时间较长，在实际生产应用上受较大限制，主流的甘薯复合病毒病快速检测方法主要以酶联免疫检测法和荧光定量pcr检测法为主，存在检测设备要求高、检测成本偏高、出现假阳性和假阴性等问题，不易为实际生产过程接受。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种甘薯种薯复合病毒病(spvd)病原的检测方法，包括：

提取甘薯种薯rna；

将rna反转录成cdna；

以cdna为模板，用设计引物进行pcr的第一轮扩增，并且用琼脂糖凝胶电泳对第一轮扩增产物进行第一轮检测，其中，所述设计引物包括外引物和内引物；

用琼脂糖凝胶电泳分离第一轮扩增产物，并且回收目的dna；以及

以回收的目的dna为模板，用所述内引物进行pcr的第二轮扩增，并且用琼脂糖凝胶电泳对第二轮扩增产物进行第二轮检测。

在上述检测方法中，所述甘薯种薯复合病毒病(spvd)病原包括甘薯褪绿矮化病毒(spcsv)和甘薯羽状斑驳病毒(spfmv)。

在上述检测方法中，用sds-licl法提取所述甘薯种薯rna。

在上述检测方法中，所述甘薯褪绿矮化病毒(spcsv)进行所述pcr的第一轮扩增的外引物为：

cs-f1：gactcagatttggaaactaacc；

cs-r1：cggacgtactctgatttgc。

在上述检测方法中，所述甘薯羽状斑驳病毒(spfmv)进行所述pcr的第一轮扩增的外引物为：

fm-f1：gcagattatgacgcacttcag；

fm-r1：cacacccctcattcctaagag。

在上述检测方法中，所述甘薯褪绿矮化病毒(spcsv)进行所述pcr的第一轮扩增和所述pcr的第二轮扩增的内引物为：

cs-f1：gactcagatttggaaactaacc；

cs-r2：gagctaactggtctgagg。

在上述检测方法中，所述甘薯羽状斑驳病毒(spfmv)进行所述pcr的第一轮扩增和所述pcr的第二轮扩增的内引物为：

fm-f2：ggttgtttggtttggacgg；

fm-r1：cacacccctcattcctaagag。

在上述检测方法中，进行所述pcr的第一轮扩增的内参引物为：

actin-f：tgagcaaggaaataacag，

actin-r：gctagaacatataaggtctc；

h2b-f：caaggttctcaaacaggtc，

h2b-r：gcttgtaaacttagtcacg；以及

ubi-f：gaggttgaatcgtcagac，

ubi-r:gactcatccaccttgtag。

在上述检测方法中，所述甘薯褪绿矮化病毒(spcsv)的目的dna的长度为338bp；以及所述甘薯羽状斑驳病毒(spfmv)的目的dna的长度为325bp。

在上述检测方法中，所述所述甘薯褪绿矮化病毒(spcsv)的目的dna和所述甘薯羽状斑驳病毒(spfmv)的目的dna均是pcr的第一轮外引物扩增产物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、方法检测周期短，从样品采集到获得检测结果全过程只需要2个工作日，与酶联免疫检测法和荧光定量pcr检测周期相当，比生理指标检测等检测方法更节约时间。

2、对仪器要求较低，在检测周期与酶联免疫法、荧光定量pcr检测法相当的情况下，不需要酶标仪、荧光定量pcr等特殊仪器。

3、检测准确性高，本技术以pcr检测技术为基础，比酶联免疫法灵敏度高2个以上数量级，可有效避免抗体质量造成的假阳性和假阴性，酶联免疫法依赖抗体质量，不同批次抗体质量不同，检测效果就存在较大差异；同时利用半巢氏pcr进行两轮检测，可有效避免荧光定量pcr检测法中假阳性和假阴性的出现。

4、相对成本低，酶联免疫法检测需要特制的抗体，抗体制作成本目前都比较高；在操作流程与荧光定量pcr类似的情况下，其试剂耗材成本只有荧光定量pcr检测法的1/5左右。

5、容易推广与掌握，对检测员专业技能要求较低，不需要掌握专业的分析软件，根据琼脂糖电泳即可获得直观明了的结果。

附图说明

图1是甘薯种薯spcsv的第一轮外引物扩增产物的第一轮检测结果图(m表示d2000dnamark，1-16分别表示16个甘薯样品)；

图2是甘薯种薯spfmv的第一轮外引物扩增产物的第一轮检测结果图(m表示d2000dnamark，1-16分别表示16个甘薯样品)；

图3是甘薯种薯spcsv的第一轮内引物扩增产物的第一轮检测结果图(m表示d2000dnamark，1-11分别表示11个甘薯样品)；

图4是甘薯种薯spfmv的第一轮内引物扩增产物的第一轮检测结果图(m表示d2000dnamark，1-11分别表示11个甘薯样品)；

图5是内参引物检测结果图(m表示d2000dnamark，1-2分别表示内参ibh2b基因目的条带，3-4分别表示内参β-actin基因目的条带，5-9分别表示内参ibubi基因目的条带)；

图6是甘薯种薯spcsv的第二轮内引物扩增产物的第二轮检测结果图；

图7是甘薯种薯spfmv的第二轮内引物扩增产物的第二轮检测结果图；

图8是spcsv的pcr第一轮扩增产物检测结果分析(2s85表示内引物扩增序列，1s85表示外引物扩增序列，fj8077表示spcsv西非菌株序列(nationalcenterforbiotechnologyinformation网站的登录号为fj807785.1)，consensus表示共有序列)；

图9是spfmv的pcr第一轮扩增产物检测结果分析(2spfmv表示内引物扩增序列，1spfmv表示外引物扩增序列，hq844111表示spfmv西非菌株序列(nationalcenterforbiotechnologyinformation网站的登录号为hq844111.1)，consensus表示共有序列)。

具体实施方式

本发明提供了一种甘薯种薯复合病毒病(spvd)病原的检测方法，在该方法中，用改良的sds-licl法提取甘薯种薯rna，由于甘薯种薯含有丰富的淀粉、多酚类物质，不利于rna的提取和后期检测，同时rna的纯度和完整性是保证检测准确性的前提，因此，本发明采用改良的sds-licl法，极大限度的降低了多糖、多酚类物质的干扰，也充分保证了rna的完整性。

此外，将rna反转录成cdna；以cdna为模板，用设计引物(包括外引物和内引物)进行半巢氏pcr的第一轮扩增，并且用琼脂糖凝胶电泳对第一轮扩增产物进行第一轮检测；用琼脂糖凝胶电泳分离第一轮扩增产物，并且回收目的dna；以及以回收的目的dna为模板，用所述内引物进行半巢氏pcr的第二轮扩增，并且用琼脂糖凝胶电泳对第二轮扩增产物进行第二轮检测；在该方法中，用琼脂糖凝胶电泳对第一轮扩增产物进行第一轮检测，同时通过第一轮检测结果筛选出目的大小的dna(即，目的大小的pcr的第一轮扩增的外引物产物，产物长度为338bp)，再用目的大小的dna为模板，利用内引物进行第二轮扩增，并且进行第二轮检测。根据第一轮和第二轮检测结果对样品进行综合分析，保证了检测结果的准确性，有效降低了样品检测的假阴性率和假阳性率。

下列实施例用于举例说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

步骤1：用sds-licl法提取薯块rna

1)取待检测的完整甘薯种薯，切取0.5g，用刀片切碎后液氮研磨成粉末，装入-10～0℃预冷的2ml离心管,样品数量较大时直接分别将样品切碎，放入2ml圆底离心管，加少量液氮后用小棒槌捣碎。

注意：刀片、研钵、离心管等材料保证用前rna酶高温失活处理，或用rna酶抑制剂depc(焦碳酸二乙酯)水浸泡处理后，高压灭菌锅灭菌干燥再使用，一次提取过程中不重复使用。

2)分别在离心管加0.5ml的提取液(提取液成分：0.1m氯化锂,100mmtris-hcl(三(羟甲基)氨基甲烷)ph＝8.0,10mmedta(乙二胺四乙酸),1％sds(十二烷基硫酸钠))和0.5ml的水饱和苯酚，充分振荡混匀30s；

3)加入0.5ml的氯仿/异戊醇(v/v＝25:1)，充分振荡混匀，4℃12000rpm离心5min。

4)取上清液至另一离心管，加等体积4mlicl(氯化锂)，4℃沉淀3h，4℃12000rpm离心10min。

5)去上清液，加入250mldepc处理水，加25ml的3mnaoac(醋酸钠)(ph5.2)，加入625ml的-10～0℃预冷的无水乙醇溶液。

6)4℃12000rpm离心10min，去上清，用70％的乙醇溶液重悬浮，4℃13000rpm离心5min。

7)用移液器尽量吸去上清液，完全晾干后加入100μldepc处理水，获得的溶液即为样品中提取的rna。

步骤2：将rna反转录成cdna

1)rna模板变性

在rnasefree离心管(上海宝曼生物科技有限公司)中配制如下混合液：

将pcr管(上海明匠生物科技有限公司)在65℃条件下加热5min，后迅速转移到冰块上静置2min。

2)配制第一链cdna合成反应液，用移液器轻轻吹打混匀，该合成反应液如下：

3)按下列条件进行第一链cdna合成反应

步骤3：以cdna为模板，用设计引物进行半巢氏pcr的第一轮扩增，并且用琼脂糖凝胶电泳对第一轮扩增产物进行第一轮检测，具体步骤如下：

以3ngcdna为模板，利用外引物(cs-f1：gactcagatttggaaactaacc；cs-r1：cggacgtactctgatttgc)和内引物(cs-f1：gactcagatttggaaactaacc；cs-r2:gagctaactggtctgagg)进行spcsv的pcr的第一轮扩增，spcsv的第一轮内、外引物扩增产物的目的条带的长度分别为338bp、108bp；

利用外引物(fm-f1：gcagattatgacgcacttcag；fm-r1：cacacccctcattcctaagag)和内引物(fm-f2：ggttgtttggtttggacgg；fm-r1：cacacccctcattcctaagag)进行spfmv的pcr的第一轮扩增，spfmv的第一轮内、外引物扩增产物的目的条带的长度分别为325bp、102bp；

内参引物为(actin-f：tgagcaaggaaataacag；actin-r：gctagaacatataaggtctc)；(h2b-f：caaggttctcaaacaggtc；h2b-r:gcttgtaaacttagtcacg)和(ubi-f：gaggttgaatcgtcagac；ubi-r:gactcatccaccttgtag)，内参引物扩增产物的目的条带的长度分别为279bp、244bp、244bp。

反应体系为：

扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，36个循环；

之后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行第一轮检测。

步骤4：用琼脂糖凝胶电泳分离第一轮扩增产物，并且回收目的dna

利用添加有goldview染色剂的1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳分别对步骤3获得的pcr第一轮内、外引物扩增产物进行分离，琼脂糖凝胶电泳使pcr第一轮扩增产物充分分离后，在凝胶成像系统或紫外灯下拍照获取电泳结果，用琼脂糖胶回收试剂盒回收pcr第一轮外引物扩增产物的目的条带，即，将目的大小的dna片段进行琼脂糖凝胶电泳回收。

步骤5：以回收的目的dna为模板，用所述内引物进行半巢氏pcr的第二轮扩增，并且用琼脂糖凝胶电泳对第二轮扩增产物进行第二轮检测

以回收的pcr第一轮扩增外引物产物(即目的dna)为模板，利用内引物(cs-f1：gactcagatttggaaactaacc；cs-r2:gagctaactggtctgagg)进行spcsv的pcr第二轮内引物扩增；spcsv的第二轮内引物扩增产物的长度为108bp；

利用内引物(fm-f2：ggttgtttggtttggacgg；fm-r1：cacacccctcattcctaagag)进行spfmv的pcr第二轮内引物扩增；spfmv的第二轮内引物扩增产物的长度为102bp。

反应体系为：

扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，38个循环；

之后，用2％的琼脂糖凝胶电泳进行第二轮检测。

检测结果：

spcsv的pcr的外引物扩增的目的条带的长度为338bp，pcr的内引物扩增的目的条带的长度为108bp；

spfmv的pcr的外引物扩增的目的条带的长度为325bp，pcr的内引物扩增的目的条带的长度为102bp。

在内参引物正常工作的情况下：

1)如果样品在第一轮中，该样品的pcr的第一轮内、外引物扩增产物都能获得目的条带，并且在第二轮检测中，该样品的第二轮内引物扩增产物也能获得目的条带，则该样品为感染对应病毒的阳性样品；

2)如果样品在第一轮检测中，该样品的pcr的第一轮外引物扩增产物能获得目的条带，第一轮内引物扩增产物无目的条带，而在第二轮检测中，第二轮内引物扩增产物能获得目的条带，则该样品为假阴性样品，即，感染相应病毒的阳性样品；

3)如果样品在第一轮中，该样品的pcr的第一轮外引物扩增产物能获得目的条带，第一轮内引物扩增产物无目的条带，而在第二轮检测中，第二轮内引物扩增产物未能获得目的条带，则该样品为假阳性样品；即，未感染相应病毒的阴性样品；

4)如果样品在第一轮检测中，该样品的pcr的第一轮内、外引物扩增产物都未获得目的条带，则该样品为未感染相应病毒的阴性样品。

在本发明中，采用第一轮检测和第二轮检测相结合的方式实现甘薯种薯复合病毒病(spvd)病原的快速准确的检测，整个检测过程仅需要2个工作日，这与酶联免疫检测和荧光定量pcr检测时间相当，有效缩短了检测时间、降低了检测成本、提高了检测的准确性，避免了出现假阳性和假阴性等问题，因此，本发明提供的方法适宜甘薯种薯抽样检测等实际生产过程。

为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是很明显的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。

序列表

<110>湖南省作物研究所

<120>一种甘薯种薯复合病毒病（spvd）病原的检测方法

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<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>未知()

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