水稻抗褐飞虱基因BPH9基因内特异SNP共显性分子标记引物及应用的制作方法

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻飞虱基因bph9基因内特异snp共显性分子标记引物与应用，本发明提供的分子标记引物适于在水稻育种中对bph9基因型的大量筛选以及从水稻种质资源中筛选新的bph9基因型抗性亲本。
背景技术：
：随着生物技术的发展，人类进入后基因组时代，全面开展功能基因组研究已成为生命科学研究的前沿领域。目前，水稻基因组精细遗传图谱和物理图谱已经完成，进一步对水稻功能基因进行研究，对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。水稻是我国重要的粮食作物，褐飞虱是我国稻区最为严重的虫害之一，严重影响稻谷的产量和质量。利用抗虫基因培育抗虫水稻品种是控制水稻褐飞虱最为经济有效的方式。由于水稻抗褐飞虱抗性鉴定复杂，利用常规手段选育抗虫品种往往需要较大的投入、以及难以有效的导入和聚合不同的抗虫基因。因此，利用分子标记辅助选择、聚合具有不同抗谱的抗虫基因，培育广谱、持久抗虫品种是解决水稻褐飞虱虫害的最佳途径。水稻抗褐飞虱基因bph9位于水稻12号染色体，其供体亲本来源pokkali，是一个对褐飞虱多个生物型具有广谱抗性的品种，因此通过开发bph9特异性分子标记，利用分子标记辅助选择将bph9抗性等位基因导入栽培稻品种，对培育具有褐飞虱抗性的水稻品种具有重要意义。目前分子标记辅助选择育种中，对bph9基因的选择主要利用与之连锁的标记，如rm28483、ind28450、ind28453、ind284323、ind2、ind14、rm28466、rm28481、rm2848等，而基因标记还未见报道，这在一定程度上影响了bph9在水稻抗褐飞虱育种中选择的效率和准确性。两对交叉引物pcr(pcrwithconfrontingtwo-pairprimers，pcr-ctpp)是一种操作简便、分型快速、费用低廉的snp分型方法，该方法通过一次pcr反应和常规电泳技术即可区分3种不同基因型，其基本原理为：引物3’存在错配时，延伸效率会降低，扩增受阻。基于此原理，以snp位点分别为正反引物的3’设计两条特异性引物，并分别在snp位点的上下游设计两条外引物，根据两对引物的扩增片段大小和数量鉴定snp的类型。本发明在pcr-ctpp方法基础上加以改进，bph9基因的第一个外显子的第725和726碱基处存在两个连续的snp位点，其中bph9抗性基因为5’-ca-3’，其余等位基因为5’-tg-3’，以该两个snp位点分别为正反两条特异性内引物3’的第一和第二位碱基进行引物设计，并在3’端第3位碱基引入错配，增加引物的特异性开发一套利用pcr电泳便可区分bph9基因3种不同基因型的特异性分子标记，通过设计4条引物对待测样品基因组dna进行pcr扩增，根据扩增带型判断bph9基因型。具有纯合抗性bph9等位基因的材料扩增出230bp特异性条带；具有其他纯合bph9等位基因的材料扩增出316bp特异性条带；杂合等位基因扩增出230bp、316bp条带，3种基因型均可扩增出503bp的非特异性条带。因此，利用一次pcr扩增就可将3种不同基因型材料区分，该方法简单可控、成本低廉，适于田间大量材料的基因型鉴定，提高育种效率。技术实现要素：为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供了水稻抗褐飞虱基因bph9基因内特异snp共显性分子标记引物，分别为：bph9-if:accattgttaggcagttgttca；bph9-ef:aatgtcgcacccagcagc。bph9-er:attcgactccctttcttgttatct；bph9-ir:cagcctcctgaagagatctttca，引物特异性好，扩增效率高，可用于水稻抗褐飞虱基因bph9的基因型鉴定。本发明的另一个目的是提供了水稻抗褐飞虱基因bph9特异snp共显性分子标记引物的应用方法，利用该引物可以有效地对抗褐飞虱基因bph9进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻抗褐飞虱基因bph9的分子标记辅助育种。为达到上述目的，本发明的技术方案为：水稻抗褐飞虱基因bph9基因内特异snp共显性分子标记，其引物序列分别为：bph9-if:accattgttaggcagttgttca；bph9-er:attcgactccctttcttgttatct；bph9-ir:cagcctcctgaagagatctttca；bph9-ef:aatgtcgcacccagcagc；引物设计原理如下(图1)：首先在bhp9第一外显子725与726位目标snp位点ca/tg处以bph9特异序列5’-ca-3为引物的3’端设计特异性扩增bph9抗性等位的正向内引物if,并在3’第3位碱基处引入t/t错配增加引物的特异性，再设计一条与if配对的反向外引物er，由于if的3’端与bph9其他等位基因对应的序列5’-tg-3’无法配对结合，因此只能特异性扩增bph9抗性等位基因材料，获得230bp的片段；同理，按照上述思路，以与5’-tg-3’互补配对的5’-ca-3’作为反向内引物的3’端，同样在3’第3位碱基处引入t/t错配增加引物的特异性，再设计与ir配对的正向外引物ef，同理该对引物只能扩增bph9其他等位基因材料，产生316bp带型；两对引物等量混合扩增便可实现对水稻bph9基因型的鉴定，并且两种基因型均有一条503bp的条带。此外，该标记为共显性标记，杂合基因型将扩增出230bp、316bp和503bp的3种带型。4条引物的名称、序列、tm值及扩增产物长度具体见表1。水稻抗褐飞虱基因bph9特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：1)水稻dna的提取2)合成表1所示引物序列3)pcr扩增pcr体系以10ul记为：1ul10×pcr反应缓冲液，0.8ul10mmdntp，4条引物均为0.15ul10um引物，0.1ultaqdna聚合酶；2uldna模板，双蒸水补足余量。pcr反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。4)结果判定根据扩增条带类型判断基因型，含有纯合抗性bph9等位基因类型的水稻品种扩增出230bp和503bp条带，其他纯合等位型扩增出316bp和503bp条带，杂合型品种扩增出230bp、316bp和503bp条带。表1：引物名称序列5'-3'tm值(℃)扩增产物产物长度(bp)bph9-ifaccattgttaggcagttgttca58bph9-ircagcctcctgaagagatctttca58int6r/ext6f(tg)型316bpbph9-erattcgactccctttcttgttatct60int6f/ext6r(ca)型230bpbph9-efaatgtcgcacccagcagc60ext6f/ext6r(共有带型)503bpbph9基因位于水稻12号染色体，包含3个外显子编码1206个氨基酸，通过对bph9不同等位基因间的测序及数据库序列比对(序列来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，发现bph9不同等位基因间存在较多多态性变异，选取其中第一个外显子第725bp和726bp处特异编码序列进行引物设计，其中bph9抗性等位基因为ca,其他等位基因为tg，因此，通过设计特异性引物对该目标位点特异性扩增即可实现对bph9等位基因的鉴定。相对于现有技术，本发明的有益效果为：1.本发明在bph9基因第1外显子第725bp和726bp处获得2个bph9等位特异性snp位点，bph9为ca，其余等位基因为tg；2.本发明基于pcr-ctpp方法的原理，利用目标基因外显子内snp位点开发出仅利用pcr电泳技术即可鉴定亲本及f2子代的bph9基因型；3.本发明有效解决了传统抗虫育种中存在的抗虫鉴定易受虫量及环境影响，表型鉴定费时、成本高、难度大等问题，通过检测抗褐飞虱基因bph9，可在苗期对目标材料进行取样，利用本发明的分子标记进行基因型鉴定，即可快速筛选出抗虫单株，淘汰其他植株，节约了成本，控制育种群体规模，极大提高抗褐飞虱个体的选择效率；4.本发明提供的分子标记可广泛应用于分子辅助育种中bph9基因的分子标记检测，实现该抗性基因的产业化分子育种。附图说明图1是利用两对交叉引物pcr扩增(pcr-ctpp)方法对水稻bph9基因内特异snp位点扩增示意图图2是利用本发明设计的引物对3种bph9基因型dna模板扩增的电泳图，m：dl1000dnamarker，其中泳道1为snp位点为纯合ca型，bph9的供体材料pokkali；泳道2为snp位点为纯合tg型，为感虫材料9311；泳道3为杂合型，由pokkali与9311杂交获得的f1材料。图3是利用本发明设计的引物检测生产上常用的籼粳水稻亲本的电泳图，m：dl1000dnamarker，其中泳道1为bph9供体材料pokkali，泳道2为bph9基因导入系珞扬9号，泳道3-37依次为：9311、华占、r1212、r1206、丰玉占、6116-765、r1128、玉针香、华润2号、co2、r900、mf63、绵恢3728、华恢272、华恢19、华恢284、638s、日本晴、农垦31、沪粳6、沪粳5、越粳0618、02428、热粳35、浙粳75、徽粳602、镇稻819、江苏粳2、龙5、盐稻531、fukuniski、一上s01、杨粳5507、辽盐287、龙稻9号(糯)。图4是利用本发明设计的引物检测目标位点分离的f2群体电泳图，m：dl1000dnamarker，泳道1-16为利用pokkali与9311杂交获得的f2群体中随机选取的单株，各材料所属基因型标注于各泳道下方，r代表含bph9抗虫纯合等位基因型，s代表不含bph9抗虫基因的纯合等位型，h代表杂合型。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本研究所用的taq酶及dntp产自天根生化科技有限公司，其余均为市售常规生化试剂。1.实施例1利用本发明设计的引物对3种bph9基因型dna模板进行扩增1)生物材料ca型材料为含有bph9基因的亲本pokkali；tg型材料为含有感虫等位基因的亲本材料9311；杂合型材料为pokkali与9311杂交获得的f1代材料。2)水稻dna提取及引物合成以ctab法提取上述材料dna，合成表1所示的引物序列，具体为：bph9-intf:accattgttaggcagttgttcabph9-extr:attcgactccctttcttgttatctbph9-intr:cagcctcctgaagagatctttcabph9-extf:aatgtcgcacccagcagc3)pcrpcr体系以10ul记为：1ul10×pcr反应缓冲液，0.8ul10mmdntp，4条引物均为0.15ul10um引物，0.1ultaqdna聚合酶；2uldna模板，双蒸水补足余量。pcr反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。4)结果分析1泳道为纯合ca型bph9材料pokkali，利用本发明标记可特异性扩增出230bp条带及503bp非特异性条带；2泳道为纯合tg型感虫材料9311，利用本发明标记可特异性扩增出316bp条带及非特异性503bp条带；3泳道为杂合型f1材料，利用本发明标记可扩增出230bp、316bp和503bp三种带型(图2)。该结果表明本发明的标记对不同的基因型扩增带型清晰、效果较好。2.实施例2利用本发明检测生产上常用的水稻籼粳骨干亲本材料。1)生物材料ca型亲本对照为bph9供体材料pokkali及9311背景bph9基因导入系珞扬9号；tg型亲本对照9311。骨干亲本材料：华占、r1212、r1206、丰玉占、6116-765、r1128、玉针香、华润2号、co2、r900、mf63、綿恢3728、华恢272、华恢19、华恢284、638s、日本晴、农垦31、沪粳6、沪粳5、越粳0618、02428、热粳35、浙粳75、徽粳602、镇稻819、江苏粳2、龙5、盐稻531、fukuniski、一上s01、杨粳5507、辽盐287、龙稻9号(糯)等34个，以ctab法提取上述材料dna。2)pcr参见实施例13)结果分析如图3所示，泳道1、2为bph9供体材料pokkali及bph9导入系珞扬9号均扩增出230bp的bph9等位基因特异性带型，泳道3为感虫亲本9311扩增出316bp带型，其余泳道均扩增出与感虫对照9311一致的316bp特异性带型；为验证标记检测准确性，对34个亲本材料检测的目标snp位点进行测序比对，结果表明，分子标记检测结果与测序结果一致。泳道4-38依次为：华占、r1212、r1206、丰玉占、6116-765、r1128、玉针香、华润2号、co2、r900、mf63、绵恢3728、华恢272、华恢19、华恢284、638s、日本晴、农垦31、沪粳6、沪粳5、越粳0618、02428、热粳35、浙粳75、徽粳602、镇稻819、江苏粳2、龙5、盐稻531、fukuniski、一上s01、杨粳5507、辽盐287、龙稻9号(糯)。3.实施例3利用本发明对水稻抗褐飞虱基因bph9f2群体的单基因分离的检测1)生物材料以ca型bph9供体材料pokkali与tg型感虫材料9311杂交构建f2分离群体。2)dna提取及pcr参见实施例13)结果分析对96个f2分离群体的单株进行基因型检测，3种不同基因型的分离比为27rr:46h:23s，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔分离比(χ2＝0.50<χ20.05＝5.99)，因此，该检测位点表现为单基因分离(见图4)。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。当前第1页12