本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种四肽亮肤肽的液相合成方法。
背景技术：
色斑是指和周围颜色不同的斑点。色斑是由于皮肤黑色素的增加而形成的一种常见面部呈褐色或黑色素沉着性、损容性的皮肤疾病，多发于面颊和前额部位。脸部色斑的形成原因很多，种类比较复杂，主要有遗传性因素、紫外线照射、内分泌原因、生活习惯等因素刺激使自由基的活性增强。色斑的形成主要是因为各种因素导致黑色素细胞功能加强，吞噬黑色素的“us细胞”遭到破坏，功能弱化，黑色素的代谢速度越来越赶不上合成速度，异常黑色素被肌肤基底层的细胞吸收，当反复受到外界刺激时，黑色素逐渐显现于表皮，从而形成脸部色斑。
目前市场上的许多祛斑产品都是通过抑制酪氨酸酶的活性试图达到祛斑的目的，而一旦酪氨酸酶活性受到抑制，打破了人体的有机平衡系统，就无法保证肌肤不受紫外线等外界因素的损伤。因而，只有从黑色素源头截击——中和自由基的氧化，抑制黑色素的异常产生，并加速将沉积黑色素代谢出体外，才能根本解决色斑问题。
亮肤肽(pkek)是一种新型的无刺激的具有明显的抗uv损伤和美白作用的氨基酸寡肽产品，尤其在亚洲和非洲人群有非常好的效果。pkek是一种安全的，无刺激的，能够适用于不同年龄段的多种色斑问题治疗的四肽。实验证明，pkek能显著降低uvb刺激表达白细胞介素处理人角质形成细胞的形成，能治疗显著抑制uvb诱导基因编码的表达上调，减少在uvb诱导皮肤色素沉着的能力，可作为化妆品中的调肤剂。
pkek的合成方法目前主要为传统的固相多肽合成法，此法所用原材料成本昂贵，纯化成本高昂，不易规模化生产。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效率、低成本的液相合成亮肤肽的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：采用液相合成法分别合成pro-lys的全保护片段boc-pro-lys(boc)-oh以及glu-lys的全保护片段h-glu(tbu)-lys(boc)-oh，再将这两个全保护片段进行缩合，得到全保护四肽boc-pro-lys(boc)-glu(tbu)-lys(boc)-oh，然后对全保护四肽进行脱保护，得到亮肤肽；
上述boc-pro-lys(boc)-oh的合成方法为：以四氢呋喃为溶剂，将boc-pro-oh与n,n′-二环己基碳酰亚胺、n-羟基丁二酰亚胺在0～10℃下反应3～5小时，过滤，向滤液中加入h-lys(boc)-oh和碳酸氢钠水溶液，在0～10℃下继续反应0.5～2小时，然后升温至室温反应8～16小时，反应完后过滤，滤液减压脱除溶剂后倒入水中，用柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，真空干燥，得到boc-pro-lys(boc)-oh，其中boc-pro-oh、n,n′-二环己基碳酰亚胺、n-羟基丁二酰亚胺、h-lys(boc)-oh、碳酸氢钠的摩尔比优选为1:(1.5～2.0):(1.2～1.5):(1.2～1.5):(2.0～4.0)。
上述h-glu(tbu)-lys(boc)-oh的合成方法为：以四氢呋喃为溶剂，将fmoc-glu(tbu)-oh与1-羟基苯并三氮唑、有机碱、n,n′-二环己基碳酰亚胺在-10～-5℃下反应2～4小时，过滤，向滤液中加入h-lys(boc)-oh和有机碱，在15～25℃下反应10～18小时，减压脱除溶剂后倒入水中，用柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，真空干燥，得到fmoc-glu(tbu)-lys(boc)-oh，然后用哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液脱除fmoc-glu(tbu)-lys(boc)-oh中的fmoc保护基，分离纯化即得h-glu(tbu)-lys(boc)-oh，其中fmoc-glu(tbu)-oh与n,n′-二环己基碳酰亚胺、1-羟基苯并三氮唑、有机碱、h-lys(boc)-oh的摩尔比优选为1:(1.0～1.25):(1.05～1.3):(2.0～4.0):(1.1～1.4)。
上述boc-pro-lys(boc)-oh和h-glu(tbu)-lys(boc)-oh缩合的方法为：以二氯甲烷为溶剂，将boc-pro-lys(boc)-oh与有机碱、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑在-20～-10℃下反应20～30分钟，然后加入h-glu(tbu)-lys(boc)-oh的n,n-二甲基甲酰胺溶液，继续反应1～2小时后升温至室温反应8～14小时，分离纯化，得到全保护四肽boc-pro-lys(boc)-glu(tbu)-lys(boc)-oh，其中所述boc-pro-lys(boc)-oh与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑、有机碱、h-glu(tbu)-lys(boc)-oh的摩尔比优选为1:(1.0～1.1):(1.0～1.15):(2.0～4.0):(0.8～0.95)。
上述的有机碱为n-甲基吗啡啉、二异丙基二乙胺、n-甲基吡咯烷酮中任意一种。上述合成方法中，采用三氟乙酸对全保护四肽boc-pro-lys(boc)-glu(tbu)-lys(boc)-oh进行脱保护。
本发明先分别合成pro-lys和glu-lys的全保护片段，再将这两个全保护片段进行缩合，得到全保护的四肽，然后对其进行脱保护即得到亮肤肽。本发明采用液相合成法，所用原料便宜易得，中间体纯度高、不需柱层析纯化，使用水作为反应后处理溶剂，综合成本低廉，对环境友好，适合规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、合成boc-pro-lys(boc)-oh
向1000ml三口瓶中加入21.5g(0.1mol)boc-pro-oh和300ml四氢呋喃，搅拌至固体溶解，在0～5℃条件下，加入13.7g(0.12mol)n-羟基丁二酰亚胺、30.9g(0.15mol)n,n′-二环己基碳酰亚胺，反应4小时，过滤，向滤液中加入30g(0.12mol)h-lys(boc)-oh、20g(0.238mol)碳酸氢钠以及200ml水，在5～10℃下反应1小时后自然升温至室温反应12小时，停止反应，过滤，滤液减压脱除溶剂后倒入300ml水中，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，40℃真空干燥，得白色固体boc-pro-lys(boc)-oh39.8g，收率89.8％。
2、合成h-glu(tbu)-lys(boc)-oh向1000ml三口瓶中加入42.5g(0.1mol)fmoc-glu(tbu)-oh和300ml四氢呋喃，搅拌溶解后降温至-10℃，加入16.2g(0.12mol)1-羟基苯并三氮唑和30g(0.208mol)二异丙基乙二胺，搅拌10分钟后加入22.4g(0.108mol)n,n′-二环己基碳酰亚胺，在-10～-5℃温度范围内反应3小时，过滤，向滤液中加入30g(0.12mol)h-lys(boc)-oh和20g(0.138mol)二异丙基乙二胺，在15～25℃温度范围内反应12小时，停止反应，减压脱除溶剂后倒入300ml水中，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗2次，40℃真空干燥，得白色固体fmoc-glu(tbu)-lys(boc)-oh52g，收率81.3％。
将上述白色固体fmoc-glu(tbu)-lys(boc)-oh加入到20ml哌啶和80mln,n-二甲基甲酰胺的混合液中，在15～25℃温度范围内反应1小时后将体系倒入300ml水中，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，40℃真空干燥，将干燥后的固体加入到200ml甲基叔丁基醚中，搅拌3小时，过滤，滤饼用50ml甲基叔丁基醚洗涤，40℃真空干燥，得到白色固体h-glu(tbu)-lys(boc)-oh31.5g。
3、合成h-pro-lys-glu-lys-oh
向1000ml三口瓶中加入30g(0.067mol)boc-pro-lys(boc)-oh、27g(0.187mol)二异丙基乙二胺和500ml二氯甲烷，搅拌溶解后降温至-15℃，加入9.2g(0.068mol)1-羟基苯并三氮唑和13g(0.068mol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，在-15～-10℃温度范围内反应30分钟，然后将80ml含24g(0.0556mol)h-glu(tbu)-lys(boc)-oh的n,n-二甲基甲酰胺溶液滴入反应液中，在-15～-10℃温度范围内反应2小时后自然升温至室温反应12小时，停止反应，减压脱除溶剂后倒入500ml水中，用质量分数为10％的柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，40℃真空干燥，所得白色固体加入到200ml乙酸乙酯中搅拌2小时使其分散均匀，离心，固体用50ml乙酸乙酯洗涤，40℃真空干燥，得到白色固体boc-pro-lys(boc)-glu(tbu)-lys(boc)-oh41.2g，收率73.7％。
将41.2gboc-pro-lys(boc)-glu(tbu)-lys(boc)-oh加入到200ml体积分数为20％的三氟乙酸的四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应2小时，停止反应，减压脱除溶剂后倒入300ml水中，离子交换除三氟乙酸(体积分数为2％的乙酸水溶液恒流，检测波长215nm，流速6ml/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料deae)，最后冷冻，得到白色固体h-pro-lys-glu-lys-oh21g，即亮肤肽，其纯度大于90％。
实施例2
1、合成boc-pro-lys(boc)-oh
向1000ml三口瓶中加入21.5g(0.1mol)boc-pro-oh和400ml四氢呋喃，搅拌至固体溶解，在0～5℃条件下，加入16.0g(0.14mol)n-羟基丁二酰亚胺、37.1g(0.18mol)n,n′-二环己基碳酰亚胺，反应5小时，过滤，向滤液中加入35g(0.14mol)h-lys(boc)-oh、29.4g(0.35mol)碳酸氢钠以及230ml水，在5～10℃下反应2小时后自然升温至室温反应10小时，停止反应，过滤，滤液减压脱除溶剂后倒入400ml水中，用饱和柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，45℃真空干燥，得白色固体boc-pro-lys(boc)-oh39g，收率88.0％。
2、合成h-glu(tbu)-lys(boc)-oh
向1000ml三口瓶中加入42.5g(0.1mol)fmoc-glu(tbu)-oh和350ml四氢呋喃，搅拌溶解后降温至-5℃，加入14.85g(0.11mol)1-羟基苯并三氮唑和30g(0.208mol)二异丙基乙二胺，搅拌10分钟后加入24.90g(0.12mol)n,n′-二环己基碳酰亚胺，在-10℃下反应2小时，过滤，向滤液中加入35g(0.14mol)h-lys(boc)-oh和21.7g(0.15mol)二异丙基乙二胺，在15～25℃温度范围内反应11小时，停止反应，减压脱除溶剂后倒入400ml水中，用饱和柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗2次，35℃真空干燥，得白色固体fmoc-glu(tbu)-lys(boc)-oh53.2g，收率83.17％。
将上述白色固体fmoc-glu(tbu)-lys(boc)-oh加入到20ml哌啶和80mln,n-二甲基甲酰胺的混合液中，在15～25℃温度范围内反应2小时后将体系倒入350ml水中，用饱和柠檬酸水溶液调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，35℃真空干燥，将干燥后的固体加入到300ml甲基叔丁基醚中，搅拌5小时，过滤，滤饼用100ml甲基叔丁基醚洗涤，35℃真空干燥，得到白色固体h-glu(tbu)-lys(boc)-oh30.4g。
3、合成h-pro-lys-glu-lys-oh
向1000ml三口瓶中加入30g(0.067mol)boc-pro-lys(boc)-oh、21.65g(0.15mol)二异丙基乙二胺和400ml二氯甲烷，搅拌溶解后降温至-10℃，加入9.74g(0.072mol)1-羟基苯并三氮唑和13.57g(0.071mol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，在-10℃下反应20分钟，然后将60ml含24.6g(0.057mol)h-glu(tbu)-lys(boc)-oh的n,n-二甲基甲酰胺溶液滴入反应液中，在-10℃下反应1小时后自然升温至室温反应10小时，停止反应，减压脱除溶剂后倒入600ml水中，用柠檬酸调节溶液ph值至析出大量白色固体，过滤，水洗，45℃真空干燥，所得白色固体加入到240ml乙酸乙酯中搅拌5小时使其分散均匀，离心，固体用100ml乙酸乙酯洗涤，45℃真空干燥，得到白色固体boc-pro-lys(boc)-glu(tbu)-lys(boc)-oh40.5g，收率72.5％。
将40.5gboc-pro-lys(boc)-glu(tbu)-lys(boc)-oh加入到180ml体积分数为20％的三氟乙酸的四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应3小时，停止反应，减压脱除溶剂后倒入350ml水中，离子交换除三氟乙酸(体积分数为2％的乙酸水溶液恒流，检测波长215nm，流速6ml/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料deae)，最后冷冻干燥，得到白色固体h-pro-lys-glu-lys-oh19.8g，即亮肤肽，其纯度大于90％。