本发明涉及EGFR-TRIM24共表达在诊断和治疗神经胶质瘤中的应用。
背景技术：
神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，主要包含4种病理类型：星形细胞 瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤和混合性胶质瘤。根据美国脑肿瘤注册中心统计， 恶性胶质瘤约占原发性恶性脑瘤的70％。在恶性胶质瘤中，间变性星形细胞瘤(AA， WHO III级)和多形性胶质母细胞瘤(GBM，WHO IV级)最常见，其中GBM约 占所有胶质瘤的50％。目前，神经胶质瘤的诊断主要依靠CT及MRI。一些新的 MRI，如DTI、DWI、PWI、MRS、fMRI有助于提高诊断水平和判断预后。PET、 SPECT有助于鉴别肿瘤复发与放射性坏死。但是最终，仍然需通过肿瘤切除术或 活检术来明确神经胶质瘤的病理学诊断。也就是说：形态观察始终是对神经胶质 瘤进行病理诊断和分级的基础。神经胶质瘤分级的基本原则为以下7项：瘤细胞 密度；瘤细胞的多形性或非典型性，包括低分化和未分化成分；瘤细胞核的高度 异形性或非典型性，出现多核和巨核；高度的核分裂活性；血管内皮细胞增生(出 现肾小球样血管增生)；坏死(假栅状坏死)和Ki-67增殖指数升高。
为配合胶质瘤患者的治疗、疗效观察及判断预后，《2012版中国中枢神经系 统胶质瘤诊断、治疗指南》要求我国各级医院依据实际情况，因地制宜对胶质瘤 进行选择性的分子生物学标记。LGG检测IDH1基因突变和染色体1p/19q杂合性 缺失对临床预后判断具有重要意义。具有向星形胶质细胞分化特征的胶质瘤及 60％-70％少突胶质细胞瘤对GFAP呈阳性表达。少突胶质细胞特异性核转录因子 (Olig2)对鉴别少突胶质细胞瘤及星形细胞来源的胶质瘤具有一定的参考价值。 Ki-67增殖指数与肿瘤的分化程度、浸润或转移及预后有密切关联，是判断肿瘤 预后的重要参考指标之一。神经元特异核蛋白(NeuN)对判断肿瘤中的神经元 成份具有重要意义，主要用于胶质神经元肿瘤及神经细胞瘤的诊断及鉴别诊断。 此外，根据信号转导通路相关的分子生物学标记，又能将髓母细胞瘤分成若干种 分子亚型，如Wnt型、Shh型和非Wnt/Shh型。这种分类对于临床制定更优化的 治疗方案及准确判断预后有重要意义，但还有待于大样本量临床病理的进一步验 证。
目前，神经胶质瘤的治疗以手术切除为主，并结合放疗和化疗等。替莫唑胺 (TMZ)同步放疗联合辅助化疗已成为新诊断GBM的标准治疗方案。如何预知 恶性胶质瘤对化疗药物的反应性，降低化疗抗性是化疗的治疗焦点。内源性O6- 甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)甲基化水平及染色体1p/19q杂合性缺失 可分别用于预测GBM和少突胶质细胞瘤的化疗反应及预后。不同类型的神经胶 质瘤对放射治疗的敏感性亦有所不同，一般认为分化差的肿瘤较分化好的为高。 以髓母细胞瘤对放疗最为敏感，其次为室管膜母细胞瘤，多形性胶质母细胞瘤仅 中度敏感，星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、松果体细胞瘤等更差些。对髓母细胞 瘤及室管膜瘤，因易随脑脊液播散，应包括全椎管照射。
因此，唯有肿瘤分子病理学和遗传学方面的不断进展才能为神经胶质瘤的诊 断提供更详尽的信息，为临床肿瘤的分级和治疗方式的选择做出指导作用，并对 患者的预后做出更为精准的评估。但在我国，特别是一些中小医院由于缺乏熟练 的神经病理医师，手术后病理诊断不够精确，部分地区还没有采用WHO分类， 使患者手术后的后续治疗缺乏可靠的病理学依据。这对患者的综合治疗和疗效的 提高是非常不利的，同时也使其临床疗效评估更加困难。而在另一方面，高度异 质性的神经胶质瘤势必需要大量新的神经胶质瘤分子标记的不断发掘，才能对神 经胶质瘤的治疗实现个体化综合策略、优化和规范治疗方案，以期达到最大治疗 效益，尽可能地延长患者无进展生存期，提高生存质量。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的神经胶质瘤的分子标记，用于诊 断和治疗神经胶质瘤。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
一种神经胶质瘤的恶性程度诊断试剂盒，其特征在于，包含用于检测TRIM24 基因和/或蛋白、或EGFR基因和/或蛋白以及TRIM24基因和/或蛋白、TRIM24基 因和/或蛋白以及EGFRVIII基因和/或蛋白的表达水平的试剂。
本发明还提供了一种神经胶质瘤患者的生存期预测试剂盒，其特征在于，包 括用于检测TRIM24基因和/或蛋白、或EGFR基因和/或蛋白以及TRIM24基因和 /或蛋白、TRIM24基因和/或蛋白以及EGFRVIII基因和/或蛋白的表达水平的试剂。
本发明还提供了用于检测TRIM24基因和/或蛋白、或EGFR基因和/或蛋白以 及TRIM24基因和/或蛋白、TRIM24基因和/或蛋白以及EGFRVIII基因和/或蛋白 的表达水平的试剂在制备神经胶质瘤的恶性程度的诊断试剂中的应用。
本发明还提供了用于检测TRIM24基因和/或蛋白、或EGFR基因和/或蛋白以 及TRIM24基因和/或蛋白、TRIM24基因和/或蛋白以及EGFRVIII基因和/或蛋白 的表达水平的试剂在制备神经胶质瘤患者的生存期预测试剂中的应用。
优选的所述的EGFR蛋白为p-EGFRY1172。
本发明还提供了能够抑制TRIM24基因和/或蛋白、或TRIM24基因和/或蛋白 以及EGFR基因和/或蛋白、或TRIM24基因和/或蛋白以及EGFRVIII基因和/或蛋 白的表达的试剂在制备神经胶质瘤的治疗药物中的应用。
优选地，所述的EGFR蛋白为p-EGFRY1172。
本发明还提供了一种神经胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，包含用于检测 TRIM24基因和/或蛋白、或EGFR基因和/或蛋白以及TRIM24基因和/或蛋白、 TRIM24基因和/或蛋白以及EGFRVIII基因和/或蛋白的表达水平的试剂。
优选的所述的EGFR蛋白为p-EGFRY1172。
本发明的原理如下：人类肿瘤的一个重要特点是扩增或者高表达致癌基因从 而异常活化致癌信号通路。在人神经胶质瘤中，表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)频繁扩增并且经常与其组成型激活突变体(ΔEGFR， 又名EGFRVIII或de2-7EGFR)共表达。这种活化的致癌EGFR信号通路参与肿瘤 的发生、发展及其对治疗的抗性。一般而言，EGFR主要通过激活Akt通路诱发 肿瘤，继而刺激肿瘤细胞增殖、存活并耐药。在人的神经胶质瘤，Akt通路的活 化大多源于EGFR扩增和突变、PI3KCA突变或PTEN缺失。在前列腺癌和乳腺癌， Akt蛋白可以分别通过胰岛素样生长因子-肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)或HER2-Skp2轴所诱导的泛 素化修饰被激活。除了异常激活的EGFR-Akt信号轴和其它在神经胶质瘤中被确 定的致癌途径，很有可能还有其它更加关键的基因通过参与或者在平行于上述公 认的致癌信号传导通路中发挥作用而促进肿瘤发生。
TRIM24三基序蛋白家族成员24(TRIM24)也称为转录中介因子1α(TIF1a)。 TRIM24具有TRIM家族特征的氨基末端RBCC结构域(Ring，B‐Box和Coiled‐Coil)， 以及定义TIF1亚家族的PHD–bromo结构域。TRIM24已被证明可以作为致癌基 因或肿瘤抑制因子。虽然小鼠TRIM24的基因缺失促进肝细胞癌(HCC)，但是人 类TRIM24的异常过度表达与多种癌症(包括胃癌，膀胱癌，非小细胞肺癌，头 颈癌和乳腺癌)患者的癌症进展和患者生存率呈正相关。果蝇和人乳腺癌中， TRIM24作为泛素E3连接酶靶向p53。TRIM24在乳腺癌和前列腺癌中分别被鉴 定雌激素受体和雄激素受体等转录因子的转录辅因子，激活与肿瘤进展相关的下 游信号传导。然而，TRIM24在癌症中的功能仍然很大程度上是未知的。通过多 数据库分析我们发现，TRIM24在胶质瘤中是高表达的，并且随着级别增高表达 明显增加。通过对EGFR/EGFRVIII刺激的不同类型癌细胞进行蛋白质组学研究， 已经证实了TRIM24基因和蛋白表达水平都会显著上调，这表明TRIM24可能在 EGFR刺激的癌细胞行为中发挥作用。
本发明使用Oncomine数据分析和免疫组织化学法检测神经胶质瘤标本，发 现TRIM24基因在临床胶质瘤肿瘤标本中的蛋白组学表达水平升高，在胶质瘤衍 生癌细胞株中，EGF刺激细胞增殖和存活必需由TRIM24介导，TRIM24传递EGFR 信号参与相关癌基因表达调控，TRIM24是EGFR驱动肿瘤形成的关键因素。本发 明在国内外率先发现在胶质瘤中EGFR导致TRIM24基因和蛋白表达水平明显增 加。本发明所发现的这一新颖的TRIM24信号通路成为EGFR致癌信号通路的关 键中转站。本发明研究表明同时高表达活化型的EGFR(p-EGFRY1172)与TRIM24 的神经胶质瘤，WHO病理分级级别越高(恶性程度越高)、患者生存期显著缩短。
本发明还提供了以TRIM24和p-EGFRY1172为指标的免疫组织化学肿瘤检测试 剂盒，可以半定量地衡量二个指标在患者神经胶质瘤标本中的表达水平，从而对 肿瘤恶性程度做出更精确地判断，并对肿瘤患者生存期做出更加精准的预测。此 新型神经胶质瘤诊断试剂盒可供病理学工作者快速、准确地掌握TRIM24与 p-EGFRY1172二大指标的免疫组织化学染色操作方法，从而准确检测二种蛋白的表 达水平，对肿瘤恶性程度做出更精确地判断，并对肿瘤患者生存期做出更加精准 的预测。本发明的癌症筛查方法可容易地与其它方法结合，以提供更为可靠的诊 断或预测指标，由此提供多标记检查。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了新的神经胶质瘤分子标记TRIM24，针对该分子标记，本发明 还设计了分子标记试剂盒，可以用于判别神经胶质瘤的恶性程度以及对肿瘤患者 的生存期进行预测，未来还有望开发出特异性针对TRIM24信号通路的新型神经 胶质瘤治疗药物，并通过检测结果将病人进行更加细致的分型，从而更加有针对 性和有效的用药，治愈或者提高病人生存期，改善胶质瘤患者生存质量。
附图说明
图1a用oncomine分析来自TCGA数据库的正常大脑和GBM的TRIM24 mRNA表 达水平。TCGA数据库的数据表明，与正常脑组织相比，胶质母细胞患者中TRIM24 基因表达水平明显升高。
图1b为来自GSE4290数据集的正常脑，星形胶质细胞II‐III级和GBM中TRIM24 mRNA的表达水平的分析。通过使用配对双向t检验(a和b)和单向方差分析 与Newman‐Keuls事后检验计算P值。结果展示，级别越高的胶质瘤患者TRIM24 表达越高。TRIM24可能与胶质瘤病变、恶化有酶切关系。
图2 qRT-PCR分析EGFRvIII对LN229和U87GBM细胞TRIM24 mRNA表达的影响。
通过慢病毒稳定过表达外源性EGFRvlII，qRT-PCR分析TRIM24表达发现，过表达 EGFRvlII能够明显促进胶质瘤细胞TRIM24 mRNA表达。
图3a免疫蛋白印迹，表明我们成功在U87MG和LN229胶质瘤细胞中过表达外 源性的EGFRvlII，EGFRvIII能够增加TRIM24蛋白表达，同时我们用两个不用的 shRNA成功敲低U87/EGFRvIII细胞TRIM24蛋白表达。TRIM24敲低不会影响胶质 瘤细胞EGFR的表达和活化，也不会影响肌动蛋白(β-actin)表达，但可以显著 降低TRIM24的表达，说明我们的载体无脱靶效应，而且ShTRIM24有效。
图3b细胞增殖实验证实EGFRvIII能够显著增加胶质瘤U87和LN229细胞增殖， 而敲除TRIM24能够明显抑制EGFRvIII引起的U87和LN229细胞增殖。
图3c软琼脂克隆形成实验表明，EGFRvIII能够显著诱导胶质瘤U87和LN229细胞 增殖克隆形成，而敲除TRIM24能够明显抑制EGFRvIII引起的克隆形成能力，提 示TRIM24对EGFRvIII驱动的胶质瘤生长是重要的。
图3d TransweII小室迁移实验证实，EGFRvIII能够显著诱导胶质瘤U87和LN229细 胞增殖局部转移，而敲除TRIM24能够明显减弱EGFRvIII引起的细胞转移。
图3e裸鼠脑内异源移植瘤实验进一步表明，FGFRvIII能够显著增加胶质瘤U87 细胞体内生长，而敲除TRIM24能够抑制EGFRvIII引起的胶质瘤肿瘤生长。
图3f统计表明，EGFRvIII增加胶质瘤U87和LN229细胞体内生长和敲除TRIM24 抑制EGFRvIII引起的胶质瘤肿瘤生长均具有统计学意义。
图4a我们采用mRNA-seq技术分析TRIM24如何介导EGFRvIII调控胶质瘤发生发 展。过表达EGFRvIII和敲低TRIM24，mRNA-seq分析EGFRvIII上调和TRIM24下调 的基因，我们发现TRIM24调节35个基因表达可能介导了EGFRvIII的作用。
图4b通过功能注释(GO)分析发现由EGFRvIII上调并被TRIM24敲低下调的基 因与细胞增殖途径相关。
图4c我们分析了上述基因在胶质瘤患者中的表达情况。患者基因表达数据 (GSE4290)的分层聚类分析表明，与正常组织相比，22个基因胶质母细胞患者 中出现明显高表达，表明EGFR-TRIM24高表达与胶质瘤存在显著正相关性。
图5a免疫组织化学染色分析临床神经胶质瘤患者的肿瘤标本，p-EGFRY1172染色 强阳性(白色线圈所示)的组织TRIM24染色也为强阳性(白色线圈所示)，而 p-EGFRY1172染色阴性(黑色线框所示)的组织TRIM24染色也为阴性(黑色线框 所示)。提示p-EGFRY1172在人胶质瘤中也能促进TRIM24表达。
图5b免疫组织化学染色同时高表达p-EGFRY1172和TRIM24的临床胶质瘤患者的 生存期显著缩短。
图6为Q‐PCR反应条件图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之 后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本 申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：TRIM24基因在临床胶质瘤肿瘤标本中的基因组学表达水平升高
(1)生物信息学分析1：
打开oncomine数据库(https：//www.oncomine.org/)，在搜索栏中输入TRIM24 检索，在Disease Summary for TRIM24表格里面选择brain and CNS cancer，在左 侧primary filters里面选择cancer VS.Normal Analysis后，在右侧结果里面挑选含 有Glioblastoma vs.Normal的数据库查看结果。
结果如图1a显示：来自TCGA数据分析表明TRIM24mRNA在10例正常脑 组织的平均表达值为(log2)2.403，而在542例胶母细胞瘤患者中的平均表达值 是3.678(log2)，是正常脑组织的2.503倍，TRIM24在胶母细胞瘤患者中的表达 水平明显高于正常脑组织，并且具有统计学差异(p＝1.17E-8)。
(2)生物信息学分析2：
通过GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载数据集 GSE4290(Expression data of glioma samples from Henry Ford Hospital)，分析各个病 人的TRIM24的表达信息(信息不完整的病理样品不予采用)，并以WHO病理分 级分组，通过graphpad软件进行作图，结果如图1b所示随着病理分级增加(2 到4)，TRIM24表达明显增加。
实施例2：外源性EGFRvlII显著增加胶质瘤U87，LN229细胞TRIM24基因表达水 平
通过慢病毒将EGFRvIII感染至胶质瘤U87和LN229细胞中，然后提取RNA， 通过qRT-PCR检测TRIM24表达。
2.1293T细胞包装慢病毒颗粒：
将293T细胞(购自ATCC，ATCC编号为CRL-3216TM)培养于DMEM培养基： 含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM 培养液(Gibco，10564011)，于37℃，5％CO2无菌培养箱(thermo)培养。
第一天，取接种到10cm培养皿对数生长末期的293T细胞(细胞数约为5 ×106)，吸掉培养基。用2mL DPBS(Invitrogen，14190250)轻轻洗涤细胞以去 除残留培养基，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散293T细胞)，重复3次。加入1ml 0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养 基终止消化，用吸管或者1000ml替补头重复吹打细胞使细胞分散均匀，用血小 板计数板计数293T，然后吸取合适体积细胞悬液铺到六孔板(Corning，3516)， 细胞数约为5×105，让其生长24h，转染前的细胞汇合度应该在80％。
第二天，按照fugen-6试剂盒的说明书操作。将EGFRvlII病毒质粒(病毒载 体，Addgene，Plasmid 20737)、psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、 pMT24G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染293T细胞。单个孔分别需 要病毒质粒1ug、psPAX20.75ug、pMT24G 0.25ug，即4∶3∶1。
第三天，转染后24h，更换成每孔3ml新鲜DMEM培养基，开始富集病毒。
第四天，转染48h后，收集培养基即病毒上清。用5mL注射器吸取收集的 病毒上清，经由0.45μm过滤器(Millipore公司，SLHV013SL)过滤后，分装于 1.5ml离心管，即为48h病毒悬液，在4℃保存3-7天或者-80℃长期保持以备后 用。
将转染病毒的293T细胞继续更换为3ml新鲜DMEM培养基，再过24h，即 为转染后72h，收集病毒上清液，按照与转染48h相同的操作步骤，得到72h 病毒悬液，-80℃保存备用。
2.2慢病毒感染LN229/EGFRvIII和U87/EGFRvIII细胞实验方法：
1)慢病毒感染前18-24h，将LN229和U87细胞(LN229，U87细胞购自ATCC， ATCC编号分别为CRL-2611TM和HTB-14TM)以1×105/孔铺到24孔板中，加入新 鲜DMEM培养基进行培养，使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。新 鲜DMEM培养基成分为含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco， 15140-122)的DMEM培养液(Gibco，10564011)。
2)第二天，用含有6μg/ml polybrene(Sigma，H9628)的2ml新鲜DMEM 培养基替换原培养基，加入100微升转染48h或者72h病毒悬液。37℃孵育。
3)24小时后，用新鲜DMEM培养基替换含有病毒颗粒的培养基。
4)继续培养。由于该慢病毒含有GFP荧光蛋白，一般转染48h后可见明显 荧光表达，72h后更加明显。该慢病毒含有嘌呤霉素抗性基因，转染3天后开始 加嘌呤霉素(Sigma，P8833，终浓度为400-800ng/ml)，细胞长满即可传代。 期间每3天更换一次含有相同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基，连续筛选2星期，得 到LN229/EGFRvIII，U87/EGFRvIII细胞。
2.3qRT-PCR检测TRIM24基因表达
将需要提取RNA的细胞接种到六孔板(corning)，等细胞长满孔壁以后，按 照Trizol试剂盒的操作步骤提取mRNA，再按照Takara公司的反转录试剂盒 (RR037A)说明书，将mRNA反转录为CDNA。采用Applied Biosciences 7900HT实 时PCR系统进行实时定量PCR来检测TRIM24基因表达水平，ACTB为内参。实 用Applied Biosystems SDS软件2.2.2计算阈值循环数。
引物序列分别为(上海生工生物工程有限公司合成鉴定)：
TRIM24序列1Forward Sequence：5’-TGTGAAGGACACTACTGAGGTT-3’(SEQ ID NO：1)
序列2Reverse Sequence：5’-GCTCTGATACACGTCTTGCAG-3(SEQ ID NO：2)
ACTB序列3Forward Sequence：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’(SEQ ID NO：3)
序列4Reverse Sequence：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’(SEQ ID NO：4)
Q-PCR反应体系：引物终浓度为0.2μM，反应总体积为50μl
Q‐PCR反应条件如图6所示。
实验重复3次。结果如图2所示，EGFRvIII显著增加胶质瘤细胞TRIM24基 因表达，增加倍数约为3倍。
实施例3：在胶质瘤衍生癌细胞株中，EGF刺激其细胞增殖 和存活需要TRIM24介导
(1)使用fugen-6试剂盒(购自Roche，04709705001)按照说明书的实验步 骤将两个TRIM24的shRNA病毒质粒(shT24-1病毒质粒，吉凯基因，22927，shT24-2 病毒质粒，吉凯基因，22930)和shRNA对照病毒质粒(shC病毒质粒，吉凯基 因，CONO77)分别与psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、pMT24G(外 壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)形成的病毒感染到实施例2所得的LN229/EGFRv III和U87/EGFRvIII细胞中(LN229，U87细胞购自ATCC，ATCC编号分别 为CRL-2611TM和HTB-14TM)。
3.1293T细胞包装慢病毒颗粒：
293T细胞(购自ATCC，ATCC编号为CRL-3216TM)培养于DMEM培养基： 含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122)和DMEM 培养液(Gibco，10564011)，于37℃，5％CO2无菌培养箱(thermo)培养。
第一天，取接种到10cm培养皿对数生长末期的293T细胞(细胞数约为 5×106)，吸掉培养基。用2ml DPBS(Invitrogen，14190250)轻轻洗涤细胞以去 除残留培养基，轻轻吸掉DPBS(注意不要吹散293T细胞)，重复3次。加入1ml 0.25％胰酶(Gibco，25200-072)37℃消化2分钟后，用10ml新鲜DMEM培养 基终止消化，用吸管或者1000ml替补头重复吹打细胞使细胞分散且均匀，用血 小板计数板计数293T，然后吸取合适体积细胞悬液铺到六孔板(Corning，3516)， 细胞数约为5×105，让其生长24h，转染前的细胞汇合度应该在80％。
第二天，按照fugen-6试剂盒的说明书操作。将TRIM24的shRNA病毒质粒、 psPAX2(包装质粒，Addgene，Plasmid 12260)、pMT24G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染293T细胞。单个孔分别需要病毒质粒1ug、psPAX20.75ug、 pMT24G 0.25ug，即4∶3∶1。同样方法将shRNA对照病毒质粒、psPAX2(包装质粒， Addgene，Plasmid 12260)、pMT24G(外壳质粒，Addgene，Plasmid 12259)共转染 293T细胞。
第三天，转染后的24h，更换成每孔3ml新鲜DMEM培养基，开始富集病 毒。
第四天，转染后48h，收集培养基即病毒上清。用5ml注射器吸取收集的 病毒上清，经由0.45μm滤器(Millipore公司，SLHV013SL)过滤后，分装于1.5ml 离心管，即为48h病毒悬液，在4℃保存3-7天或者-80℃长期保持以备后用。
将转染病毒的293T继续更换为3ml新鲜DMEM培养基，再过24h，即为转 染后72h，收集病毒上清液，按照转染后48h相同的操作步骤，去除病毒液中 的293T细胞，得到72h病毒悬液，保存备用。
3.2慢病毒感染LN229/EGFRvIII和U87/EGFRvIII细胞实验方法：
1)慢病毒感染前18-24h，将LN229/EGFRvIII和U87/EGFRvIII细胞以1×105/ 孔铺到24孔板中，加入新鲜DMEM培养基进行培养，使细胞在慢病毒转染时的 数量为2×105/孔左右。LN229/EGFRvIII和U87/EGFRvIII细胞的新鲜DMEM培养基 成分为含有10％胎牛血清(Sigma，12006C)、1％青链霉素(Gibco，15140-122) 的DMEM培养液(Gibco，10564011)。
2)第二天，用含有6μg/ml polybrene(Sigma，H9628)的2ml新鲜DMEM 培养基替换原培养基，加入100微升48h或者72h病毒悬液。37℃孵育。
3)24小时后，用新鲜DMEM培养基替换含有病毒颗粒的培养基。
4)继续培养。由于该慢病毒含有GFP荧光蛋白，一般转染48h后可见明显 荧光表达，72h后更加明显。该慢病毒含有嘌呤霉素抗性基因，转染3天后开始 加嘌呤霉素(Sigma，P8833，终浓度为400-800ng/ml)，细胞长满即可传代。 期间每3天更换一次含有相同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基，连续筛选2星期后， 即在显微镜下观察到90％以上GFP阳性细胞(即代表shRNA成功感染细胞)。
3.3免疫印迹法验证shRNA敲除TRIM24的效率及其对EGFR、p-EGFR，β-actin 表达的影响
1)收集蛋白样品
使用加有1x蛋白酶抑制剂(cocktail，Roche，17938100)碧云天生产的Western 及IP细胞裂解液(P0013)冰上裂解LN229，U87，LN229/EGFRvIII，U87/EGFRv III，LN229/EGFRvIII/shTRIM24和U87/EGFRvIII/shTRIM24细胞十分钟，然后4℃， 12000rmp/min，离心10分钟。收集裂解液上清至新EP管中并做好标记，蛋白 样品收集后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，按照BCA定量试剂盒操作说 明书，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0009)测定每个蛋白样品的蛋 白浓度。
2)电泳
a、SDS-PAGE凝胶配制
使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除 水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。将制备凝胶所 需要的玻璃板，夹子，硅胶垫等洗干净，然后37℃烘干。将玻璃板夹好加入去 离子水检漏，根据说明书的配制表将适量的去离子水，30％聚丙烯酰胺，分离胶 缓冲液，10％APS以及TEMED混合配制所需要浓度的分离胶，倒掉玻璃板里面 的去离子水，将分离胶小心的加入玻璃板中防止气泡产生，加入去离子水封闭 30min等待胶凝固。等分离胶凝固以后，根据说明书配制表配制浓缩胶。将适量 的去离子水，30％聚丙烯酰胺，浓缩胶缓冲液，10％APS以及TEMED混合配制 浓缩胶，倒掉分离胶上层的水，加入浓缩胶，快速而轻轻的插入梳子，得到 SDS-PAGE胶板。
b、样品处理
在收集的蛋白样品中按比例加入浓缩的5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧 云天SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X，P0015)。沸水浴加热5分钟，以充分变性 蛋白。
c、上样与电泳
等样品冷却到室温后，将制备好的SDS-PAGE胶板从夹子上取下，固定在 电泳装置上。在电泳槽内加入1X碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A)，将 梳子两边垂直均匀用力拔出。
把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，使用预染蛋白质分子量标准(P0066) 判断蛋白分子量大小。
电泳时外槽也使用碧云天生产的1xSDS-PAGE电泳液(P0014A)。
电泳时在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧 云天SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X，P0015)中含有的溴酚蓝进入下层胶时使用 高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置，低电压可以设置在80V，高电 压可以设置在120V。
电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。
3)转膜
选用碧云天生产PVDF膜(FFP36/FFP39)。
将裁剪好的PVDF膜放入适量甲醇中浸泡活化，切去浓缩胶，将浸泡好的 PVDF膜和分离胶共同放到转膜夹的三明治结构中(滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸)， 将转膜夹插入转膜槽中，加入1×Tris-甘氨酸转膜液(康为世纪，CW0044)，恒定 300毫安电流转膜约90min。
注：PVDF膜在电源正极，凝胶在电源负极，防止放反蛋白无法转移到膜上。 在转膜过程中会有非常严重的发热现象，因此把转膜槽放置在冰浴中进行转 膜。
4)封闭
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液(碧云天， P0023C)中，漂洗2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一 定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用滴管等吸尽 洗涤液，加入Western封闭液(碧云天，P0023B)，在摇床上缓慢摇动，室温封 闭1-2h。
5)一抗孵育
参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液(碧云天，P0023A) 稀释一抗。EGFR抗体(Ab-1，Oncogene Science，1∶1000)、TRIM24抗体 (#14208-1-AP，Proteintech Group，1∶1000)和β-actin(I19，Santa Cruz Biotechnology， 1∶2000)。用滴管吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，4℃在侧摆摇床上缓慢摇 动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液(碧云天，P0023C)，在侧摆摇床 上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6)二抗孵育
参考二抗-碧云天辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L(A0216)、山羊抗 兔IgG(H+L)(A0217)的说明书，按照1∶1000的比例用Western二抗稀释液(P0023D) 稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用滴管吸尽洗涤液，立即加入稀释好的 二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液 (P0023C)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液 洗涤10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗 涤次数。
7)蛋白检测
参考相关说明书，使用BeyoECL Plus(P0018)ECL试剂来检测蛋白。使用X 光片自动洗片机洗片。
结果如图3a所示，与对照慢病毒质粒shC相比，shTRIM24能够显著降低 LN229和U87细胞中TRIM24的表达水平，表明我们构建细胞系成功且有效。 ShTRIM24刺激不影响LN229和U87细胞中EGFR，β-actin的表达水平。这说明 TRIM24位于EGFR通路的下游。
(2)降低LN229和U87中的TRIM24，能够抑制EGFRvIII刺激的LN229和U87 的细胞增殖。
使用WST-1试剂盒(购自Roche，05015944001)按照说明书检测LN229和 U87、癌细胞株的体外增殖能力。结果如图3b所示EGFRvIII刺激能够显著提高 LN229和U87的细胞增殖能力。使用shT24降低LN229和U87中的TRIM24表达 后，EGFRvIII无法再刺激LN229和U87的细胞增殖。
(3)降低LN229和U87中的TRIM24，能够抑制EGFRvIII刺激产生的LN229 和U87的软琼脂克隆形成。
1)取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用含20％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1×106细胞/L。
2)用蒸馏水分别制备出1.2％和0.7％两个浓度的琼脂液(BD，214220)，高 压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
3)按1∶1比例使1.2％的琼脂液和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20％的 胎牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中，冷却凝固，可作底层琼 脂置CO2温箱中备用。
4)按1∶1比例让0.7％的琼脂液和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后， 再向管中加入0.2mL(细胞数为5×104/ml)的细胞悬液，充分混匀，注入铺有 1.2％琼脂底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温 箱中培养10天。
5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。使用Olympus SZX12立体显微镜在2-3周后对克隆数进行评分，并使用GraphPad软件分析数 据。
结果如图3c所示，外源性过表达EGFRvlII能够显著增加细胞株的细胞克隆形 成率。而在外源性过表达EGFRvlII的基础上降低TRIM24表达后，EGFRvIII无法再 增加细胞株的细胞克隆形成率。
(4)降低LN229和U87中的TRIM24，能够抑制EGFRvIII刺激引起的LN229 和U87的迁移。使用corning的transwell小室进行细胞迁移分析。将各种细胞血 清饥饿24小时，用PBS洗涤并重悬于加0.1％FBS的DMEM中。然后，将细胞置 于小室的顶部隔室中，并将底部室加入10％FBS的DMEM。使细胞在37℃下通 过8μm孔径的膜迁移10或16小时。然后，将膜固定，结晶紫染色，用倒置显 微镜10倍或者20倍物镜以中心为起点上下左右随机选8个点拍照并分析。如图 3d所示，Transwell小室迁移实验证实，EGFRvIII能够显著诱导胶质瘤U87和LN229 细胞增殖局部转移，而敲除TRIM24能够明显减弱EGFRvlII引起的细胞转移。
(5)外源性过表达EGFRvIII的U87细胞(U87/vIII)不依赖于EGF配体就可 以组成型激活EGFR，把该类细胞移植到裸鼠脑内可以诱发肿瘤。降低U87/vIII 中TRIM24表达(U87/vIII/shT24#1、U87/vIII/shT24#2)，能够抑制U87/vIII在裸鼠 脑内的成瘤能力。
5.1裸鼠脑内成瘤实验：
每组6只裸鼠经1％戊巴比妥钠麻醉，固定于脑立体定位仪上，消毒皮肤， 头顶部正中切口，暴露前囟，按小鼠脑立位图谱，于前囟后1.5mm，中线右侧 0.8mm处，Hamilton微量注射器(701-N)自脑表面垂直进针2.8mm，向单侧脑 实质缓慢注入5μl细胞(共5×105细胞，重悬于DPBS中)，注射时间5min，留针 2min，缓慢退针。所有操作均在无菌条件下进行，缝合伤口。将裸鼠放回SPF 层流架饲养，观察记录裸鼠生存期。
5.2裸鼠脑取材、OCT包埋、冰冻切片：
2-5周后，待裸鼠出现体型明显消瘦，背部高度弯曲等脑瘤征象时，使用CO2麻醉裸鼠。迅速断颈。剪开头顶部皮肤，剥离颅骨及软脑膜，暴露出整个鼠脑。 轻轻地将鼠脑移出，切除嗅球及小脑后，包埋于OCT(Sakura，14-373-65)，迅 速置于-80℃冰箱。次日，将包埋块经冰冻切片机切片，厚度为7微米。切片放 置于-80℃冰箱保存。
5.3冰冻切片HE染色：
将切片自-80℃冰箱取出，室温平衡至水滴干燥，使用碧云天生产的HE染色 试剂盒染色切片。
结果如图3e所示，U87/P/shC代表在无外源性EGFRvlII表达的亲本细胞中转 染shTRIM24的对照质粒shC。U87/vIII/shC代表在外源性EGFRvlII过表达的U87/vIII 细胞中转染shT24的对照质粒shC。U87/vIII/shT24代表在外源性EGFRvIII过表达 的U87/vIII细胞中转染shT24。U87亲本对照细胞(U87/P/shC)在裸鼠脑内形成 很小的肿瘤(图中黑框所示)，过表达EGFRvIII并转染shT24对照shC后， U87/vIII/shC能在裸鼠脑内明显诱发肿瘤(图中黑框所示)，而降低U87/vIII中的 TRIM24表达(U87/vIII/shT24#1、U87/vIII/shT24#2)后，U87/vIII/shT24几乎不能 在裸鼠脑内诱发肿瘤(图中黑框所示)。
(6)使用Graphpad prism5.0软件，通过单因素方差分析比较各个指标在 U87/vIII/shT24#1、U87/vIII/shT24#2和U87/vIII/shC与对照组U87/P/shC的统计学 差异，结果如图3f所示：U87/vII/shC组裸鼠脑内成瘤的大小比U87亲本对照细 胞(U87/P/shC)显著增大。而降低U87/vIII的TRIM24表达(U87/vIII/shT24#1、 U87/vIII/shT24#2)，U87/vIII无法在裸鼠脑内成瘤。
实施例4：TRIM24调节增殖相关通路信号表达介导EGFR驱动肿瘤形成
(1)mRNA-seq分析发现TRIM24调控一部分癌基因表达介导EGFR促胶质 瘤生长的作用。将需要分析的细胞接种到10cm培养皿中维持在补充有10％胎牛 血清的改良DMEM基础培养基，所有细胞系在37℃和5％CO2下培养。 LN229/P/shC代表在无外源性EGFRvIII表达的亲本细胞LN229中转染shT24的对 照质粒shC(病毒质粒，吉凯基因，CONO77)。LN229/vIII/shC代表在外源性EGFRvIII 过表达的LN229/vIII细胞中转染shT24的对照质粒shC(病毒质粒，吉凯基因， CONO77)。LN229/vIII/shT24代表在外源性EGFRvIII过表达的LN229/vIII细胞中转 染shT24(shT24-1病毒质粒，吉凯基因，22927，shT24-2病毒质粒，吉凯基因， 22930)，转染方法同实施例3，本实验中使用了两个shT24质粒转染以便于更好 地验证TRIM24表达降低对后续信号通路的影响。使用Qiagen RNeasy Mini试剂 盒(Valencia，CA，USA)根据制造商的说明书提取和纯化总RNA。测序前通过 生物分析仪评估RNA的质量。根据Illumina的方案制备聚(A)+RNA文库。文 库在Illumina HiSeqX十平台上进行测序。本研究中差异表达基因检测的标准是错 发现率(FDR)＜0.05，倍数变化＞1.5倍。基因表现型与Cluster 3.0集成，并使用 Java Tree View 3.0进行查看。结果如图4a所示，TRIM24调节35个基因表达，这 些基因包含了ID1，ID3，FGFR等增殖相关基因，这些基因共同介导了EGFR促胶 质瘤发生发展。
(2)基因本体(GO)注释分析TRIM24调节基因的功能。利用GO数据库 (http：//geneontology.org/)的Enrichment analysis功能在线分析EGFR-TRIM24所 调控基因的生物学功能，如图4b所示，TRIM24调控的基因与细胞周期调控，代 谢等细胞增殖信号有关。
(3)临床相关数据分析TRIM24调控基因在胶质瘤中高表达。接下来分析 了TRIM24所调控的基因是否与临床胶质瘤发生发展密切相关。通过GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载数据集GSE4290(Expression data of glioma samples from Henry Ford Hospital)，分析胶质瘤病理组织和正常脑组织中 TRIM24所调控基因表达情况，heatmap结果如图4c所示，绝大部分(22/35) TRIM24调控的基因在胶质瘤中表达明显上调，TRIM24通路相关蛋白可以将健 康志愿者和胶质瘤别人相区分。
实施例5：在临床胶质瘤标本中共表达TRIM24与p-EGFRY1172的患者生存期显著 缩短
一种用于诊断神经胶质瘤的恶性程度或预测神经胶质瘤患者的生存期的试 剂盒，包含用于检测EGFR蛋白和TRIM24蛋白的表达水平的试剂，所述的用于 检测EGFR和TRIM24的表达水平的试剂为p-EGFRY1172抗体(Rabbit polyclonal to p-EGFRY1172，Signalway Antibody)和TRIM24抗体(Rabbit polyclonal to TRIM24， proteintech group，14208-1-AP)。
(1)收集132例WHO II-IV级的临床胶质瘤标本切片行免疫组化染色：
1.1收集132例人的胶质瘤肿瘤标本(包括31例WHO II级，23例WHOIII 级，78例WHOIV级胶质瘤肿瘤)和7例没有明显病理损伤和病史的正常脑组织。 常规方法制成石蜡切片。
组织石蜡包埋和切片步骤：
1)取材：病理组织来仁济医院确认的胶质瘤患者，患者均已签署知情同意书
2)固定：将取下来的病理组织马上投入到固定液中(10％的福尔马林或者4％ 多聚甲醛)固定过夜，进行固定的目的是防治组织自身发生代谢等破坏组织本身 的结构。
3)洗涤：将充分固定的组织轻轻取出，放入包埋小盒中，然后再放入烧杯 中，用小流量的自来水冲洗一个小时，将固定液冲洗干净。
4)脱水：因为组织里面含有大量水分，水与石蜡是不想混溶的，所以要脱 去组织中的水分才能进行石蜡固定。酒精为常用的脱水剂。洗涤完成的后的组织 放入70％的酒精里面过夜脱水。将样品从70％样品中取出，依次通过80％，90％， 95％，100％的酒精进行脱水，80％，90％，95％酒精各脱水30min，100％酒 精脱水1h。样品不可以在后续浓度中过分脱水或者长久保持，后续浓度会引起 组织变硬。
5)透明：经过脱水处理，样品中的水分被酒精所取代，但是酒精跟石蜡仍 然是不相混溶，所以接下来使用既可以溶于酒精又可以溶于石蜡的二甲苯进行透 明。将脱水后的组织浸泡二甲苯，使二甲苯取代酒精进入组织称为透明。首先要 过二甲苯与酒精1∶1的溶液30分钟，然后在放入纯二甲苯中至透明，完成透明 过程。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长， 则组织硬化变脆，就不易切出完整切片。如果组织出现透明和发黑现象，说明透 明成功，如果组织出现白色，说明脱水不完全，需要重新脱水)。
6)浸蜡：透明完全的组织，则可以进行浸蜡操作，让石蜡进入组织内部， 起到支撑固定作用，利于组织切片。分别放入熔融的石蜡I、II、III处理。
7)包埋：把浸蜡完成的组织拿到包埋机处进行包埋，在预热的模具里面加 入熔融的干净石蜡，然后将预热的组织迅速转移到模具里面去，用包埋盒盖在模 具上面，并把模具放在冰上冷却15分钟后轻轻扣下蜡块即可。
8)切片：将彻底凝固的蜡块进行切片，制作切片标本。将蜡块放到石蜡切 片机(LEICA，RM2235)卡扣里面，调整刀头位置，放置蜡块，然后按切片机操 作规范切片，将完整而较平整的组织片轻轻挑入热水中，用载玻片将平展良好的 切片45°角轻轻捞起，将载玻片斜向上摇动除去多余的水，使切片牢牢贴在载 玻片上，然后37℃烘箱烘干后备用。
1.2对石蜡切片进行免疫组化染色(二步法)如下：
试剂：0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、双蒸水、梯度酒精、 二甲苯、柠檬酸抗原修复缓冲液(迈新，MVS-0100)；浓缩型DAB试剂盒(Dako， K340811)、中性树胶、p-EGFRY1172抗体(Rabbit polyclonal to p-EGFRY1172，Signalway Antibody)、TRIM24抗体(Rabbit polyclonal to TRIM24，proteintech group)，阴 性对照(不含一抗的PBS)、抗兔非生物素二步法免疫组化检测试剂(PV-6001， 中杉金桥生物技术有限公司)。
仪器：切片架；孵育盒；烤箱；移液器；小玻璃染色缸；水浴锅
具体步骤：
1)石蜡切片置于60℃烘箱中，烘片30分钟。
2)纯二甲苯脱蜡：I、II各20分钟。
3)梯度酒精脱蜡：100％酒精I、100％酒精II、95％酒精、90％酒精、80％酒 精各5分钟，双蒸水洗5分钟×2次。
4)抗原热修复：将切片放入盛有柠檬酸抗原修复缓冲液(迈新，MVS-0100) 的容器中，置微波炉内加热，使容器内液体温度保持在98℃左右，并持续15分 钟。取出容器，室温冷却30分钟(不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋 白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗5分钟×3次。
5)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴内源性过氧化物酶阻断 试剂(抗兔非生物素二步法免疫组化检测试剂1，中杉金桥生物技术有限公司 PV-6001)，放入孵育盒中，盒底部放少量双蒸水。把盒子放入37℃水浴箱中孵 育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS洗5分钟×3次。
6)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴(30～50ul)(pEGFRY1172抗体1∶100，TRIM24抗体1∶200)稀释的一抗，37℃孵育2小时，PBS洗5分 钟×3次。
7)滴加100μL酶标羊抗兔IgG聚合物(抗兔非生物素二步法免疫组化检测 试剂2，中杉金桥生物技术有限公司PV-6001)，室温孵育20分钟；PBS缓冲液 冲洗3分钟×3次。
8)用滤纸把组织周围的液体吸干，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(按 照说明书在每500μl A液中加入2.5μl B液)，显色5分钟，显微镜下掌握显色 程度，见黄褐色斑，放入双蒸水中终止显色。
9)苏木素复染3分钟，自来水冲洗30秒钟，盐酸酒精(盐酸∶酒精的体 积比为1∶100)分化5秒钟，自来水冲洗15分钟。
10)梯度酒精脱水：80％酒精、90％酒精、95％酒精、100％酒精I、100％酒精 II各5分钟。
11)二甲苯透明：I、II各10分钟。
12)中性树胶封片。
12)放入60℃烘箱中烤干，显微镜下观察，TRIM24抗体和p-EGFRY1172抗体 染色阳性的胶质瘤标本如图5a所示。
(2)使用Graphpad Prism5.0对免疫组化染色的评分和患者生存期进行 Kaplan-Meier survival分析。根据信号分子阳性细胞所占的百分比对标本计分：-， 所有肿瘤细胞都检测不到信号，0％；±，低表达或者无信号，＜1％阳性细胞；1+，～ 5-25％阳性细胞；2+，～25％阳性细胞；3+，～50％阳性细胞。-或者±染色的肿 瘤被认为是低表达肿瘤，而1+到3+的肿瘤是高表达肿瘤。结果如图5b所示，同 时高表达TRIM24、p-EGFRY1172(虚线表示)的临床胶质瘤患者的生存期显著缩短。 本发明研究表明同时高表达活化型的EGFR(p-EGFRY1172)与TRIM24的神经胶质 瘤，WHO病理分级级别越高(恶性程度越高)、患者生存期显著缩短。
<110>上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> TRIM24在胶质瘤诊断中的应用
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<212> DNA
<213>人类 (Homo sapiens)
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