以制备钩吻素子为导向的钩吻生物碱产业化制备方法与流程

本发明涉及药用植物钩吻生物碱的产业化制备技术领域，特别是涉及以制备钩吻素子为导向的从钩吻植物中制备钩吻生物碱提取物的方法。

背景技术：

钩吻（gelsemiumelegansbenth.）为马钱科胡蔓藤属常绿木质藤本植物，全株入药，具有“消肿止痛、祛风散瘀、攻毒杀虫”之功效。钩吻的主要有效成分为吲哚类生物碱，具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗银屑病、促进禽畜生长等药理作用。钩吻生物碱包括钩吻素子、甲、寅、卯等近百种单体。近年来系列研究发现，钩吻素子具有显著的镇痛、抗焦虑等功效，有良好的产业化药用前景。钩吻素子的制备依赖于从天然钩吻生物碱提取物中分离纯化获得，因此钩吻生物碱提取物的产业化制备技术是非常重要的基础步骤。

对比文件1（张兰兰.钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离[j].第一军医大学学报，2004,24(9):1006-1008.）公开了从钩吻中分离纯化钩吻素子的方法。该方法采用热醇回流提取，再用氯仿萃取获得钩吻总生物碱。此法在提取过程中使用大量的氯仿，试剂费用高、对操作人员的肝脏产生较大的毒害作用并造成环境污染，且萃取操作不适于大规模的产业化生产。

对比文件2（赵庆春,郭涛,张萍.大孔吸附树脂在分离纯化钩吻总生物碱的研究[j].中国药房，2006,17(13):969-971.）公开钩吻植物1kg的水煎液经大孔吸附树脂分离纯化获得钩吻总生物碱。水煎提取效率低，且该法获得的产物是钩吻生物碱总提物。

本发明公开以制备钩吻素子为最终目的的钩吻生物碱提取物的产业化分离制备方法。

技术实现要素：

为了克服现有产业化分离制备钩吻生物碱技术的不足，本发明目的在于提供一种从植物钩吻中以钩吻素子制备为导向的产业化分离制备钩吻生物碱提取物的方法。

本发明的目的是这样实现的，一种以制备钩吻素子为导向的钩吻生物碱产业化制备方法，包括如下步骤：

1）将钩吻药材50~70℃干燥、粉碎过20~60目筛，加入体积浓度为65%~95%乙醇加热回流提取；提取时间1~3h，收集滤液；重复提取1~3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得粗提液；

2）将步骤1）获得的粗提液加硫酸或盐酸调至ph2~5，过滤；沉淀物再加ph2~5的硫酸或盐酸水溶液溶解，过滤，操作1~2次，合并滤液；

3）将步骤2）中获得的酸水滤液加氢氧化钠或氨水调ph至8~13，并配制成浓度为0.25~1.25g生药/ml的上样液；

4）将浓度为0.25~1.25g生药/ml上样液通过预处理好的大孔吸附树脂进行吸附，上样液流速为1~4bv/h，达到吸附平衡后，分别用纯水、体积浓度为10%~90%的乙醇梯度洗脱树脂柱，洗脱流速为1~4bv/h；用碘化铋钾检测洗脱液，收集呈阳性反应的洗脱液，然后进行减压蒸干，得含较高纯度钩吻素子的钩吻生物碱提取物。

上述步骤1）加入优选体积浓度为95%乙醇加热回流提取。

上述步骤2）配制成优选浓度为1.0g生药/ml的上样液。

上述步骤2）所述的大孔吸附树脂为da201、ab-8、nka-9、hpd100、hpd400、hpd600、hpd700、hpd722、hpd750和hpd800，优选hpd700。

上述步骤2）中的上样液流速优选3bv/h，洗脱流速优选3bv/h。

上述步骤4）中达到吸附平衡后，然后分别用蒸馏水、体积浓度为10%乙醇、体积浓度为30%乙醇、体积浓度为50%乙醇和体积浓度为70%乙醇洗脱，用碘化铋钾检测洗脱液，收集呈阳性反应的洗脱液。

本法实现了对钩吻素子的富集作用，为进一步分离制备高纯度钩吻素子奠定基础，本发明为钩吻素子及其可接受的盐在制备药品、保健品和饲料等方面应用时的产业化制备奠定生产原料来源基础。

具体地说，本发明采用的技术方案是：本发明所述的从钩吻中以钩吻素子制备为导向的产业化分离制备钩吻生物碱提取物的方法，该方法包括如下步骤：

1）将钩吻药材加入提取剂乙醇，加热回流提取，回收乙醇至无醇味，得粗提液。

2）粗提液加1~5%的硫酸或盐酸调至ph2~5，过滤；沉淀物再加ph2~5的硫酸或盐酸水溶液溶解，过滤，操作1~2次，合并得酸水滤液。

3）酸水滤液加氢氧化钠或氨水碱化后，配制成一定浓度的上样液。

4）上样液通过预处理好的大孔吸附树脂进行吸附，达到吸附平衡后，用乙醇洗脱剂梯度洗脱树脂柱，用碘化铋钾检测洗脱液，收集呈阳性反应的洗脱液，然后进行减压蒸干，得钩吻生物碱提取物。

所述的步骤1）中获得粗提液的具体步骤为：将钩吻药材干燥、粉碎，加入提取剂乙醇，提取剂与钩吻药材的体积质量比为4~10ml/g，提取溶媒乙醇的体积浓度为60%~95%，加热回流1~3h；收集滤液，滤渣再加入乙醇重复提取1~3次，过滤后合并滤液，回收乙醇至无醇味。

所述步骤3）中所述上样液ph为8~13，溶液浓度为0.25~1.25mg生药/ml。

所述步骤4）中大孔吸附树脂为da201、ab-8、nka-9、hpd100、hpd400、hpd600、hpd700、hpd722、hpd750和hpd800，优选hpd700。

所述步骤4）中，上样流速为1~4bv/h，达到吸附平衡后，用10%~90%的乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为1~3bv/h，洗脱液减压蒸干，得钩吻生物碱提取物。

本发明优点是：本发明具有工艺简便、经济环保等良好特点，更适用于工业规模化生产。本发明制备的钩吻生物碱，实现了对钩吻素子的富集作用，将钩吻素子含量从粗提液的4.6%提高到26%以上，为进一步分离制备高纯度钩吻素子奠定基础。本发明为钩吻素子及其可接受的盐在制备药品、保健品和饲料等方面应用时的产业化制备奠定生产原料来源基础。

附图说明

图1是粗提液钩吻素子含量高效液相色谱图。

图2是经本发明制备的钩吻生物碱中钩吻素子含量高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明以获得钩吻素子为目标产物从钩吻中分离制备钩吻生物碱提取物的方法，其主要步骤为：

1）将钩吻药材50~70℃干燥、粉碎过20~60目筛，加入体积浓度为65%~95%乙醇加热回流提取，优选浓度为95%；提取时间1~3h，收集滤液；重复提取1~3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得粗提液。

2）将步骤1）获得的粗提液加1~5%的硫酸或盐酸调至ph2~5，过滤；沉淀物再加ph2~5的硫酸或盐酸水溶液溶解，过滤，操作1~2次，合并滤液。

3）将步骤2）中获得的酸水滤液加氢氧化钠或氨水调ph至8~12，并配制成浓度为0.25~1.25g生药/ml的上样液，优选1.0g生药/ml浓度。

4）将浓度为1.0g生药/ml上样液通过预处理好的大孔吸附树脂进行吸附，优选hpd700。上样液流速为1~4bv/h，优选3bv/h。达到吸附平衡后，分别用纯水、浓度为10%~90%的乙醇梯度洗脱树脂柱，洗脱流速为1~4bv/h，优选3bv/h。用碘化铋钾检测洗脱液，收集呈阳性反应的洗脱液，然后进行减压蒸干，得钩吻生物碱提取物。

实施例1

钩吻药材60℃干燥、粉碎过60目筛，加入体积浓度为95%乙醇加热回流提取，提取时间1~3h，收集滤液；重复提取1~3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得粗提液，粗提液钩吻素子含量高效液相色谱图见图1。获得的粗提液加0.2mol/l的硫酸调ph至2，过滤；沉淀物再加硫酸溶液（ph=2）溶解，过滤，操作1~2次，合并滤液；再加5wt%氢氧化钠调ph至12，配置成浓度为1.0g生药/ml的上样液。

室温下将3bv浓度为1.0g生药/ml的上样液以3bv/h的流速通过装有预处理好的hpd-700大孔吸附树脂的层析柱进行吸附分离，至吸附饱和，然后分别用蒸馏水、体积浓度为10%乙醇、体积浓度为30%乙醇、体积浓度为50%乙醇和体积浓度为70%乙醇洗脱。用碘化铋钾检测洗脱液，并且收集呈阳性反应的洗脱液，减压蒸干回收乙醇后冷冻干燥得钩吻生物碱（经高效液相色谱法测得含钩吻素子26.5%），钩吻生物碱中钩吻素子含量高效液相色谱图见图2。

实施例2

钩吻药材60℃干燥、粉碎过60目筛，加入体积浓度为95%乙醇加热回流提取，提取时间1~3h，收集滤液；重复提取1~3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得粗提液。获得的粗提液加0.2mol/l的硫酸调ph至2，过滤；沉淀物再加硫酸溶液（ph=2）溶解，过滤，操作1~2次，合并滤液；再加5wt%氢氧化钠调ph至12，配置成浓度为1.0g生药/ml的上样液。

室温下将3bv浓度为1.0g生药/ml的上样液以3bv/h的流速通过装有预处理好的hpd-700大孔吸附树脂的层析柱进行吸附分离，至吸附饱和，然后分别用蒸馏水、体积浓度为10%乙醇、体积浓度为30%乙醇、体积浓度为50%乙醇和体积浓度为70%乙醇洗脱。收集体积浓度为70%乙醇洗脱液，以及用碘化铋钾检测洗脱液，并且收集呈阳性反应的洗脱液，减压蒸干回收乙醇后冷冻干燥得钩吻生物碱（经高效液相色谱法测得含钩吻素子26.3%）。

实施例3

钩吻药材60℃干燥、粉碎过60目筛，加入体积浓度为95%乙醇加热回流提取，提取时间1~3h，收集滤液；重复提取1~3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇至无醇味，得粗提液。获得的粗提液加0.2mol/l的硫酸调ph至2，过滤；沉淀物再加硫酸溶液（ph=2）溶解，过滤，操作1~2次，合并滤液；再加5wt%氢氧化钠调ph至12，配置成浓度为1.0g生药/ml的上样液。

室温下将3bv浓度为1.0g生药/ml的上样液以3bv/h的流速通过装有预处理好的hpd-700大孔吸附树脂的层析柱进行吸附分离，至吸附饱和，然后分别用蒸馏水、体积浓度为10%乙醇、体积浓度为30%乙醇、体积浓度为50%乙醇和体积浓度为70%乙醇洗脱。收集体积浓度为70%乙醇洗脱液，以及用碘化铋钾检测洗脱液，并且收集呈阳性反应的洗脱液，减压蒸干回收乙醇后冷冻干燥得钩吻生物碱（经高效液相色谱法测得含钩吻素子26.4%）。

实施例1-3仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。