用于衣原体检测的引物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及一种用于检测动物衣原体的引物及相关探针，以及检测试剂盒，确切讲是一种检测动物衣原体的特异性荧光重组酶聚合酶扩增技术(rpa)检测引物、试剂盒，本发明还涉及利用本发明的引物与探针或试剂盒进行非疾病诊断的动物衣原体病的检测方法。

背景技术：

衣原体(chlamydia)是严格胞内寄生的革兰氏阴性细菌，直径0.2～0.5μm，介于立克次体和病毒之间，能够通过0.45μm滤膜，只能在宿主细胞内生长，不能像大部分细菌一样生长在琼脂平板上。衣原体病原具有广泛的致病性，近年来，衣原体病在我国流行较为严重，尤其是奶牛、牦牛、绵羊、山羊、猪等，严重阻碍了奶牛产业、牦牛产业等的进一步发展，并造成了巨大的经济损失。此外，作为一种重要的人畜共患病，该病能够引起动物和人的多种疾病，感染人可导致沙眼、肺炎、泌尿系统疾病等。因此，及时、及早的发现衣原体，并采用敏感、特异的诊断方法，在准确诊断动物流产嗜性衣原体病，提供科学防控衣原体病的诊断依据，促进养殖业健康发展，保证食品安全，保护人民身体健康方面尤为重要。

多年来，国内外对于衣原体病的诊断方法主要包括衣原体抗原的检测、衣原体抗体检测以及分子生物学检测方法。抗原检测主要包括姬姆萨染色、酶免检测(eia)以及分离培养，其中酶免检测诊断方法适用于批量检测，其缺点是特异性不佳，分离培养仍然是一个不可或缺的衣原体诊断方法，同时许多菌株是很难培养的，也存在着支原体污染的常见问题。抗体检测法主要包括间接血凝试验(iha)、补体结合试验(cft)、酶联免疫吸附试验(elisa)以及微量间接免疫荧光试验(mif)。其中，间接血凝诊断试验和补体结合试验这两种方法均具有灵敏度低、特异性差、结果判断主观性强和不适合大批量检测等特点，限制了它们在临床中的广泛应用。elisa诊断法以针对脂多糖类抗原的较多，但衣原体脂多糖类抗原某些表位与其它革兰氏阴性细菌相似，容易出现交叉反应和假阳性。例如现有技术cn201110367644.0公开了一种检测猪流产嗜性衣原体抗体的elisa试剂盒是以重组衣原体主要外膜蛋白rmomp为包被抗原，以及现有技术中以重组多型性外膜蛋白pomp为包被抗原建立的猪流产嗜性衣原体病间接elisa抗体检测方法，但是这些现有技术均是针对特定一种动物开发的elisa抗体间接检测方法或试剂盒，适用范围窄，不具有通用性，无法用于多种动物的衣原体检测诊断，使用成本较高，难以普及。微量间接免疫荧光试验曾被推荐为诊断肺炎衣原体的最可靠的血清学方法，但该诊断方法技术要求高、耗时长，因此并没有成为肺炎衣原体的常用检测项目。分子生物学检测方法主要包括核酸杂交法、pcr检测法以及环介导等温扩增技术(lamp)。

rpa技术是由以英国剑桥babraham研究院建立的并由twistdx生物技术公司发明的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以t4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有t4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsx和uvsy、单链结合蛋白gp32、dna聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddh2o和mg²⁺等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内dna复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供：一种可克服现有技术不足，用于检测动物衣原体特异性检测的引物对；一种用于动物衣原体检测的引物对序列荧光重组酶聚合酶扩增技术(rpa)检测探针序列；一种用于检测动物衣原体特异性的检测试剂盒；一种方法。一种用于动物衣原体荧光重组酶聚合酶扩增技术(rpa)检测试剂盒；以及用于动物衣原体病的检测方法和荧光重组酶聚合酶扩增技术(rpa)检测方法。

本发明的用于动物衣原体检测的引物对序列为seqidno.2和seqidno.3。

本发明的用于动物衣原体rpa检测的探针序列，其特征在于为seqidno.4。本发明用于动物衣原体检测的试剂盒内包括有序列为seqidno.2和seqidno.3的引物对。

本发明用于动物衣原体rpa检测的试剂盒内包括有序列为seqidno.2和seqidno.3的引物对，以及序列为seqidno.4的探针序列。

本发明的非疾病诊断动物衣原体检测方法是：将待检测动物样品的基因组dna为模板，用seqidno.2、seqidno.3进行扩增，并根据扩增产物电泳中是否有特定条带确定被检测动物是否有衣原体感染。

本发明的非疾病诊断动物衣原体荧光重组酶聚合酶扩增技术(rpa)检测方法是：将待检测动物样品的基因组dna为模板，用seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4进行扩增，确定被检测采用荧光定量pcr仪进行信号检测，并根据检测上曲率明显改变与否确定被检动物是否有衣原体感染。

发明的方法有极高的检测灵敏度，而且检测方法较为简单，特别是采用本发明的动物衣原体荧光重组酶聚合酶扩增技术(rpa)检测方法时，更具有简便、快速、有效的优点，对于动物衣原体的防控具有重要意义。

目前rpa技术已经在一系列病原微生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟等。但是未见rpa技术在衣原体检测中的应用。因此，本发明建立了一种简便、快速、有效的衣原体rpa检测方法，对于衣原体的防控具有重要意义。

附图说明

图1为引物的pcr验证：m为dl2000dnamarker；1～6为6对rpa扩增引物的pcr扩增结果。

图2为引物的rpa验证：m为dl2000dnamarker；1、3、6为3对引物的basickitrpa扩增结果；—：为阴性对照；+：为阳性对照。

图3为rpa荧光检测方法特异性分析：a:阴性对照；b:阳性对照；c、d:两株衣原体基因组扩增结果；e:布鲁氏杆菌基因组检测结果；f:弓形虫基因组检测结果

图4为rpa荧光检测方法灵敏度分析：a为模板浓度为10⁷copies/μl的扩增曲线；b为模板浓度为10⁶copies/μl的扩增曲线；c为模板浓度为10⁵copies/μl的扩增曲线；d为模板浓度为10⁴copies/μl的扩增曲线；e为模板浓度为10³copies/μl的扩增曲线；f为模板浓度为10²copies/μl的扩增曲线；g为模板浓度为10¹copies/μl的扩增曲线。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，本发明所使用的主要材料、试剂、食品如下：

菌株、载体与基因组：大肠杆菌感受态细胞dh5α、dnamarker和pmd18-tsimple载体均购于takarabiotech公司；衣原体、布鲁氏杆菌和弓形虫基因组dna均为本实验室保存。

主要试剂与试剂盒：甲醇、乙醇、异丙醇、以及丙三醇等购于天津化学试剂有限公司；氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等购自于北京化工厂；pcr预混酶extaq、质粒提取试剂盒、pcr纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒、pmd18-t载体连接试剂盒等均购自于takarabiotech公司。

主要仪器：移液器、pcr仪均购于德国eppendorf公司；电子天平为北京赛多斯仪器系统有限公司产品；电热恒温培养箱购于上海精密实验设备公司；dyy-6c电泳仪、水平摇床购于北京六一仪器厂；电热恒温水槽为上海精宏实验设备有限公司产品，实时荧光定量pcr仪为bio-rad产品。

具体操作如下：

1、获取目标基因的序列信息

以衣原体原生小体(eb)的外膜蛋白envb编码基因envb的序列为检测目的基因，从genbank数据库中获取衣原体(nc_004552.2)参考序列，并确定envb基因(nc_004552.2:199142-200499)(1358bp)即seqidno.1的序列信息。

2、相关引物的设计与合成

结合生物信息学软件dnaman以及rpa引物设计的规则，设计基因envb即seqidno.1的rpa扩增引物和普通pcr扩增引物，送华大基因进行合成。其中，普通pcr扩增引物的上下游引物分别命名为seqidno.5和seqidno.6，如下所示，rpa引物有待进一步筛选。

envbpcrf：5’-gttcatttgccagcgggaagatagagg-3’即seqidno.5

envbpcrr：5’-agaaccacggtttgttacacaaatacgg-3’即seqidno.6

3、rpa引物验证

3.1普通pcr扩增

利用普通pcr对合成的rpa引物进行验证，试验所需猪流产衣原体基因组为本实验室保存，-20℃冻存。

pcr体系如下所示：

pcr扩增程序：首先95℃充分变性5min；然后35个循环，分别为：94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。

3.2pcr扩增结果：

对合成的6对引物均进行了普通pcr验证，通过筛选，如图1所示，6对引物均扩增得到了目标大小的条带，其中第1、3、6对引物除了引物二聚体之外没有杂带出现，可进行进一步筛选。

3.3rpa验证

以实验室保存的猪流产衣原体基因组为模板，采用rpa试剂盒basickit进行扩增验证。

详细操作步骤如下所示：

(1)，按照下表将反应体系加入到1.5ml离心管中

漩涡震荡混匀；

(2)，将47.5ul反应体系加入到试剂盒中的freeze-driedreaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

(3)，将2.5ul280mmmgac加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀；

(4)，将反应管置于37℃孵育4min；

(5)，从37℃反应器中拿出反应管，上下颠倒混匀，涡旋后重新置于37℃反应器孵育20min；

(6)，使用dna纯化试剂盒对扩增结果进行回收；

(7)，取5ul回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增结果进行分析。

3.4rpa扩增结果

对经过普通pcr筛选出的三对rpa引物，采用rpa试剂盒basickit进行扩增验证，结果如图2所示，三对引物均扩增出了目标大小的调带，均可作为rpa扩增引物进行下一步研究试验。其中，第6对引物的条带亮度和片段大小均为最佳，因此，将第3对引物设定为本研究的目标引物，即seqidno.2和seqidno.3。

envbrpaf：5’-cttcaggagctacaattttagaagccgagggagc-3’即seqidno.2。

envbrpar：5’-tttccaatgggttgtagcttctgcacaagaagtgc-3’即seqidno.3。

其中，seqidno.2和seqidno.3为上下游引物对模板进行扩增，得到215bp的目的片段。

4，探针的设计与合成

结合生物信息学软件dnaman以及rpa探针设计的规则，结合引物seqidno.2和seqidno.3扩增序列，设计rpa探针，即seqidno.4。探针序列中具有荧光基团fam和猝灭基团bhq1，两个基团之间由dspacer隔开，3’端由c3spacer修饰，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

envbprobe：5’-ctgaaatctgctgtaacaaagctgtatgg[dt-fam]g[dspacer]a[dt-bhq1]caaagagatgtgcccag[c3-spacer]-3’即seqidno.4。

5采用exokit对衣原体特异性荧光rpa检测

5.1特异性荧光rpa检测

以seqidno.4为探针，seqidno.2和seqidno.3为引物，以实验室保存的两株衣原体、布鲁氏杆菌以及弓形虫基因组为检测目标，以试剂盒中所配备的引物探针组合以及dna为对照，按照试剂盒说明书进行扩增，并采用荧光定量pcr仪进行信号检测。

详细的操作步骤如下：

(1)，按照下表将反应体系加入到1.5ml离心管中

漩涡震荡混匀；

(2)，将47.5ul反应体系加入到试剂盒中的freeze-driedreaction反应管中，用移液管上下吹打混匀，至反应管中的颗粒全部重悬起来；

(3)，将2.5ul280mmmgac加在反应管管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋混匀；

(4)，将反应管置于荧光定量pcr仪中，37℃，20min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线。

5.2以seqidno.4为探针，seqidno.2和seqidno.3为引物，对衣原体、布鲁氏杆菌以及弓形虫基因组进行rpa检测，结果如图3所示:两种衣原体基因组均产生了扩增曲线，布鲁氏杆菌和弓形虫基因组均未产生扩增曲线，说明该方法对检测衣原体有较强的特异性。

6，衣原体特异性荧光rpa检测灵敏度分析

6.1质粒标准品的构建

(1)采用基因envb的pcr扩增引物seqidno.5和seqidno.6，对衣原体基因组进行pcr扩增，

pcr体系如下所示：

pcr扩增程序：首先95℃充分变性5min；然后35个循环，分别为：94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。

(2)pcr产物纯化回收并构建重组质粒标准品

pcr产物按照takarabiotech公司pcr产物纯化试剂盒说明进行，获得的pcr产物通过t-a克隆，克隆在pmd18-tsimple载体上，

得到重组质粒pmd18-t-envb，即为质粒标准品。

(3)质粒标准品浓度测定

用蛋白核酸测定仪对pmd18-t-envb的浓度进行测定，经测定浓度为49.3ng/ul。

(4)质粒标准品拷贝数计算

pmd18-tsimple载体空载体大小为2692bp，envb基因1358bp，因此，pmd18-t-envb重组质粒大小为4050bp。接下来通过基因拷贝数计算公式对质粒标准品拷贝数计算，如下所示，经计算，本研究构建的质粒标准品拷贝数约为1.1×10¹⁰copies/μl。

(5)重组质粒的倍比稀释

将重组质粒pmd18-t-envb进行10倍倍比稀释，使其浓度在10⁷～10¹copies/μl之间，并将其作为rpa反应的模板。

6.2灵敏度分析

(1)基于灵敏度分析的rpa扩增

以浓度在10⁷～10¹copies/μl之间的重组质粒pmd18-t-envb作为荧光rpa反应的模板，以seqidno.4为探针，seqidno.2和seqidno.3为引物，详细的操作步骤同5.1，按照试剂盒说明书进行扩增，并采用荧光定量pcr仪进行信号检测。

(2)扩增结果

以seqidno.4为探针，seqidno.2和seqidno.3为引物，浓度在10⁷～10¹copies/μl之间的重组质粒pmd18-t-envb作为荧光rpa反应的模板，对本研究建立的衣原体特异性荧光rpa检测进行灵敏度分析，结果如图4所示，随着模板拷贝数的降低，曲线起飞时间和荧光信号值逐渐的下降，在拷贝数为10²时仍有扩增曲线，当拷贝数为10¹时判定为没有起飞，即没有明显的扩增曲线。

以上结果证明，当把表模板为10²及以上拷贝时有明显的扩增曲线，起飞时间随着模板拷贝数的增加而缩短，荧光强度随着模板拷贝数的增加而增强，满足现场检测的要求。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>用于衣原体检测的引物、试剂盒及方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1358

<212>dna

<213>nc_004552.2:199142-200499基因()

<400>1

gttcatttgccagcgggaagatagaggccgctgctgcagagtctcttgctacaagattca60

ttgccagtaccgaaaactcaaatgacaatgttttgcaagcaacagccaagaaagttagat120

ttggtcgtaacaaaaatcaaagacaagaacaaaaacatactggcgctttctgtgataaag180

aattttatccttgcgaaggtggtcagtgccaatccgtcgatactacacaagaatcttgct240

acggcaaaatgtattgtgtccgtgttaacgatgactgtaacgtggaaattagccaagctg300

tacctgaatatgcaacagtaggatctccttatcctattgaaattcttgctgtaggtaaaa360

aagattgcgttaatgttgtgatcactcaacaacttccttgcgaagttgagtttgtcagca420

gtgatcctgcgacaacaccaacctcagatagcaaattaatctggacaattgattgcttag480

gtcaaggtgaaaaatgcaaaattaccgtttgggtaaaacctcttaaagaaggttgttgct540

tcaccgcggctactgtatgcgcttgcccagaacttcgctcttataccaaatgcggacaac600

cagctatttgtattaagcaagaaggccctgagtgtgcttgcttacgttgcccagtttgtt660

acaaaatcgaagtttgcaacacaggttctgctatagcccgtaatgttgtcgttgataacc720

ctgttcccgatggctatactcacgcttcaggacaacgcgttctttcctttaacttaggag780

atatgcgccctggggattctaaatgcttctctgtggagttttgcccgcaaaaaagaggaa840

aaattactaacgtagctaccgtatcttactgcggaggacataaatgttccgcgaacgtaa900

ctactgtagttaacgaaccctgcgtacaagtcaatatctctggagctgactggtcttatg960

tatgtaagcctgtagaatacactatcgttgtgtccaacctaggggatcttaaactttacg1020

atgtcgttgtagaagataccgtaccttcaggagctacaattttagaagccgagggagctg1080

aaatctgctgtaacaaagctgtatggtgcatcaaagagatgtgcccaggagagactctac1140

aatttaaagttgttgctaaagcacaaagcccaggtaaattcacaaatcaagttgttgtca1200

aaacaaactccgattgtggaacttgcacttcttgtgcagaagctacaacccattggaaag1260

gtctggcagctactcatatgtgcgtaatcgataccaatgatcctatttgcgtaggagaaa1320

atactgtataccgtatttgtgtaacaaaccgtggttct1358

<210>2

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(衣原体特异性扩增上游引物)

<400>2

tcttatgtatgtaagcctgtagaatacactatcg34

<210>3

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(衣原体特异性扩增下游引物)

<400>3

ctttagcaacaactttaaattgtagagtctctcc34

<210>4

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(探针序列)

<400>4

ctgaaatctgctgtaacaaagctgtatgggacaaagagatgtgcccag48

<210>5

<211>208

<212>dna

<213>利用前述衣原体特异性扩增后的产物()

<400>5

tcttatgtatgtaagcctgtagaatacactatcgttgtgtccaacctaggggatcttaaa60

ctttacgatgtcgttgtagaagataccgtaccttcaggagctacaattttagaagccgag120

ggagctgaaatctgctgtaacaaagctgtatggtgcatcaaagagatgtgcccaggagag180

actctacaatttaaagttgttgctaaag208

<210>6

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(普通扩增上游引物)

<400>6

gttcatttgccagcgggaagatagagg27

<210>7

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(普通扩增下游引物)

<400>7

agaaccacggtttgttacacaaatacgg28