一种耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法与流程

本发明涉及益生菌领域，尤其涉及一种耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法。

背景技术：

长双歧杆菌，属于可用于食品中添加的益生菌，主要涉及食品、保健品、日化用品、饲料等产品的应用。益生菌菌粉，尤其通常作为乳酸菌相关的益生菌菌粉在大部分益生菌发酵食品、保健品制剂、生物饲料、医药制剂中所常见的。

益生菌普遍对环境要求较高，对外界耐受性较差，在常温下的长期贮存一直难以保持高活性，使得在产品开发和应用方面具有局限性。目前市场上益生菌虽然以冻干菌粉形式进行供应，但是在微生态制剂产品中普遍出现货架期内储存稳定性严重下降趋势，特别是常温或外环境温度较高的非恒温贮存产品，容易出现短期内活菌数大幅度下滑或骤降等现象。

目前国内产品微生态制剂产品大多处于常温或室温保存，个别地区或存在局部时段温度过高或长期恶劣气候，无法对产品放置条件达到保证，或者在一些需要特殊工艺的产品中需要经过高温长时处理，比如在胶囊、软糖、巧克力等产品制造过程中对产品中活菌造成巨大损失，所以需要一种能提高菌株自身耐受性的筛选方法所获得原料来应对不同产品的开发及应用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有高活性、在常温或高温货架期内能显著提高稳定性、并且在人体胃肠道中具有良好的耐酸、耐胆盐及胃肠道粘附性的耐热型长双歧杆菌及其筛选方法和菌粉制备方法。

本发明第一方面提供一种耐热型长双歧杆菌，已于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.10452，分类命名为长双岐杆菌(bifidobacteriumlongum)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体的，所述耐热型长双歧杆菌在75℃条件下保温30分钟存活率可达到50％以上。

具体的，所述耐热型长双歧杆菌在体外模拟胃酸ph2.5环境条件下1-2小时内存活率为60-80％。

具体的，所述耐热型长双歧杆菌在体外模拟胆盐高渗透0.3％环境条件下1-2小时内存活率为50-75％。

本发明第二方面提供一种耐热型长双歧杆菌的筛选方法，包括以下步骤：

s1、样品采集；

s2、条件性初步筛选：样品混合均匀梯度稀释后，移液至筛选培养基上涂布分离，厌氧恒温25-45℃培养12-72小时；然后挑选边缘光滑、呈乳白色隆起的菌落，反复划线镜检出菌体呈杆状、一端有时呈分叉状的革兰氏阳性菌落，反复纯化后继续厌氧恒温25-45℃培养12-72小时；

s3、抗逆性复筛：将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于40-80℃恒温水浴锅进行热激，计时热激5-30分钟，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于mrs培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数30-50次，通过检测其热激前后细胞存活率达到20-40％以上可完成条件初筛，得到耐热型长双歧杆菌，随后进行保藏。

多次高温循环热激条件下进行耐热型菌株的筛选，主要目的是：通过外界亚致死条件，刺激细胞产生热激蛋白，激发菌体自身的非特异性免疫，不断循环筛选，挑选出具有在热激条件下表现出高抗逆性特性的菌株。通过外界的亚致死胁迫，导致菌体趋于抗性的提升，并且保证菌株复苏过程中拥有较高活性。

最优的，步骤s3中，将菌泥加入稀释液混合均匀，然后置于55℃恒温水浴锅进行热激；在该温度将造成细胞亚致死，胁迫细胞在接近致死的条件下刺激产生热激蛋白形成非特异性免疫，进一步筛选具有此能力特性菌株。

最优的，步骤s3中，计时热激15-20分钟；考虑到物料中心温度与边缘温度的差异，以及混合体系介质传热速率等关系设计。最优的，控制物料中心温度达到指定温度后，恒温保存15min。该条件下可防止体系内还原糖与蛋白类成分发生过度非酶褐变反应，造成抑制性产物影响实验设计条件。

具体的，所述样品采集自健康成年人体粪便，传统发酵食品，比如酸牛奶、酸羊奶、奶酪等，以及少数哺乳动物肠道上皮细胞。

具体的，步骤s2中，样品置于生理盐水中混合均匀梯度稀释。

具体的，步骤s2中，所述筛选培养基包括10-20g/l的葡萄糖、5-20g/l的蛋白胨、10-20g/l的酵母浸膏、3-5g/l的无水乙酸钠、1-3g/l的磷酸氢二钾、1-3g/l的柠檬酸氢二铵、5ml/l的莫匹罗星锂盐，调节ph至6.8。其中，莫匹罗星锂盐是双歧杆菌筛选过程中所必须添加的成分。

具体的，步骤s3中，所述稀释液以质量分数计包括0.05-0.1％的氯化钠、0.005-0.01％的酪蛋白胨、0.4-0.8％的磷酸氢二钠、0.2-0.4％的磷酸二氢钾。

具体的，步骤s3中，所述扩培中菌株的接种量为体积百分比1-10％，培养温度为25-45℃，培养时间为12-72小时。

本发明第三方面提供一种耐热型长双歧杆菌菌粉的制备方法，包括以下步骤：

s1、菌株活化及扩培：将菌株于mrs培养基中进行接种，厌氧扩培；

s2、厌氧发酵：将菌株接种于mrs培养基中发酵，控制ph5.5-6.5，发酵时间6-15小时，od600达到5.0-9.0后降温；

s3、菌体收集及乳化：将发酵液离心后倾倒上清液，收集菌体后与保护剂按比例混合均匀后乳化；

s4、将乳化液冻干；

s5、粉碎后包装。

具体的，步骤s1中，将菌株按1-5％接种量于mrs培养基中进行接种，厌氧培养12-72小时，连续扩培3-5代后完成扩培。

具体的，步骤s2中，将菌株按照2-10％接种量于mrs培养基中进行发酵。

具体的，步骤s3中，将发酵液通过5000-15000rpm，20-30分钟离心后倾倒上清液，收集菌体，将菌泥与保护剂按照1:1.5-3.0比例进行配比，混合均匀后使用乳化器1000-5000rpm，乳化10-25分钟，充分混合后完成乳化。

具体的，步骤s4中，乳化液冻干周期12-36小时。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：1)具有耐热型，菌悬液在75摄氏度条件下保温30分钟，存活率可达到50％以上；2)在常温18个月及高温3个月内具有高稳定性；3)在体外模拟胃酸ph2.5环境条件下存活良好；4)在体外模拟胆盐高渗透3％(猪胆盐)环境条件下有良好耐受能力；5)在模拟胃肠道粘附性实验中，对上皮细胞粘附性可达40％；6)无毒、无致病性，安全性高，生产制备简便、周期短、发酵活力高，菌体离心收集率高。

本发明所筛选菌株可用于微生态制剂食品、保健品中，并且赋予产品在货架期内能具有高稳定性价值，延长保质期或降低贮存条件，减少微生态产品在生产制造过程中成本费用。

本发明所述的菌株筛选方法及制备方案可有效应用于大部分微生物活性食品、保健品生产线，主要优点在于筛选周期短、目的菌株离心率高收，产品活菌数3000-8000亿cfu/g，在常温180天内活菌数稳定性优异，下降趋势迟缓且平稳。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明耐热型长双歧杆菌的菌体形态；

图2为本发明耐热型长双歧杆菌的菌落形态；

图3为本发明耐热型长双歧杆菌菌株鉴定结果及系统发育树；

图4为本发明耐热型长双歧杆菌在25℃条件下18个月的活菌数稳定性曲线、以及37℃条件下3个月的活菌数稳定性曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明中，术语“益生菌”，主要组成为乳酸菌，革兰氏阳性、厌氧或兼性厌氧细菌，可发酵不同糖类产酸类物质，主要产酸类型为乳酸、乙酸、丙酸。工业常用益生菌有乳杆菌、链球菌、明串珠菌、乳酸乳球菌、短杆菌。双歧杆菌属于严格厌氧菌，亦常用于与乳酸菌复配使用作为益生菌制剂，包含在乳酸菌菌群中。

术语“菌粉”，主要指在益生菌发酵结束后，发酵液经生物分离提取技术进行固液分离所收集获得，常用离心或膜过滤进行分离收集，在本发明中用于与冻干保护剂均匀乳化进行冻干，冻干粉碎过筛后所得白色或浅黄色粉末。

术语“热激”，指对宿主进行高于最适温度刺激，诱导细胞产生免疫效应，使其形成热激蛋白，保护细胞并减少在特殊状态下的胁迫损伤。

术语“抗逆性”，指菌株受到外界胁迫后，部分状态受到丢失或活性损伤，通过不断生长过程，有利性状保存并遗留下来得到加强扩大，不利性状淘汰。在过程中，某些菌株获得在特异条件下的特殊抗性因子，这些特殊抗性因子使得菌株对某些环境具有良好适应能力，可自身对胁迫因子进行免疫及抵抗，这种特性称为菌株的抗逆性。

实施例1：耐热型长双歧杆菌的筛选分离及培养

长双歧杆菌分离成年健康人体的粪便样本，进行无菌采样稀释，吸取稀释液在选择性mrs培养基上进行涂布，厌氧条件下37℃、48小时培养，挑选溶钙圈较大，菌落呈乳白色隆起菌落，并进行镜检，通过多次划线纯化分离后，初步筛选生长温度在25-45℃，生长ph4.0-7.2菌株共计112株，4℃低温保藏。

所采用的稀释液成分为：0.085％氯化钠、0.1％酪蛋白胨、其余为水。所采用选择性培养基成分主要为：酪蛋白胨10g、酵母浸粉5g、磷酸氢二钾6g、柠檬酸铵2g、乙酸钠25g、硫酸镁0.575g、硫酸锰0.12g、亚硫酸铁0.034g、吐温-801.0g、乳糖20g、琼脂15g。

调节ph5.3-5.7溶解于1000ml蒸馏水中，121℃灭菌20分钟，使用前吸取0.5ml莫匹罗星锂盐混匀，加热溶解并不停搅拌，冷至50℃左右时，倾入无菌平皿。

实施例2：通过循环热刺激胁迫筛选和菌株鉴定

将实施1中所筛选低温保藏的菌株进行mrs培养基扩培，将发酵液进行离心，倾倒上清液，加入1-5ml稀释液，吹打混匀，使菌泥充分分散于稀释液中，将含菌稀释液封口后至于75℃恒温水浴锅进行热激，计时热激5-30分钟，完成热激后迅速使用冷却水降温于20℃以下，将热激后含菌稀释液进行涂布或划线进行分离，挑选其中生长饱满且大小适中菌落于mrs培养基中扩培，重复将扩培后的发酵液进行离心、稀释、热激、涂布、筛选一系列循环，循环次数50次，通过检测其热激前后细胞存活率达到25％以上可完成条件筛选，每次每株分析至少进行1-2平行组实验，达到条件后进行保藏。选择所有样品中在筛选过程中存活率最高菌株命名为bl21，通过实验数据直观看出，在多次的循环热激过程中，存活率有明显上升现象，并且最高存活率可达到53％，50次传代循环热激存活率变化数据见表1：

表1传代循环热激存活率变化数据表

本发明在筛选过程中采用循环多次条件筛选，在筛选次数1-15次内菌体仍处于损伤期，通过胁迫造成的影响损伤较大，筛选率达到80-90％，在筛选次数15-35次内存活率呈平稳上升趋势，但造成发酵液存活率有所下降，筛选次数35-50次过程中明显上升，超过50次后上升不明显，考虑到传代次数对菌体自身造成的不定影响，筛选次数控制在30-50次之间。

本发明提供的筛选方法，以热激前后存活率达到30％以上为合格菌株。主要选择依据是存活率在30％以上菌株较有较为明显的抗热性体征。

如图1所示，本实施例所筛选菌株bl21通过光学显微镜观察，在镜检下呈革兰氏阳性菌，分叉短杆状、多以棒槌状或y型出现，不呈链，主要利用葡萄糖、乳糖等碳源，代谢产物有乙酸、乳酸等，化能异养型，生长过程需要大量丰富氮源及部分微量元素，厌氧培养，生长温度30-40摄氏度。本实施例所筛选菌株bl21的菌落形态，如图2所示。

bl21通过中国科学院微生物研究所根据细胞形态、生理生化特征、tuf基因序列、idh基因序列等实验数据综合分析，鉴定结果为长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)，其系统发育树如图3所示

实施例3：长双歧杆菌菌株bl21的特性测试

1、粘附特性测试

乳酸菌对于宿主肠道上皮细胞的粘附性具有菌株特异性而并非宿主特异性，因此可以采用体外模型来筛选所诉求的乳酸菌。双歧杆菌的粘附过程首先是通过非特异性接触，之后与受体结合，本实验根据实施例2所获得的长双歧杆菌菌株bl21，测试其对胞外机制的粘附能力，发现其具有高粘附特性。

将长双歧杆菌菌株bl21菌液8000r/min离心15分钟，除去上清液，收集沉淀的菌体，将菌体和rpmi-1640细胞培养基重混合，使其浓度达到10⁸cfu/ml。将制备完成的菌悬液加入到24孔平板中，每孔1ml，将24孔细胞培养板在5％co2、95％空气的co2培养箱中37℃培养3小时，吸收出未粘附的菌悬液，用磷酸盐缓冲盐冲洗5次，然后加入含有聚乙二醇辛基苯基醚的的磷酸盐缓冲液溶解细胞，加入无菌水溶解。最后进行计数，培养条件为37摄氏度恒温厌氧培养，2-3天后统计活菌数(gb4789.35方法检测)。结果如下表，其中fb002、fb003、fb004、fb010、fb012、fb013、fb014、fb015为其它双歧杆菌菌种，bb12和bi-07为行业内公认的高粘附力双歧杆菌菌种标品，作为对照组能够很好的比较出0.3％是较理想指标，结果表明，本发明的长双歧杆菌菌株bl21，粘附力相较其它菌株有明显优势。

表2长双歧菌株在胃肠道中粘附性效果

2、耐受胃酸能力测定

本实验根据实施例2所获得的长双歧杆菌菌株bl21，测试其耐受胃酸能力，方法如下：

将长双歧杆菌菌株bl21在mrs液体培养基中活化3代，使液体培养基中菌的浓度达到10⁸cfu/ml。取100μl的菌液接种于9.9ml用4m盐酸酸化到ph1.5、2.0和2.5的液体培养基和未酸化的培养基中(作为对照)，37℃处理90分钟，之后将样品稀释不同的梯度，用琼脂平板倾注法在厌氧培养箱中37℃培养48小时后计数，对比处理前后活菌数的变化。结果如表3所示，可见bl21在ph2.5环境条件下1.5小时内存活率达到75.6％，在ph1.5环境条件下1.5小时内存活率也可达到52.4％，耐受胃酸能力优异。

表3长双歧菌株耐酸实验结果

3、耐受肠液胆盐能力测定:

本实验根据实施例2所获得耐热型长双歧杆菌菌株bl21，测试其耐受肠液胆盐能力，方法如下：

将耐热型长双歧杆菌菌株bl21活化两代后的益生菌菌株2％接种于含胆汁的液体培养基中(含0.3％猪胆盐汁)，同时2％接种于不含胆汁的培养基中作为对照。37℃条件下处理2h前后分别计活菌数。结果如表3所示，可见bl21在0.3％环境条件下2小时内存活率为58.1％，在0.5％环境条件下2小时内存活率仍可达到40.3％，耐受肠液胆盐能力优异。

表4长双歧菌株耐胆盐实验结果

实施例4作为食品添加剂的制备及货架期贮存稳定性

将实施例2所得菌株bl21进行扩培发酵，离心乳化，冻干粉碎后得到原菌粉，按照以下配方完成食品添加剂配制，所获得添加剂可加入食品及保健品产品中。

配方为：bl21冻干菌粉5％、麦芽糊精80％、益生元(菊粉、低聚果糖)15％。

将此实施例配方进行分装包样，检测水分活度低于0.01、水分低于5.0％，放置于25摄氏度及37摄氏度恒温培养箱进行放置，记录在货架期内产品中活菌稳定性数据。结果如图4显示，为常温(25℃)条件下18个月的活菌数稳定性曲线，3个月内活菌稳定性呈平缓下降趋势，在常温3-6个月过程中基本处于稳定趋势，最终存活率可达47％。加速实验(37℃)条件下3个月的活菌数稳定性曲线如图4显示，结果显示3个月内活菌稳定性下降平缓，最终存活率可达60％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。