轻度贫血男性生精障碍致病基因NFATC1及其检测方法与流程

本发明涉及基因及其检测方法，特别涉及轻度贫血男性生精障碍致病基因nfatc1及其检测方法。
背景技术：
：在生育年龄的男性中约有5%存在不育问题，其中的40％属于精子质量异常，主要表现为少精症、无精症和精子活力差等生精障碍。男性生育能力依赖于有功能的精子，精子在睾丸内产生和发育的过程是由众多相关基因控制，这些基因发生异常就会影响精子的形成从而造成男性不育。目前认为生精相关基因的突变、插入/缺失和遗传多态性是男性生精障碍的重要遗传病因，然而其中大部分生精相关基因尚未得到解析。因此探究男性生精障碍致病基因特征十分有必要，这是揭示男性不育遗传机制、致病基因检测以及针对性预防和治疗的基础。近年来，随着二代测序技术的发展和测序成本的降低，可以实现在基因组层面上对疾病致病基因的研究。然而由于疾病往往存在复杂性，因此必须将二代测序结果和基本体征以及临床信息相结合从特定的疾病亚群入手更好地解析其致病基因特征。本发明申请人从25例生精障碍患者样本的全外显子组测序结果中发现，有4例患者都出现了nfatc1基因的c.19839c>g突变，而同时此4例患者均为轻度贫血体征。经进一步验证，本发明申请人首次揭示了基因nfatc1为轻度贫血男性生精障碍相关基因并提供了其致病突变形式，在此基础上构建了基于pcr扩增和sanger测序的突变检测方法。技术实现要素：本发明提供了轻度贫血男性生精障碍亚群对应的致病基因，并在此基础上构建了致病基因的检测方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：本发明的目的之一在于提供轻度贫血男性生精障碍致病基因nfatc1，突变所在片段序列如seqidno:1所示，对应的突变为c.19839c>g，发生在exon2中；所述突变基因形式经验证，为轻度贫血男性生精障碍致病基因。值得注意的是，seqidno:1仅展现出突变所在的片段序列，基因的其余序列详见genebank上登录号ng_029226.1的野生型参考基因序列，c.19839c>g表示的是nfatc1基因的19839位点的c突变成g。其中，所述轻度贫血男性生精障碍致病基因的揭示，可以但不限于用于制备轻度贫血男性生精障碍诊断芯片和试剂盒、构建轻度贫血男性生精障碍检测方法以及制备轻度贫血男性生精障碍治疗药物。本发明的另一目的在于提供轻度贫血男性生精障碍致病基因突变检测方法，主要是利用seqidno:2-seqidno:3所示引物对扩增nfatc1致病基因片段，并对扩增产物进行sanger测序以判断是否发生c.19839c>g突变。其中，seqidno:2-seqidno:3所示引物对扩增的是c.19839c>g突变所在的基因片段，扩增片段对应于genebank上登录号ng_029226.1的野生型参考基因序列的19711-20087，扩增片段长度为377bp。致病基因nfatc1片段的扩增引物对seqidno:2-seqidno:3可应用于制备轻度贫血男性生精障碍诊断芯片和试剂盒以及构建男性生精障碍检测方法中。本发明提供了nfatc1基因引起的轻度贫血男性生精障碍的c.19839c>g突变基因形式，以及基于pcr扩增和sanger测序的致病基因检测方法，这些可以为其致病机理的解析、致病基因检测以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础。附图说明图1是实施例1中的p1号患者的nfatc1基因c.19839c>g突变扩增片段的sanger测序图谱中突变位点局部，途中箭头指向处为突变位点。图2是实施例1中p1号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，p1号患者为图2中ii1。两图中正方形表示男性，圆形表示女性；实心表示生精障碍个体，空心表示正常个体,“\”表示轻度贫血体征；图2中“+”表示nfatc1基因扩增片段检出c.19839c>g突变；“-”均表示nfatc1基因扩增片段未检出c.19839c>g突变；i和ii分别代表第1和2代，数字为成员编号。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例1选择临床检查确诊的25名男性生精障碍患者在其签署了知情同意书的情况下，进行基因检测和分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》（j.萨姆布鲁克等编著，第三版，科学出版社）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，实施例涉及少精和弱精等生精障碍患者的诊断以及轻度贫血等的判定依据现有的常规临床和体征标准。（1）男性生精障碍患者的基因突变测定取男性患者的肘部静脉血5ml，利用德国qiagen公司的qiaamp血液基因组提取试剂盒提取待测患者样本基因组dna，检测合格后将其送华大基因进行全外显子捕获测序。全外显子测序建库采用的是美国agilent公司的sureselecthumanallexonkitv1试剂盒，二代测序仪是美国illumina公司的hiseq2500，测序的平均深度超过500×。针对原始测序数据，利用dbsnp数据库，千人基因组数据库和8个hapmap外显子组数据库等数据库过滤无效和多态性信息确定突变位点信息。（2）特定体征的男性生精障碍患者亚群界定选择25例男性生精障碍患者中具有相同的特定基因突变的亚群，同时需要满足亚群中患者数不少于3例且能找到共同的体征。对照基因突变结果，结合经询问和临床常规检查检测等得知的患者信息，发现存在轻度贫血患者亚群（共4例编号p1、p2、p3和p4）且均含有nfatc1基因的c.19839c>g突变，具体结果如表1所示。p1-p4这4例患者均为成年男性（平均年龄为27岁），血红蛋白均位于90-120g/l之间（平均血红蛋白为102g/l，而男性正常标准约为120g/l，女性正常标准约为110g/l），红细胞数目均低于3.4×1012（男性正常标准约为4.0×1012，女性正常标准约为3.5×1012），红细胞比容均低于0.4（男性正常标准约为0.42，女性正常标准约为0.37），均诊断为轻度贫血。此4例患者nfatc1基因的c.19839c>g突变，其所在基因片段序列如seqidno:1所示。其余21例非轻度贫血患者并无nfatc1基因的c.19839c>g突变检出，可以视为对照。经文献查询和数据库比对发现，轻度贫血男性生精障碍患者nfatc1基因的c.19839c>g突变为本发明首次报道。nfatc1基因是nfat家族中的重要成员，最早被认为是t细胞活化调控因子，在调控免疫细胞方面具有重要功能。后续研究发现，该因子可以调控与高血压、动脉粥样硬化、血脂异常密切相关的cox-2、apob等多种基因。然而，并未有该基因与轻度贫血男性生精障碍相关的研究报道。表14例轻度贫血男性生精障碍患者基因检测及验证结果患者编号基因突变情况sanger测序结果家系分离序列p1nfatc1c.19839c>g图1，一致是seqidno.1p2nfatc1c.19839c>g参见图1，一致是seqidno.1p3nfatc1c.19839c>g参见图1，一致是seqidno.1p4nfatc1c.19839c>g参见图1，一致是seqidno.1针对所述c.19839c>g突变，设计pcr引物对扩增其所在的基因片段。采用seqidno:2-seqidno:3所示的引物对，扩增c.19839c>g所在的基因片段（对应于genebank上登录号ng_029226.1的野生型参考基因序列的19711-20087），扩增体系详见表2，扩增片段长度为377bp。表2扩增体系编号组份添加量110xpcrbuffer(mg2+)2.5ul2dntpmix(10mm)2ul3上游引物(10um)1ul4下游引物(10um)1ul5rtaq0.2ul6templatedna(30ng/ul)1ul7灭菌ddh2o17.3ul扩增条件为：94℃预变性3min；30个循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃终延伸5min。p1-p4这4例患者nfatc1基因扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行sanger测序。sanger测序结果发现均与二代测序结果一致（图1，表1）。（3）家系分析验证致病基因突变由于所述nfatc1基因的c.19839c>g突变未被报道，因此收集p1-p4这4例轻度贫血男性生精障碍患者家系相关成员血样，pcr扩增nfatc1基因片段再进行sanger测序。以p1号患者为例，该患者存在nfatc1基因的c.19839c>g突变。如图2所示患者p1是ii1，该患者30岁，结婚4年妻子未孕就诊；经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1500万个为少精，父母健在且有一28岁妹妹。此家庭4人经血常规检测，发现患者p1和其母亲为轻度贫血，其父亲和妹妹不贫血。采集患者的父母和妹妹血液样本提取基因组dna，参照（2）中条件利用seqidno:2-seqidno:3所示引物对扩增nfatc1基因片段，sanger测序显示患者母亲也存在c.19839c>g突变，而其父亲和妹妹均无该位点突变。结果表明轻度贫血体征者均含有nfatc1基因的c.19839c>g突变，且携带c.19839c>g突变的男性同时出现生精障碍，而女性本就不产生精子因此无此症状。表1中的其余3例即p2-p4患者也出现了nfatc1基因的c.19839c>g突变（具体详见表1），分析其家系也是轻度贫血体征者均含有nfatc1基因的c.19839c>g突变，且携带c.19839c>g突变的男性同时出现生精障碍，即出现了基因型-表型的家系共分离现象，由此证明了nfatc1基因是轻度贫血男性生精障碍的相关基因，其致病性突变为c.19839c>g，其所在片段序列如seqidno:1所示。实施例2另外收集轻度贫血男性生精障碍患者10例、非贫血男性生精障碍患者20例以及轻度贫血但非生精障碍男性10例，将其血样进行基因组提取。对于每例样本，参照实施例1中的体系和方法扩增所述nfatc1致病基因片段，扩增产物进行测序分析。结果只发现了10例轻度贫血男性生精障碍患者出现了nfatc1基因的c.19839c>g突变，相关数据如表3所示。表310例轻度贫血男性生精障碍患者nfatc1基因片段测序结果样本编号突变情况序列a1c.19839c>gseqidno:1a2c.19839c>gseqidno:1a3c.19839c>gseqidno:1a4c.19839c>gseqidno:1a5c.19839c>gseqidno:1a6c.19839c>gseqidno:1a7c.19839c>gseqidno:1a8c.19839c>gseqidno:1a9c.19839c>gseqidno:1a10c.19839c>gseqidno:1对于表3中10例轻度贫血生精障碍患者均出现了nfatc1基因的c.19839c>g突变，而20例非贫血男性生精障碍患者和10例轻度贫血但非生精障碍男性，均不存在nfatc1基因的c.19839c>g突变，从而从正反两方面再次验证了本发明提供的nfatc1基因的c.19839c>g突变形式为轻度贫血男性生精障碍致病基因，以及本发明提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性。基于本发明新鉴定的nfatc1基因的c.19839c>g致病突变形式，本发明申请人将突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，菌液存于终浓度20%（v/v）甘油的冻存管中，置于-80℃冰箱中长期保存。另一方面，由于本发明对于致病基因序列的公布，可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得到，或通过序列合成的方式获取。虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>黄志玲<120>轻度贫血男性生精障碍致病基因nfatc1及其检测方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>377<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1ccacaaccttcagacctccacaccgggcatcatcccgccggcggatcacccctcggggta60cggagcagctttggacggtgggcccgcgggctacttcctctcctccggccacaccaggcc120tgatgggggccctgccctggagagtcctcgcatcgagataacctcgtgcttgggcctgta180ccacaacaataaccagtttttccacgatgtggaggtggaagacgtcctccctagctccaa240acggtccccctccacggccacgctgagtctgcccagcctggaggcctacagagacccctc300gtgcctgagcccggccagcagcctgtcctcccggagctgcaactcagaggcctcctccta360cgagtccaactactcgt377<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccacaaccttcagacctcca20<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3acgagtagttggactcgtagg21当前第1页12