一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法与流程

本发明涉及瓜实蝇的检测方法，具体涉及一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法。

背景技术：

瓜实蝇bactrocera(zeugodacus)cucurbitae(coquillett)属双翅目diptera实蝇科tephritidae，是一种在热带、亚热带地区广泛分布的重要有害生物，可危害100余种瓜果蔬菜。由于其危害大，且容易随寄主果实调动作远距离传播，从而严重影响果蔬生产和国际贸易，我国和许多国家及地区将其列为重要的进境检疫性有害生物。

长期以来，实蝇的鉴定主要是基于其形态学的特征而确定的，由于生活环境不同，实蝇形态特征随之发生相应的变化，给鉴定带来困难甚至错误。在瓜果蔬菜的检疫中，常常获得的是实蝇的幼虫和卵，然而依靠现有的技术，实蝇幼虫很难通过形态鉴定到种；如果将幼虫和卵饲养到成虫再进行种类鉴定，这会需要较长的时间，影响到口岸检疫的运行速度和检疫质量，因此迫切需求建立一套快速、准确、切实可行的实蝇检测技术。

环介导恒温扩增(lamp)是由notommi等在2000年首先建立起来的一种全新的核酸恒温扩增技术。lamp具有操作简单、快速、灵敏度高等优点，已受到人们的广泛关注。目前该技术在病毒、细菌、寄生虫鉴定领域取得了令人瞩目的效果，但是在昆虫鉴定领域应用的还很少，目前还未见有将其应用于瓜实蝇鉴定的相关报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法，该方法检测速度快，具有良好的特异性，反应灵敏度好。

本发明所述的快速可视化瓜实蝇分子检测方法，包括以下步骤：

1)设计lamp引物，包括2条内引物和2条外引物，分别如下：

f3：5’-agtaagtaagggttgattaaggt-3’；

b3：5’-ccttactcccgattcttcac-3’；

fip：5’-tccccttccacccatatttctcctgcaattattacaatgaatcctg-3’；

bip：5’-agatccggtgtttgatgtaagaatccatttatcgtactccagcaata-3’；

2)提取样本dna，制备dna模板；

3)配制lamp反应体系，在反应之前向其中加入羟基萘酚蓝(hnb)，之后进行反应；

4)反应结束后，灭酶，之后根据反应料液的颜色判定是否为瓜实蝇。

采用本发明所述方法检测是否为瓜实蝇时，当步骤4)反应得到的反应料液的颜色呈蓝色时即判定为瓜实蝇。在反应过程中，dntps在酶催化下形成dna链，释放出磷酸盐；磷酸盐与反应体系中的镁离子结合形成沉淀。在反应体系中加入金属指示剂羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝随着反应液中的镁离子浓度的不同，呈现不同颜色；因此，可以通过肉眼观察反应料液的颜色的变化，判定检测结果。

上述方法的步骤3)中，当羟基萘酚蓝的加入量按10μl的反应体系加入1.0×10^-6-1.5×10^-6mmol的羟基萘酚蓝为基准计算，更优选是按10μl的反应体系加入1.2×10^-6mmol的羟基萘酚蓝为基准计算。

上述方法的步骤3)中，通常是控制反应时间≤90min，为了降低出现假阳性的机率，优选是控制反应时间60-85min；进一步控制反应时间为70-80min，更优选控制反应时间为70-80min，从而有效控制假阳性出现的机率。

上述方法的步骤2)中，dna样本和模板dna采用现有常规试剂盒及方法进行提取，优选的，采用quickextractdnaextractionsolution试剂盒(epicentre公司)提取样本dna，具体的方法参照试剂盒的说明书。

上述方法的步骤3)中，所述lamp反应体系包括缓冲液、酶液、mg²⁺、dntps、dna模板或样本dna、水和步骤1)中的lamp引物，可以采用现有常规方法进行配制。lamp体系的终体积及其中各物质的浓度可参考现有技术，在本申请中，具体如下：各引物：f3/b3各0.2μmol/l,fip/bip各1.6μmol/l；dna模板：200-20ng；镁离子：5-8mmol/l(终浓度)；甜菜碱：0.4-0.6mol/l；反应体系的终体积优选为10-25μl。

上述方法的步骤3)中，反应通常在60-66℃条件下进行，优选是在63-65℃条件下进行，更优选在65℃条件下进行。灭酶即使酶失活，操作与现有技术相同，具体可以是将反应完成后的料液升温到98-100℃使酶失活。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、通过设计特殊的lamp引物、在反应之前加入羟基萘酚蓝，并结合其它步骤，实现通过肉眼观察反应料液的颜色来判定检测结果；

2、反应无需像pcr反应在多重温度下反复升降温，检测在100min(包括样本dan的提取)内即可完成，检测速度快；

3、设计的lamp引物使得本发明所述方法具有良好的特异性，反应灵敏度好，能够检测到4.60ng/μl的dna模板。

4、本发明所述方法具有高度的准确性，经试验，与电泳法和实时荧光检测法的结果一致；

5、本发明所述方法简单易操作，所需设备简单，适用于口岸一线和没有配备先进分子检测设备的工作条件下使用。

附图说明

图1-3分别为采用实时荧光法、凝胶电泳法及本发明所述方法检测各供试昆虫具体所属种类时所得实时荧光扩增图、凝胶电泳图及可视化结果图，其中：m，marker；ck，h2o；1-3，瓜实蝇b.cucurbitae；2-6，南亚果实蝇b.tau；7，桔小实蝇b.dorsalis；8，桔小实蝇复合种b.dorsalisspeciescomplex；9，近黑颜实蝇b.parater；10，锈实蝇b.rubiginus；11，具条实蝇b.scutellata；12，颜带实蝇b.cilifer；13-15，番石榴实蝇b.correcta；

图4-6分别为采用实时荧光法、凝胶电泳法及本发明所述方法检测各供试昆虫种类的灵敏度的实时荧光扩增图、凝胶电泳图及可视化结果图，其中：m，marker；ck，h2o；1-3，瓜实蝇b.cucurbitae；2-6，南亚果实蝇b.tau；7，桔小实蝇b.dorsalis；8，桔小实蝇复合种b.dorsalisspeciescomplex；9，近黑颜实蝇b.parater；10，锈实蝇b.rubiginus；11，具条实蝇b.scutellata；12，颜带实蝇b.cilifer；13，番石榴实蝇b.correcta；1-13供试昆虫的模板浓度分别对应表3中1-13的模板浓度；

图7-9分别为采用实时荧光法、凝胶电泳法及本发明所述方法检测各供试昆虫种类的实时荧光扩增图、凝胶电泳图及可视化结果图，其中：m，marker；ck，h2o；1，阳性对照(瓜实蝇)；2，快速提取的样本dna(稀释2倍)；3，快速提取的样本dna(稀释3倍)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

1、材料与方法

1.1供试昆虫

本试验以实蝇监测诱捕的实蝇和口岸截获的实蝇为研究对象，如下述表1所示。所有供试昆虫均经过成虫形态鉴定(幼虫同批截获虫源饲养为成虫后鉴定)和dna条形码鉴定。

表1供试昆虫

1.2dna提取

1.2.1基因组dna常规提取

使用dneasyblood&tissue试剂盒(qiagen公司)，参考试剂盒说明操作提取基因组dna。

1.2.2dna快速提取

使用quickextractdnaextractionsolution1.0(epicentre公司)试剂盒，参考试剂盒说明快速提取dna样本：将0.5-1cm的虫体置于1.5ml离心管，研磨均匀；加入0.5mlquichextractsolution；震荡混匀15s；65℃孵育6min；震荡混匀15s；98℃孵育2min；所得dna样本直接用于扩增或-20℃储存待用。

1.3lamp反应

1.3.1lamp引物

以实蝇cytb基因为靶标设计lamp引物，如下述表2所示，引物由北京诺赛基因合成。

表2lamp引物

1.3.2反应体系

10μl反应体系：10×thermopol缓冲液1μl，mgso4(100mm)0.4μl，dntp混合液(10mm)1.4μl，fip/bip各1.6μm，f3/b3各0.2μm，bstdna聚合酶(大片段)(8u/μl)(neb)0.4μl，甜菜碱(10m)0.5μl，dna模板1μl，加水至10μl。

1.3.3反应条件

本发明所述方法检测：65℃水浴100min，95℃水浴1min使酶失活。

实时荧光检测：65℃10min；65℃15s，65℃45s，95个循环；95℃1min。1.3.4产物检测

电泳检测，反应产物1％琼脂糖凝胶电泳检测；

实时荧光检测，反应前在体系中加入0.4μl绿如蓝(北京天恩泽基因科技)，fam通道实时检测反应荧光值；

本发明所述方法检测，反应前在反应体系中加入0.4μlhnb(3mm)，反应结束(进一步使酶失活)后，通过裸眼观察颜色判定。

1.4特异性检测

通过不同种类和不同种群的实蝇(表1)，检测lamp引物的特异性。

1.5灵敏度检测

以提取的瓜实蝇dna模板为初始浓度，取10μl模板加入10μlddh2o进行稀释，稀释后dna使用超微量紫外分光光度计(nano-200)检测浓度(如下述表3所示)，按1.3.2的体系反应。

1.6快速提取dna模板检测

将1.2.2提取的dna模板分别稀释2倍和3倍(具体浓度如下述表3所示)后加入反应体系，以水为阴性对照，1.2.1提取的瓜实蝇dna模板为阳性对照，检测快速提取模板的检出情况。

表3模板浓度

*快速粗提dna。

2、结果与分析

2.1特异性

采用实时荧光法、凝胶电泳法及本发明所述方法检测的结果分别如图1、图2和图3所示。结合图1-3可知，本发明所述方法能够准确将瓜实蝇与其近似种进行区分。瓜实蝇样本实时荧光扩增中，有明显的扩增峰(图1中的1-3)；凝胶电泳有典型的梯状条带出现(图2中的1-3)；采用本发明所述方法检测时，加入hnb,反应结束后，瓜实蝇样本反应管呈天蓝色(图3中的1-3)，而其他样呈紫罗兰色(图3中的4-14，ck)。同时，反应时间最好是控制在90min以内，否则假阳性出现的几率增加(图1中的15)。

2.2灵敏度

采用实时荧光法、凝胶电泳法及本发明所述方法检测各供试昆虫种类时的灵敏度结果分别如图4、图5和图6所示。由图4可知，本发明所使用的lamp反应体系，能够检测到4.60ng/μl的dna模板，随着浓度的降低，出峰时间延长(图4)，当dna浓度进一步降低时，虽然也有反应，但是过长的反应时间，容易导致假阳性，故4.60ng/μl为本反应体系的检测最低浓度。

2.3快速提取dna模板检测

采用实时荧光法、凝胶电泳法及本发明所述方法检测各供试昆虫所属种的结果分别如图7、图8和图9所示。结合图7-9可知，本发明所述方法能够检测快速粗提的样本dna。dna快速粗提和lamp检测的总时间在100min内完成，实现了瓜实蝇的快速分子检测；且三种方法检测结果一致。

3、讨论

相较于形态鉴定，分子检测方法，仅需极小量的样品即可进行分析，而且摆脱了昆虫虫态对鉴定的限制，因而广泛的应用于昆虫的鉴定。目前一些分子检测方法如常规pcr、实时荧光pcr、dna条形码等已经在实蝇的鉴定中得到应用。但是，这些方法都需要精密的仪器设备，结果判定也需要借助成像系统或序列比对等来进行，通常完成检测也需要数小时甚至更长时间。

本发明应用环介导等温扩增(lamp)技术，针对目的基因的6个序列区域，设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物)，利用具有链置换活性的dna聚合酶(bstdnaploymerase)，短时间内即可将只有几个拷贝的靶基因扩增到109-1010分子水平，整个反应只需在恒温水浴中完成。通常一个小时甚至更短的时间内就能完成检测，可以通过肉眼目测判定结果。

由于lamp反应灵敏度高，可通过以下几种措施进一步降低假阳性：(1)避免气溶胶的产生，其中一个重要的手段是避免反应后打开反应管，或者是通过加入微晶蜡可液体石蜡进行密封；本试验在用实时荧光检测和本发明所述方法进行检测时，在反应前，分别将对反应没有干扰的绿如蓝和hnb加入体系，避免了反应后开盖产生气溶胶的风险；(2)同时反应完成后使酶失活，进一步降低可能的假阳性出现。

上述试验结果表明，本发明所述方法所述快速可视化瓜实蝇分子检测方法，检测时间短、效率高，从dna提取到完成检测时间在100min内；同时设备需求简单，仅需水浴锅即可完成；适合口岸一线和没有配备先进分子检测设备的工作条件下使用，具有广阔的应用前景。

序列表

<110>凭祥出入境检验检疫局综合技术服务中心

<120>一种快速可视化瓜实蝇分子检测方法

<130>2017

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

agtaagtaagggttgattaaggt23

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

ccttactcccgattcttcac20

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

tccccttccacccatatttctcctgcaattattacaatgaatcctg46

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

agatccggtgtttgatgtaagaatccatttatcgtactccagcaata47