本发明涉及药物中间体乙基羟化物的制备，特别涉及一种生物发酵生产乙基羟化物的方法。
背景技术：
左炔诺孕酮是一种白色结晶性粉末，无臭，无味。在三氯甲烷中溶解，在甲醇中微溶，在水中不溶。主要用作探亲避孕药和紧急避孕药，与雌激素合并使用，系短效和长效口服避孕药，有抑制排卵作用，是当前国内外应用最广泛的。也可用于治疗月经不调，子宫功能性出血及子宫内膜异位症等。
左炔诺孕酮(lng)为全合成的强效孕激素，是消旋炔诺孕酮的光学活性体，活性比炔诺孕酮强1倍，约为炔诺酮的100倍。为此，剂量比炔诺孕酮可减半，不良反应也减少。左炔诺孕酮主要作用于下丘脑和垂体，使月经中期fsh和lh水平的高峰明显降低或消失，卵巢不排卵，有明显的抗雌激素活性，比炔诺酮强10倍左右，几乎不具有雌激素活性。能使宫颈粘液变稠阻碍精子穿透。对子宫内膜转化显示极强的孕激素活性，可使子宫内膜变薄，内膜上皮细胞呈低柱形，分泌功能不良，不利于孕卵着床。lng也有一定雄激素活性和蛋白同化作用，口服或皮下注射均可抑制排卵。
乙基羟化物是合成左炔诺孕酮(lng)的重要的中间体，目前的制备方法是采用啤酒酵母菌对乙基缩合物进行还原：
但该乙基羟化物制备采用的生物法发酵菌为啤酒酵母菌，使用该菌种生产，主要问题为该菌种选择性差，培养过程条件苛刻，难以控制，导致双羟基化物达20％左右，且生产周期较长，收率不高，不利于工业化生产。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种生物发酵生产乙基羟化物的方法，该方法过程易于控制，生产周期短，便于规模化生产，同时得到的乙基羟化物质量稳定，收率高。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种生物发酵生产乙基羟化物的方法，包括如下步骤：
s1：将酵母菌接入试管斜面培养基中，并置于温度26-28℃的恒温条件下培养时间48h，所述试管斜面培养基由麦芽汁40ml：琼脂1g组成，ph自然；
s2：将s1步骤中培养好的酵母菌接入茄瓶斜面培养基中，并置于温度26-28℃的恒温条件下培养时间48h，所述茄瓶斜面培养基由水100份、葡萄糖3份、玉米浆2份、琼脂2份组成，ph自然；
s3：将s2步骤中培养好的酵母菌接入种子培养基中，并置于温度28-30℃、空气压力0.05-0.06mpa条件下搅拌、培养至种子培养基中的吸光度大于1.0×10，得到种子液；所述种子培养基由水100份、葡萄糖5份、玉米浆2.5份、泡敌0.1份组成，调节ph至4.4-4.6；
s4：将s3步骤中种子液接入发酵罐培养基中并置于温度28-30℃、空气压力0.05-0.06mpa条件下搅拌、培养至发酵罐培养基中的吸光度大于1.2×10，得到发酵培养液；所述种子液与发酵罐培养基按各自所占发酵罐体积的2-10％：40-70％进行混合，总体积不超过发酵罐体积的80％，所述发酵罐培养基由葡萄糖4份、玉米浆2.5份、水100份、泡敌0.02份组成，调节ph至4.4-4.6；
s5：在发酵培养液中加入乙基缩合物乙醇溶液，得到发酵液，发酵液在温度为29～31℃条件下通入压缩空气发酵72～80小时，得到乙基羟化物；其中，乙基缩合物乙醇溶液通过将乙基缩合物加热溶于95％乙醇溶液中制得。
优选的，s1步骤中的试管斜面培养基的制备方法为：将麦芽汁、琼脂混合后加热溶解，再分装于试管中，后塞上棉花塞子，消毒20分钟，后搁成斜面备用。
优选的，s2步骤中的茄瓶斜面培养的制备方法为：将水、葡萄糖、玉米浆、琼脂混合后分装于茄瓶中，塞上棉塞，消毒20分钟，后搁成斜面备用。
进一步优选的，s1、s2步骤中培养基的消毒温度为121℃。
优选的，s3步骤中酵母菌接入前对种子培养基进行高温消毒；s4步骤中种子液接入前对发酵罐培养基进行高温消毒。
优选的，s5步骤中发酵时通入空气量为发酵液体积的3～4倍。
优选的，乙基缩合物与95％乙醇溶液按1g：6ml进行混合。
优选的，所述乙基缩合物溶于95％乙醇溶液时的加热温度为45～50℃。
优选的，s1、s2步骤中的酵母菌在进行下一步骤前通过冰箱保存，保存温度为0～7℃。
优选的，s3和s4步骤中的培养基均通过氢氧化钠溶液调节ph。
优选的，s3和s4步骤中的搅拌速率分别为160r/min和120r/min。
采用上述技术方案，通过多个步骤对酵母菌进行定向培养，使酵母菌具有高度的选择性，同时其培养过程容易控制，生产周期短，整个制备过程中双羟化物小于1％，收率高，为80％-90％，制得的乙基羟化物质量稳定，纯度保持在99.78％-99.81，便于规模化生产。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的乙基羟化物由乙基缩合物经酵母菌的还原而得，其中乙基缩合物和乙基羟化物的结构式如下：
而本发明的具体实施例如下：
实施例1
将150ml麦芽汁和3.75g琼脂混合加热溶解后分装于10支试管中，每支15ml。控制温度121℃，消毒20分钟。冷却搁成斜面，于无菌室挑上一环面包酵母菌在空白试管斜面上，由底至口划一道线，控制物料温度26～28℃于恒温培养箱培养48小时，得到试管斜面菌种。该菌落生长丰满，乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，放冰箱于0～7℃保存。
将30g葡萄糖、20g玉米浆、30g琼脂以及1000g饮用水制成培养基分装于10支茄形瓶中，每支100ml。控制温度121℃，消毒20分钟。冷却搁成斜面，挑上一环试管斜面菌种在空白茄形斜面上，由底至口划一道线，控制物料温度26～28℃于恒温培养箱培养48小时，得到茄瓶斜面菌种。菌落生长丰满，乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，放冰箱于0～7℃保存。
将无菌水倒入茄形斜面中，用接种针将茄瓶斜面培养基上的菌种刮下，形成菌种悬浮液，再将菌种悬浮液全部接入已消毒的接种瓶中，放置于无菌室中备用。
将10g葡萄糖、5g玉米浆、200g饮用水以及0.2g泡敌加入到1000ml三角烧瓶中，采用氢氧化钠溶液调节ph至4.6，用12层干净纱布扎口，放入消毒锅于121℃消毒20分钟。冷却至28℃。接入8ml菌种悬浮液，控制物料温度26～28℃于恒温培养箱培养10～12小时至吸光度1.0×10以上，形成种子液。
将240g葡萄糖、150g玉米浆、6000g饮用水以及1.2g泡敌加入到10l发酵罐中，搅拌均匀后采用氢氧化钠溶液调节ph至4.6，将发酵罐中的夹套加热至121℃消毒20分钟，后冷却至28℃，形成发酵培养液，保持28℃的温度条件，将上述所述种子液与发酵罐培养基按各自所占发酵罐体积的10％：70％进行混合，同时以120r/min的速率进行搅拌，以5l/min的速率通入空气，保持压力0.05mpa，培养10～12小时至吸光度大于1.2×10，得到发酵液。
待上述发酵液吸光度达到1.2×10以上，无染菌，种子生长正常，ph为6.4～6.6后，控制物料温度28～32℃，滴加由50g乙基缩合物以及300ml乙醇(体积比，95％)组成的溶液，1～2小时滴加完毕。滴加完毕后，在温度为28～32℃条件下发酵反应72小时至原料转化完全，后针对发酵罐的夹套进行加热至物料温度70～72℃进行灭菌1小时，接着再降温至28～32℃，放料进行离心处理。离心后采用200ml无水乙醇对离心后固体物料进行萃取，重复两次，过滤，滤液合并，再在温度≤50℃，真空度≥0.08mpa的条件下，负压浓缩滤液至最小体积，0℃结晶，过滤、干燥，得到乙基羟化物。
本实施例得到的乙基羟化物45.1g，熔点88.5～91.5℃，hplc纯度99.80％。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本实施例中的种子液与发酵罐培养基按各自所占发酵罐体积的5％：40％进行混合，其他与实施例1相同。
本实施例得到的乙基羟化物45.5g，熔点88.8～91.7℃，hplc纯度99.81％。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本实施例中的种子液与发酵罐培养基按各自所占发酵罐体积的2％：50％进行混合，其他与实施例1相同。
本实施例得到的乙基羟化物41.4g，熔点88.6～91.5℃，hplc纯度99.78％。
对比例1
2000ml三角瓶中加入600ml经灭菌水，加入10g蔗糖，120g干面包酵母菌，用七层干净纱布扎口，于30℃恒温水浴中放置2小时，取样于计数板在显微镜下计数，菌数达8×1027/cm2以上时，完成活化；
称取缩合物50g，用300ml乙醇(95％)60℃下溶解，慢慢滴入发酵罐中，加毕，再加入山梨醇2ml。设定发酵罐温度为29℃，空气流量5l/min，发酵96小时后取样点板，当原料点完全消失，发酵转化结束。用离心机分离发酵菌丝，分别用200ml乙醇萃取菌丝2次，合并乙醇液，减压蒸馏至乙醇体积的一半，-5℃下结晶，过滤，烘干，得乙基羟化物。
本实施例得到的乙基羟化物38.3g，熔点85.6～90.5℃，hplc纯度95.78％
综上所述，实施例1的最高收率达90％，远远大于对比例的76.6％，而针对hplc纯度上，实施例1的纯度达到99％以上，至少为99.78％，远高于对比例的95.78％。虽然本发明在操作上比对比例的技术方案复杂，但由于其各个步骤中的工艺参数容易控制，便于规模化生产，整个制备过程中双羟化物小于1％，因此获得的乙基羟化物收率高，质量稳定。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。