鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用。

背景技术：

由稻瘟病菌(magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起水稻大幅度减产，严重时造成颗粒无收，严重影响着我国的粮食安全生产。历史实践证明，选育抗稻瘟病水稻品种是减轻稻瘟病危害的最有效解决方案。而由于稻瘟病的抗性鉴定较为繁琐，受年纪间影响较大，通过分子标记辅助进行抗稻瘟病品种的选择可以大大提高选择效率，不受外部自然环境的影响，是改良水稻稻瘟病抗性的最佳手段。

目前，已有24个抗稻瘟病基因被成功克隆，分布于水稻除第3号染色体的所有染色体上。pib基因于1996年被成功克隆，属于"nbs-lrr"类抗病基因，包含有4个内含子(164bp,810bp,1340bp,308bp)，全长cdna由306bp的5'非翻译区(utr,untranslatedregions)、3753bp的orf和229bp的3'非翻译区等组成。pib基因为水稻主效抗稻瘟病基因，被定为位于水稻第12染色体长臂近末端区域，存在抗感两种等位基因型，其功能性由单碱基核苷酸多态性决定。pib编码一个由1251个氨基酸组成的蛋白产物，该产物包含一个核苷酸结合位点(nucleotidebindingsite,nbs)和17个富亮氨酸重复序列(leucine-richrepeats,lrrs)，其中，氨基端的nbs区存在激酶1a,2和3a结构域单位，lrrs中部有8个成簇的半胱氨酸残基。由于pib基因的抗感等位基因型由单碱基核苷酸多态性决定，检测依赖于测序或多次pcr进行检测。目前，应用较广检测pib基因的抗感等位基因型的标记为刘洋等开发的2对检测标记pibdom和lys145,该检测体系需要两对引物共同检测确认pib基因的抗感等位基因型。

目前，稻瘟病的抗性鉴定可以通过表型和基因型两种形式进行鉴定，表型鉴定受年纪间影响较大，操作繁琐。基因型虽然鉴定准确、效率较高，但是目前pib基因的抗感等位基因型检测依赖于测序或多次pcr检测。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供的一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用，克服了表型鉴定受年纪间影响较大，操作繁琐的缺陷，也克服了目前pib基因的抗感等位基因型检测依赖于测序或多次pcr检测的缺陷。

本发明提供了一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记，所述分子标记为pib-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的pib-tpap-o-f、seqidno.2所示的pib-tpap-o-r、seqidno.3所示的pib-tpap-i-f和seqidno.4所示的pib-tpap-i-r。

本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定水稻稻瘟病抗性性状的方法，包括以下步骤：

s1，提取待测水稻材料的基因组dna；

s2，以s1获得的基因组dna为模板，以pib-tpap-o-f、pib-tpap-o-r、pib-tpap-i-f和pib-tpap-i-r为引物进行pcr扩增；

s3，结果判定

以pib-tpap-o-f与pib-tpap-o-r结合扩增出362bp片段作为阳性对照；当pib-tpap-i-f与pib-tpap-o-r结合扩增出194bp片段时，检测材料携带感病等位基因型c；当pib-tpap-o-f与pib-tpap-i-r结合扩增出227bp片段时，检测材料携带抗病等位基因型a。

优选的，上述鉴定水稻稻瘟病抗性性状的方法中，pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s-50s、35次循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。

本发明还提供了一种上述的分子标记在水稻稻瘟病抗性性状分子标记辅助选育中的应用。

本发明还提供了一种上述的鉴定水稻稻瘟病抗性性状的方法在水稻稻瘟病抗性性状分子标记辅助选育中的应用。

与现有技术相比，本发明提供一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用，具有以下有益效果：

本发明针对pib基因的功能性单碱基核苷酸a-c的多态性，基于四引物扩增受阻突变原理，开发了检测pib基因抗感等位基因型的功能性检测标记pib-tpap。

分子标记pib-tpap是从dna碱基的功能性多态性进行鉴定，发明人经过大量试验材料证实该分子标记可以对pib基因的水稻稻瘟病菌抗性的两种等位基因型进行直接鉴定，该分子标记基于pcr技术，无需测序或酶切，仅一次pcr即可准确鉴定抗感两种等位基因型，大大提高了该基因位点的检测效率，且准确率达100％，能够较好区分两种等位基因型，不受环境条件的影响，鉴定操作方法简单，耗费较低，而其他现有文献公开的引物分子标记只能达到50-70％的鉴定准确率；本发明的分子标记pib-tpap为pib基因等位基因型的鉴定及相应的分子标记辅助选择工作打下了坚实的基础，适合于大范围推广使用。

附图说明

图1为日本晴材料的pib基因；

图2为武运粳27号的pib基因；

图3为不同退火温度组进行pcr扩增结果；

其中，m泳道为dna标准分子量；1、3、5、7、9、11、13、15、17泳道分别为武运粳27号材料在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃退火温度下的扩增结果；2、3、4、5、10、12、14、16、18泳道分别为日本晴材料在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃退火温度下的扩增结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供的一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记，所述分子标记为pib-tpap，包括核苷酸序列如seqidno.1所示的pib-tpap-o-f、seqidno.2所示的pib-tpap-o-r、seqidno.3所示的pib-tpap-i-f和seqidno.4所示的pib-tpap-i-r。

具体按照以下方法获得：

参照masarumiyamoto等研究(masarumiyamoto；ikuoando；krystynarybka；osamukodama；shinjikawasakihighresolutionmappingoftheindica-derivedriceblastresistancegenes.i.pi-bmolecularplant-microbeinteractions,1996,9(1):6-13)，ncbi查找克隆序列[ab013448]，选用ncbi提供序列的8719处a-c的snp进行设计。对照品种为抗病品种“武运粳27号”，感病品种“日本晴”。利用在线引物设计软件primer1进行标记设计，命名为pib-tpap，pib-tpap包括核苷酸序列如seqidno.1所示的pib-tpap-o-f、seqidno.2所示的pib-tpap-o-r、seqidno.3所示的pib-tpap-i-f和seqidno.4所示的pib-tpap-i-r，其序列信息详见表1。

seqidno.5和图1均为为感病基因型日本晴的核苷酸序列。如图1所示，图1中snp差异位点用加黑斜体字母c表示，带下划线的字母表示引物结合位点，实线箭头表示引物扩增方向，虚线箭头表示不能有效扩增。

seqidno.6和图2均为抗病等位基因型武运粳27号的核苷酸序列。如图2所示，图2中snp差异位点用加黑斜体字母a表示，带下划线的字母表示引物结合位点，实线箭头表示引物扩增方向，虚线箭头表示不能有效扩增。

表1pib-tpap中各分子标记序列

实施例1

利用上述分子标记pib-tpap鉴定供试水稻材料的稻瘟病菌抗性性状，具体包括以下步骤：

供试材料为pib基因克隆试验中的对照材料水稻品种日本晴和水稻品种武运粳27号，其中日本晴携带稻瘟病感病等位基因型pib，武运粳27号携带稻瘟病抗病等位基因型pib。

s1，分别提取日本晴和武运粳27号两个材料的基因组dna，基因组dna提取采用全式金植物dna提取试剂盒进行(操作按照试剂盒说明)。

s2，以s1获得的基因组dna为模板，以pib-tpap-o-f、pib-tpap-o-r、pib-tpap-i-f和pib-tpap-i-r为引物进行pcr扩增。

pcr扩增反应体系为20μl：包括dna1μl(1ng/μl)；pib-tpap-o-f0.5μl、pib-tpap-o-r0.5μl、pib-tpap-i-f0.5μl、pib-tpap-i-r0.5μl；2×tappcrmastermix(带染料，康为世纪公司购买)10.0μl；ddh2o7.0μl。

其中pib-tpap-o-f、pib-tpap-o-r为外引物，pib-tpap-i-f和pib-tpap-i-r为内引物，上述引物的浓度均为4pmol/μl。

pcr扩增反的应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s、35次循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。反应产物在4％琼脂糖凝胶上100v电泳1h，经溴化乙锭(ethidiumbromide，eb)染色后并于凝胶成像系统下观察，记录结果。

s3，结果判定

以pib-tpap-o-f与pib-tpap-o-r结合扩增出362bp片段作为阳性对照；当pib-tpap-i-f与pib-tpap-o-r结合扩增出194bp片段时，检测材料携带感病等位基因型c；当pib-tpap-o-f与pib-tpap-i-r结合扩增出227bp片段时，检测材料携带抗病等位基因型a。

通过pib-tpap对2个对照材料的9个退火温度组进行pcr扩增，其中，pcr扩增的9个退火温度分别为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃，其余程序均参照实施例1的s2中记载的pcr扩增反应程序。不同退火温度组进行pcr扩增结果如图3所示，由图3可知，当退火温度为55℃时，电泳图中条带亮度区分明显，不存在假阳性现象。pib-tpap-o-f与pib-tpap-o-r结合扩增出362bp片段作为阳性对照；当检测材料为携带稻瘟病感病等位基因型的日本晴时，pib-tpap-i-f与pib-tpap-o-r结合扩增出194bp片段；当检测材料为携带稻瘟病抗病等位基因型武运粳27号时，pib-tpap-o-f与pib-tpap-i-r结合扩增出227bp片段。由于选取的对照材料为前人研究中该基因位点已测序材料，证实了pib-tpap的有效性及准确性。

实施例2

根据刘洋等人研究(刘洋。水稻抗稻瘟病pib基因的分子标记辅助选择与应用[d]。四川农业大学，2007。)，pib抗性等位基因对稻瘟病真菌生理小种zb13具有显著抗性。实施例2通过抗感等位基因型品种杂交产生的dh群体为试验材料，通过接种zb13稻瘟病真菌生理小种，对比基因型和表型，验证该发明的准确性及实用性。

dh群体为稻瘟病感病等位基因型水稻品种日本晴(父本)杂交稻瘟病抗病等位基因型水稻品种武运粳27号(母本)，由花药培养而获得的80个稳定品系，通过标记pib-tpap进行80个稳定品系的pib等位基因型鉴定，并与2013-2014年两年接种表型进行对比，结果如表2所示，2013和2014年结果相同，抗病等位基因型水稻品材料共计32份，接种结果均为r级(抗稻瘟病)；感病等位基因型水稻品种共计48个，接种结果均为s级(抗稻瘟病)。基因型鉴定结果与接种表型鉴定一致，证实了标记pib-tpap的准确性。

表2利用分子标记pib-tpap检测dh群体稻瘟病基因型及表型对比结果

注：标注字母r代表抗病，s代表感病。

实施例3利用分子标记pib-tpap进行ril群体后代的基因型检测

根据刘洋等人研究(刘洋.水稻抗稻瘟病pib基因的分子标记辅助选择与应用[d].四川农业大学，2007)，pib抗性等位基因对稻瘟病真菌生理小种zb13具有显著抗性。实施例3通过抗感等位基因型品种杂交产生的ril群体为试验材料，通过接种zb13稻瘟病真菌生理小种，对比基因型和表型，验证该发明的准确性及实用性。

ril群体为感病等位基因型品种越光(父本)杂交抗病等位基因型品种武运粳27号(母本)，由单粒传方法而获得的160个稳定品系，通过标记pib-tpap进行160个稳定品系的pib等位基因型鉴定，并与2013-2014年两年表型进行对比，结果如表3所示，结果如表2所示，2013和2014年结果相同，抗病等位基因型水稻品材料共计52份，接种结果均为r级(抗稻瘟病)；感病等位基因型水稻品种共计88个，接种结果均为s级(抗稻瘟病)。基因型鉴定结果与接种表型鉴定一致，证实了标记pib-tpap的准确性。

表3利用分子标记pib-tpap检测ril群体稻瘟病基因型及表型对比结果

注：标注字母r代表抗病，s代表感病。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120>鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cacgacgttgctatggaattccttgggg28

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcctcccaggcagtctcataatcagcgc28

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttgaggaaggaacaatgcccaaacttgggc30

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttttctattcgcccttggacctgcagtct29

<210>5

<211>480

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tggatcaaggagctccagcatctcgtgaagttaaaactagtgagtactaggctattggag60

cacgacgttgctatggaattccttggggaactaccgaaggtggaaattctagttatttca120

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<210>6

<211>480

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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