一种磺胺嘧啶半抗原改造及其应用的制作方法

本发明涉及一种半抗原及其制备方法和应用，具体涉及磺胺嘧啶药物半抗原及其制备方法和应用。

背景技术：

磺胺嘧啶，其性质稳定、较强抗菌活性、对革兰氏菌产生抑制作用，价格低廉、易生产、易获得，因而在畜牧业上被广泛应用。磺胺嘧啶药物在生物体内易吸收、代谢时间长、易残留，因而更易在生物体内积累。长期滥用磺胺嘧啶药物，最终导致过敏性反应、肝肾损伤、磺胺嘧啶药抗药性、细菌耐药性感染、甚至具有致癌性。

目前，检测磺胺嘧啶主要经微生物法、高效液相色谱、气相色谱-质谱、高效液相色谱-串联质谱等，微生物法检测速度慢，并且对磺胺药缺乏灵敏性和特异性，液相、气相、质谱等方法则存在前处理繁琐，需要专业人员操作、需要昂贵仪器等缺陷，进样单一检测数度慢，在大规模检测中并不适用。本发明磺胺嘧啶经改造后，用于免疫动物产生特异性抗体，采用抗原抗体免疫反应法，能够实现方便、快捷，而且对人员培训要求低等特点。

技术实现要素：

本发明提供一种磺胺嘧啶抗体制备的关键物质半抗原的合成方法，该方法具有工艺简单，反应率高的特点，收率可达89.55%；最大限度保留了磺胺嘧啶的化学结构，提高了半抗原的特异性。

本发明是提供一种用于检测磺胺嘧啶残留的半抗原制备的技术方法，分子结构式为式ⅰ：

（式ⅰ）。

反应合成的抗原的分子结构式为式ⅱ：

（式ⅱ）。

反应合成的半抗原的合成方法包括以下步骤：

取1.0g对乙酰氨基苯磺酰氯，加吡啶50ml溶解，加2-(2-氨基-5-嘧啶)苯甲醛0.85g，充分搅拌溶解，100℃搅拌4h，停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去吡啶，加二氯甲烷/乙醇（v/v,5/1）40ml重结晶，得到磺酰嘧啶1.5g，收率88.75%

取磺酰嘧啶1.5g，加2mol/lkoh水溶液80ml溶解，90℃搅拌3h，停止反应，冷却到室温，加6mol/l盐酸调节ph值到7，加乙酸乙酯萃取100ml×3,萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/正己烷（v/v,1/1）洗脱分离，得到苯甲醛-磺胺嘧啶半抗原1.2g，收率89.55%。

磺胺嘧啶反应合成的半抗原的合成路线如下：

本发明还提供一种磺胺嘧啶抗原的制备方法。

1）称取适量磺胺嘧啶半抗原25mg溶解于dmf溶液中，加入edc和nhs水溶液，进行活化30min，得到溶液i；

2）将载体蛋白溶于水溶液中，得到溶液ⅱ；将溶液i加入到溶液ⅱ中，常温搅拌24h进行偶联，得到溶液ⅲ；

3）用0.01mol/lpb透析溶液ⅲ3d，每天更换3次透析袋，-20℃保存。

综上所述，本发明提供了一种磺胺嘧啶改造方法，涉及工艺简单、易操作、回收率高等优点。经过柱净化浓缩以该半抗原为基础，可与载体蛋白偶联，用于免疫小鼠制备抗体，并以抗原抗体为基础开发胶体金试纸条检测产品。

本发明提供一种磺胺嘧啶半抗原的应用方案，由磺胺嘧啶半抗原为基础制备试纸条。

本发明的试纸条由微孔试剂和试纸条两部分构成，所述试纸条由pvc板、吸水垫、反应膜、吸收垫、保护膜五部分构成。

所述吸收垫，反应膜，吸水垫和保护膜按顺序粘贴在pvc板上，反应膜上固定检测区(t)和质控区(c)。检测区包被有磺胺嘧啶半抗原-牛血清白蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠igg。

附图说明

图1半抗原结构图式i。

图2抗原结构图式ⅱ。

图3半抗原合成技术路线。

图4试纸条剖面结构示意图。

图5试纸条结果判定。

具体实施方式

实施例1磺胺嘧啶抗原的制备

1、半抗原合成

取1.0g对乙酰氨基苯磺酰氯，加吡啶50ml溶解，加2-(2-氨基-5-嘧啶)苯甲醛0.85g，充分搅拌溶解，100℃搅拌4h，停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去吡啶，加二氯甲烷/乙醇（v/v,5/1）40ml重结晶，得到磺酰嘧啶1.5g，收率88.75%

取磺酰嘧啶1.5g，加2mol/lkoh水溶液80ml溶解，90℃搅拌3h，停止反应，冷却到室温，加6mol/l盐酸调节ph值到7，加乙酸乙酯萃取100ml×3,萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/正己烷（v/v,1/1）洗脱分离，得到苯甲醛-磺胺嘧啶半抗原1.2g，收率89.55%。

2、抗原的制备及鉴定

(1)抗原的合成

称取25mg磺胺嘧啶半抗原溶解于dmf中，加入edc和nhs活化30min，加入到bsa水溶液中，调溶液ph7.2-7.6，常温搅拌24h；用0.01mol/lpb透析3d，每天更换3次透析袋，-20℃保存。

(2)抗原的鉴定

将载体蛋白、磺胺嘧啶半抗原、磺胺嘧啶半抗原-载体蛋白偶联物用ph7.4的pb配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/lph7.4的pb调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描。得到载体蛋白、磺胺嘧啶半抗原、磺胺嘧啶半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。结果显示三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺嘧啶半抗原与载体蛋白偶联成功，分子结构式如式ⅱ所示：

（式ⅱ）。

实施例2构建检测试纸条

1、试纸条（图4）

吸收垫1，反应膜2，吸水垫3和保护膜7按顺序粘贴在pvc板6上，吸收垫末端与反应膜相连，反应膜末端与吸水垫相连，吸收垫始端与pvc板对齐，吸水垫末端与pvc板对齐，保护膜7覆盖吸收垫上，反应膜上固定(t)区4和(c)区5。检测区4包被有磺胺嘧啶半抗原-牛血清白蛋白偶联物，质控区5包被有羊抗鼠igg。

2、微孔试剂

微孔试剂含冻干磺胺嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物，包被量为0.2-0.5cm³/孔。

3、单克隆抗体

(1)动物免疫

将免疫原注入balb/c小鼠体内，剂量为50μg/只，使其产生多克隆抗体。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫balb/c小鼠脾细胞，按6∶1比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并意外发现，其中一株效价显著高于其它杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将磺胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

将balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油，剂量为0.4ml/只，7天后腹腔注射磺胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁵个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境中保存。

4、羊抗鼠igg

以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

5、磺胺嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置磁力加热搅拌煮沸，每100ml0.01％的氯金酸加入1ml2％的柠檬酸三钠，继续煮沸，液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。

(2)磺胺嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.1mk2co3调胶体金的ph值至7.8，按1-1.5μg/ml抗体胶体金加入磺胺嘧啶单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％bsa至终浓度为0.5％-1%，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃去上清液，用初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用，保存60d。

6、吸收垫

将吸收垫放入磷酸盐缓冲液浸湿30s，37℃烘2h备用；

7、检测区和质控区

将硝酸纤维素膜上分别包被磺胺嘧啶-载体蛋白偶联物构成测试区和羊抗鼠igg构成质控区，再用含0.5％的酪蛋白的封闭液进行封闭。

用含0.5％的蔗糖0.9%nacl缓冲液将磺胺嘧啶-牛血清白蛋白偶联物稀释至5μg/ml，用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为测试区，参数为1.5μg/cm，测试区靠近金标垫端，距金标垫端约8mm；用含0.5％的蔗糖0.9%nacl缓冲液将羊抗鼠igg稀释到1μg/ml，用点膜仪将其包被于纤维素膜作为质控区，参数为1.5μg/cm，质控区靠近吸水垫，距吸水垫约8mm，两线距离5-8mm。37℃烘干，封装。

实施例3牛奶中磺胺嘧啶的检测

1、检测方法

本发明检测时，将待测样本稀释液滴入微孔，将试纸条插入微孔中，当磺胺嘧啶在样本中浓度<50ng/ml时，单克隆抗体-胶体金标记物与层析膜上固定的磺胺嘧啶半抗原-载体蛋白偶联抗原和羊抗鼠igg结合，在(t)区和(c)区内各出现一条红色条带。如果磺胺嘧啶在样本中浓度>50ng/ml时，单克隆抗体-胶体金标记物与样本中的磺胺嘧啶全部结合，在(t)区不与磺胺嘧啶半抗原-载体蛋白偶联抗原结合而不显色。阴性样本在(t)区与(c)区出现红色条带。如图5所示。

阳性：(c)区显红色条带，(t)区不显色，判为阳性，表示磺胺嘧啶含量超过50ng/ml，用“+”表示。

阴性：(c)区显红色条带，(t)区显红色条带，(t)区颜色接近或浅于(c)区时，判为阴性，表示磺胺嘧啶含量小于50ng/ml，用“-”表示。

无效：(c)区不显色，该试纸条判读无效。

2、检测示例

用滴管向试剂微孔内滴加2-3滴样本，将试纸条插入微孔中5-8min后观察结果。超过10min，则样本检测判读结果无效。

取已知磺胺嘧啶含量大于50ng/ml阳性牛奶样本20份和磺胺嘧啶含量小于50ng/ml的阴性样本，用3批次生产的试纸条进行检测，结果见表1。

表1检测样本结果

结果表明：用3个批次生产试纸条检测牛奶样本时，磺胺嘧啶阳性符合率为100%，假阴性率为0。