谷氨酰胺合成酶基因以及应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种新的谷氨酰胺合成酶基因，以及该谷氨酰胺合成酶基因在真核表达载体构建中的应用。
背景技术：
：根据目的蛋白表达的时间差异以及表达过程是否需要添加筛选压力，可将表达系统分为瞬时表达系统和稳定表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入含有外源基因的表达载体后不添加筛选压力，收集细胞产生的蛋白，转染后的细胞随着分裂而逐渐丢失目的蛋白，不能持续长久的进行蛋白生产。稳定表达系统是指表达载体进入宿主细胞并经筛选压力选择培养，挑选筛选后的细胞进行蛋白生产，目的基因整合进细胞基因组，并随着细胞分裂，目的基因仍能稳定存在，可以持续长久地提供目的蛋白。由于稳定表达需经过压力选择甚至基因扩增等步骤，需要较长的时间且需要消耗相对多的人力。近年，伴随着哺乳动物细胞培养技术的发展，提高了单克隆抗体以及其他重组蛋白的表达量。稳定细胞系的构建是重组抗体产业化制备的第一步。作为抗体产业上游关键技术，如何快速、高效建立生产细胞系，是抗体产业发展中的关键问题。外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲，表达系统中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和扩增基因表达单元。扩增基因往往亦为选择标记。二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，dhfr)基因扩增系统和谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，gs)扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。dhfr系统是将目的基因和dhfr基因同时或分别转染细胞后加入氨甲喋呤(methotrexate，mtx)加压扩增。gs系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。细胞转染gs基因及目的基因后，谷氨酰胺合成酶利用细胞内的氨和谷氨酰胺，在缺乏外源谷氨酰胺的培养条件下，加入甲硫氨酸砜亚胺(methioninesulphoximine,msx)进行扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。与dhfr系统相比，gs系统不需要进行繁琐的加压过程便可以得到高水平的表达量。然而，现有的gs系统仍然存在表达效率不能满足生产要求以及高表达细胞株难以筛选的问题。技术实现要素：在一方面，本发明提供了一种新的谷氨酰胺合成酶基因(本文中也称作gs16034基因)，其具有如seqidno：8所示的核苷酸序列。另一方面，本发明提供了一种真核表达载体，其含有所述谷氨酰胺合成酶基因。在一个实施方案中，所述真核表达载体是通过将初始载体pcdna3.1(+)位点2136-2931bp间序列替换为所述谷氨酰胺合成酶基因而得到。在另一实施方案中，所述真核表达载体是通过以下步骤制备：1)将初始载体pcdna3.1(+)位点2136-2931bp间序列替换为mgs基因以获得中间载体pcdna3.1-mgs，其中所述mgs基因具有如seqidno.7所示的核苷酸序列；2)将初始载体pcdna3.1(+)位点232-819bp间序列克隆进所述中间载体pcdna3.1-mgs的1252-1253bp位点之间，以获得载体pcdna3.1-mgs-dgv；以及3)将所述载体pcdna3.1-mgs-dgv上mgs基因替换为所述谷氨酰胺合成酶基因。另一方面，本发明提供了一种在宿主细胞中表达目的蛋白的方法，其包括将所述目的蛋白的编码基因和所述谷氨酰胺合成酶基因可操作地置于同一真核表达载体中并将所述真核表达载体导入所述宿主细胞。这里所用的术语“可操作地”指所述目的蛋白的编码基因和所述所述谷氨酰胺合成酶基因分别位于所述真核表达载体中的适当位置，可以利用所述真核表达载体内存在的表达元件(例如启动子、增强子、终止子等)使得自身序列能够在宿主细胞中得到表达，即产生相应的蛋白。所述方法还可包括在缺乏外源谷氨酰胺并存在甲硫氨酸砜亚胺的条件下培养所述宿主细胞，以便让所述目的蛋白的编码基因在所述宿主细胞中得到扩增。优选地，所述宿主细胞为chok1细胞。在一些实施方案中，所述目的蛋白为抗体，所述目的蛋白的编码基因包括所述抗体的重链编码基因和轻链编码基因。与现有的谷氨酰胺合成酶基因相比，含有本发明提供的谷氨酰胺合成酶基因的真核表达载体可以明显改善目的基因在宿主细胞中的表达，有助于对高表达细胞株的筛选。附图说明图1显示分别表达抗体mab01、mab02、和mab03时，载体pcdna3.1-mgs-dgv和pcdna3.1-gs16034-dgv所筛选到的pool中，表达水平在20mg/l以上的pool的数量。图2显示载体pcdna3.1-mgs-dgv-mab01和pcdna3.1-gs16034-dgv-mab01经相同的转染方法、转染规模、相同的筛选流程处理后，经batchculture评估，表达最高的三个pool的累积表达水平。图3显示载体pcdna3.1-mgs-dgv-mab02和pcdna3.1-gs16034-dgv-mab02经相同的转染方法、转染规模、相同的筛选流程处理后，经batchculture评估，表达最高的三个pool的累积表达水平。图4显示载体pcdna3.1-mgs-dgv-mab03和pcdna3.1-gs16034-dgv-mab03经相同的转染方法、转染规模、相同的筛选流程处理后，经batchculture评估后，表达最高的三个pool的累积表达水平。具体实施方式下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施实例中所使用到的耗材，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。所述初始载体pcdna3.1(+)购买自thermofisherscientific，其核苷酸序列参见seqidno：9。chok1细胞系购自atcc，产品号ccl-61。经过驯化后，培养基成分为cdcho+6mml-glutamine，培养基皆购自于thermofisher公司。mgs基因为现有gs扩增系统中常用的谷氨酰胺合成酶基因，其序列显示在seqidno：7中。对于含谷氨酰胺合成酶基因的真核表达载体，gs基因是影响载体表达能力的关键因素之一，同时，高表达克隆的筛选也依靠对高表达pool(细胞池)的筛选。以下通过含有本发明谷氨酰胺合成酶基因的真核表达载体对三个目标抗体mab01、mab02、mab03的表达来进一步说明本发明。实施例1.重组表达载体构建抗体mab01的轻链核苷酸序列如seqidno：1所示，重链核苷酸序列如seqidno：2所示。抗体为mab02的轻链核苷酸序列如seqidno：3所示，重链核苷酸序列如seqidno：4所示。抗体mab03的轻链核苷酸序列如seqidno：5所示，重链核苷酸序列如seqidno：6所示。可以通过以下步骤构建包含gs16034基因和目标抗体序列的真核表达载体：(1)将初始载体pcdna3.1(+)位点2136-2931bp间序列替换为mgs获得中间载体pcdna3.1-mgs，再将初始载体pcdna3.1(+)位点232-819bp间序列克隆进中间载体pcdna3.1-mgs的1252-1253bp位点之间，获得新的载体pcdna3.1-mgs-dgv，将载体pcdna3.1-mgs-dgv上mgs基因替换为gs16034基因，从而获得载体pcdna3.1-gs16034-dgv，在895-1010位点之间插入目标抗体轻链序列mab-lc，在1916-2031位点之间插入目标抗体重链序列mab-hc，从而获得含gs16034基因和目标抗体序列的表达载体。具体地，可以利用gibson方法完成各个表达载体全长序列的组装。例如，对于pcdna3.1-gs16034-dgv-mab01的组装，可以将完整载体序列分为片段a/b/c/d/e/f/g/h等8个片段。8个片段的基因序列分别参见seqidno:10-17。利用引物a1:a2(序列见seqidno：18和19)扩增片段a；利用引物b1:b2(序列见seqidno：20和21)扩增片段b；利用引物c1:c2(序列见seqidno：22和23)扩增片段c；利用引物d1:d2(序列见seqidno：24和25)扩增片段d；利用引物e1:e2(序列见seqidno：26和27)扩增片段e；利用引物f1:f2(序列见seqidno：28和29)扩增片段f；利用引物g1:g2(序列见seqidno：30和31)扩增片段g；利用引物h1:h2(序列见seqidno：32和33)扩增片段h。pcr反应体系为10xpbobuffer5μl,10mmdntps1μl、上游引物(25μm)1μl、下游引物(25μm)1μl、模板dna0.5μl、pbopolymerase1μl、无菌水至50μl。pcr反应程序为：95℃预变性5min；25个循环(95℃变性30s,60℃退火90s,72℃延伸1kb/30sec)；最后72℃延伸反应10min。通过胶回收pcr产物，利用gibson组装的方法，完成载体的组装。gibson反应体系为：a20ng、b20ng、c20ng、d20ng、e20ng、f20ng、g20ng、h20ng、gibsonmix15μl，加水至20μl。反应程序为：50℃1小时。将gibson反应液中取出10μl转化大肠杆菌感受态细胞db3.1，挑取菌落进行利用pcr进行鉴定。利用引物jj-ea-f和jj-ea-r(见seqidno：34和35)进行ea接头的pcr鉴定；利用引物jj-bc-f和jj-bc-r(见seqidno：36和37)进行bc接头的pcr鉴定；利用引物jj-cd-f和jj-cd-r(见seqidno：38和39)进行cd接头的pcr鉴定。pcr反应体系为：10xpfubuffer5μl,10mmdntps0.5μl、上游引物(25μm)0.3μl、下游引物(25μm)0.3μl、模板dna0.15μl、pbopolymerase0.25μl、无菌水至50μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min；25个循环(95℃变性20s,60℃退火25s,72℃延伸30s)；最后72℃延伸反应3min。利用下面的测序引物对获得的表达载体进行全序列测序鉴定。引物序列seq-1gtgtacggtgggaggtctatataagcaseq-2gccaaggtgcagtggaaggtggacaacgseq-3gagttccgcgttacataacttacgseq-4gctggtcctgcatcatcctgtseq-5gacggctcattcttcctgtacseq-6gtggtggttacgcgcagcgtgaseq-7gccgatttcggcctattggttaseq-8gagcctaagtgcgtggaagaacseq-9gccacaccaacttctccaccaaseq-10gcatttttttcactgcattctaseq-11gcgctctcctgttccgaccctseq-12gcttaatcagtgaggcacctatseq-13gtcaatacgggataataccgcgseq-14gcttgaccgacaattgcatgaagaaseq-15gtgtacggtgggaggtctatataagca类似地，对于表达载体pcdna3.1-mgs-dgv-mab01、pcdna3.1-mgs-dgv-mab02、pcdna3.1-gs16034-dgv-mab02、pcdna3.1-mgs-dgv-mab03和pcdna3.1-gs16034-dgv-mab03，皆采用上述gibson组装的方法获得完整载体。2.重组质粒转染chok1细胞chok1细胞用含有6mml-glutamine的cdcho培养基进行培养，转染前将细胞按3-6x105细胞/ml进行接种，24小时后，对于下述质粒pcdna3.1-mgs-dgv-mab01、pcdna3.1-mgs-dgv-mab02、pcdna3.1-mgs-dgv-mab03、pcdna3.1-gs16034-dgv-mab01、pcdna3.1-gs16034-dgv-mab02以及pcdna3.1-gs16034-dgv-mab03，分别吸取40μg质粒和准备107细胞用于转染。利用bio-rad电转仪完成电转进行转染。3.定量elisa检测细胞培养上清中的的抗体表达将转染后细胞经msx压力筛选2周后，吸取细胞悬液经离心去除细胞沉淀后收集上清进行elisa定量。同时，对各个载体所获得的高表达pool进行批培养以评估pool的累积表达能力。对累积表达水平的评估有利于对pool的表达潜力以及表达稳定性做初步的判断。具体地，以96孔板内包被羊抗人单抗来捕获上清中的抗体，再加入hrp标记的羊抗人iggκ，加入底物tmb催化反应。读取450nm/650nm波长的吸光值。在该实验中，设置的标准品浓度范围为0-200ng/ml,将样品进行稀释后进行elisa定量检测。根据定量结果，分析pcdna3.1-mgs-dgv和pcdna3.1-gs16034-dgv表达载体在表达mab01、mab02、mab03时分别获得的表达水平≥20mg/l的高表达pool的数量，如图1所示。同时比较pcdna3.1-mgs-dgv和pcdna3.1-gs16034-dgv表达载体在表达mab01、mab02、mab03时分别获得的累积水平最高的3个pool，如图2-4所示。对于mab01、mab02、mab03的表达，在相同的筛选体系下，相对于含mgs基因的载体，含gs16034基因的表达载体所获得的高表达pool数量有明显提升，分别增加了38％、30％以及110％(如图1所示)。在对这些高表达pool进行累积表达水平评估后，含gs16034基因的载体所获得的高表达pool也显示出更高的表达水平(如图2-4所示)，其中top3的平均表达水平分别提高了25.88％、42.88％以及87.20％。综上，含gs16034基因的表达载体体现出来以下的优势，(1)提高了高表达pool的比例；(2)提高了pool的表达水平。利用该载体，可以筛选到更多更高表达水平的pool，从而提高筛选高表达细胞系的效率，更易筛选到高表达的单克隆细胞。同时，pool的表达水平体现了其中单克隆细胞的表达水平，故筛选到的单克隆表达水平也会有较大的提升。更多高表达pool的获得，可以选择更多pool进行单克隆筛选，从而提升单克隆在质量方面的多样性。本发明所属领域技术员应理解，以上描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。相关序列seqidno：1mab01的轻链atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggctaccgccaccggcgtgcactccgagattgtgctgacccagtctcccggcaccctgtctctgagtcctggcgagagagccaccctgtcctgcagagcctctcagtccgtgggctcctcttacctggcctgtcagcagaagcccggccaggctccccggctgctgatctacggcgccttttctagagccaccggcatccccgaccggttctccggatctggctctggcaccgacttcaccctgaccatctctcggctggaacccgaggacttcgccgtgtactactgccagcagtacggctcctccccctggacctttggccagggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctctaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctgaseqidno：2mab01的重链atgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggctaccgccaccggcgtgcactctcaggtgcagctggtggaatctggcggcggagtggtgcagcctggcagatccctgagactgtcttgtgccgcctccggcttcaccttctccagctacaccatgcactggcgacaggcccctggcaagggactggaatgggtcaccttcatctcttacgacggcaacaacaagtactacgccgactccgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaactccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccatctactactgtgctagaaccggctggctgggccccttcgattattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcctctgcttctaccaagggcccctccgtgttccctctggccccttccagcaagtctacctctggcggcacagccgctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcttggaactctggcgccctgaccagcggagtgcacacctttccagcagtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgactgtgccctccagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccctgaactgctgggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcctaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactataagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggcaaatgaseqidno：3mab02的轻链atggatatcgtgatgacccagacccccctgtccctgcctgtgacacctggcgagcctgccatctcctgccggtcctctaagtccctgctgcactccaacggcatcacctacctgtactggtatctgcagaagcccggccagtccccccagctgctgatctaccagatgtccaacctggtgtccggcgtgcccgacagattctccggctctggctctggcaccgacttcaccctgaagatctcccgggtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgcgcccagaacctggaactgccctacacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccaggaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctgaseqidno：4mab02的重链atgcaggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtgaagaaacccggctcctccgtgaagtcctgcaaggcttccggctacgccttctcctactcctggatcaactgggtgcgacaggcccctggacagggcctggaatggatgggcagaatcttccctggcgacggcgacaccgactacaacggcaagttcaagggcagagtgaccatcaccgccgacaagtccacctccaccgcctacatggaactgtcctccctgcggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgcccggaacgtgttcgacggctactggctggtgtattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcctctgcttctaccaagggcccctccgtgttccctctggccccttccagcaagtctacctctggcggcacagccgctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcttggaactctggcgccctgaccagcggagtgcacacctttccagctgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgactgtgccctccagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccctgaactgctgggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcattcttcct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