核苷衍生物或其盐、多核苷酸合成试剂、多核苷酸的制备方法、多核苷酸以及结合核酸分子的制备方法与流程

本发明涉及核苷衍生物或其盐、多核苷酸合成试剂、多核苷酸的制备方法、多核苷酸以及结合核酸分子的制备方法。

背景技术：

为了分析样本中的靶标，使用与靶标结合的结合分子。除抗体外，与靶标结合的结合核酸分子如适配体也用作与靶标结合的结合分子(专利文献1)。

作为获得结合核酸分子的方法，selex(通过指数富集方法的配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichmentmethod))是已知的，其中使靶标与大量候选多核苷酸接触，然后从所述候选多核苷酸中选择与所述靶标结合的多核苷酸作为结合核酸分子。当通过selex方法获得结合核酸分子时，除了构成所述结合核酸分子的天然核苷分子之外，还使用通过修饰天然核苷分子获得的经修饰的核苷分子。

然而，利用已知的天然核苷及其衍生物，还存在不能获得对其具有足够结合能力的结合核酸分子的靶标。因此，需要可用于例如制备适配体的经修饰的核苷衍生物。

引用列表

专利文献

专利文献1：jp2012-200204a

技术实现要素：

技术问题

因此，本发明旨在提供新的核苷衍生物或其盐、多核苷酸合成试剂、多核苷酸的制备方法、多核苷酸以及结合核酸分子的制备方法。

问题的解决方案

本发明的核苷衍生物或其盐由以下化学式(1)表示。

化学式(1)中，su是在核苷残基处具有糖骨架的原子团或在核苷酸残基处具有磷酸糖骨架的原子团，并且可以具有或不具有保护基，l¹和l²各自独立地为具有2-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃基，x¹为亚氨基(-nr¹-)、醚基(-o-)或硫醚基(-s-)，且r¹是氢原子或具有2-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃基。

本发明的多核苷酸合成试剂包含含有本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐。

本发明的多核苷酸的制备方法包括使用含有本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐合成多核苷酸的步骤。

本发明的多核苷酸包含作为结构单元的含有本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐。

本发明的结合核酸分子的制备方法包括使候选多核苷酸和靶标彼此接触，并选择与所述靶标结合的候选多核苷酸作为与所述靶标结合的结合核酸分子的步骤，所述候选多核苷酸是本发明的多核苷酸。

发明的有益效果

本发明可提供新的核苷衍生物或其盐。

附图说明

[图1]图1a和1b是说明实施例2中α-淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶的结合能力的图。

[图2]图2a和2b是说明实施例2中分泌型免疫球蛋白a(siga)结合核酸分子与siga的结合能力的图。

[图3]图3是说明实施例2中淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶的结合能力的图。

[图4]图4是说明实施例2中分泌型免疫球蛋白a(siga)结合核酸分子与siga的结合能力的图。

[图5]图5是说明实施例2中毛细管电泳结果的图。

[图6]图6显示了说明比较例中结合核酸分子与淀粉酶的结合能力的图。

实施方案的描述

(核苷衍生物或其盐)

如上所述，本发明的核苷衍生物或其盐由下列化学式(1)表示。

在化学式(1)中，su是在核苷残基处具有糖骨架的原子团或在核苷酸残基处具有磷酸糖骨架的原子团，并且可以具有或不具有保护基，l¹和l²各自独立地为具有2-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃基，x¹为亚氨基(-nr¹-)、醚基(-o-)或硫醚基(-s-)，且r¹是氢原子或具有2-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃基。

本发明的核苷衍生物具有嘌呤环状结构和嘧啶环状结构中的两种结构。因此，与具有一个嘌呤环状结构或一个嘧啶环状结构的核苷衍生物相比，本发明的核苷衍生物具有例如相对较大数量的能够在分子内或分子间相互作用的原子。因此，例如，与具有一个嘌呤环状结构或一个嘧啶环状结构的核苷衍生物相比，包括本发明的核苷衍生物的结合核酸分子对靶标具有改善的结合能力。因此，用本发明的核苷衍生物，可以制备例如对靶标表现出优异结合能力的结合核酸分子。

在化学式(1)中，l¹和l²各自独立地为具有2-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烃基。l¹的碳原子数的下限为2，其上限为10，优选为8或6，并且其范围为例如2-8、2-6。l¹的碳原子数优选为2。l²的碳原子数的下限为2，其上限为10，优选为8或6，并且其范围为例如2-8、2-6。l²的碳原子数优选为2。l¹和l²的具体实例包括亚乙基(-ch2-ch2-)、亚乙烯基(-ch＝ch-)、亚丙基(-ch2-ch2-ch2-)、异亚丙基(-ch2-ch(ch3)-)、亚丁基(-ch2-ch2-ch2-ch2-)、甲基亚丁基(-ch2-ch(ch3)-ch2-ch2-)、二甲基亚丁基(-ch2-ch(ch3)-ch(ch3)-ch2-)、乙基亚丁基(-ch2-ch(c2h5)-ch2-ch2-)、亚戊基(-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-)、亚己基(-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-)、亚庚基(-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-)和亚辛基(-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-)。l¹优选为亚乙烯基(-ch＝ch-)。l²优选为亚乙基(-ch2-ch2-)。l¹和l²可以是相同的烃基或不同的烃基。作为后者的具体实例，l¹优选为亚乙烯基(-ch＝ch-)，且l²优选为亚乙基(-ch2-ch2-)。

在化学式(1)中，x¹是亚氨基(-nr¹-)、醚基(-o-)或硫醚基(-s-)。在所述亚氨基中，r¹是氢原子或具有2-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃基，并且优选为氢原子。l¹和l²的描述可以通过引用并入到具有2-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃基的描述中。x¹优选为亚氨基(-nr¹-)。x¹更优选为nh基。

在化学式(1)中，在核苷残基处具有糖骨架的原子团没有特别限制，并且其实例包括在已知天然或人工核苷残基上具有糖骨架的原子团。在天然核苷残基处具有糖骨架的原子团的实例包括在核糖核苷残基处具有核糖骨架的原子团和在脱氧核糖核苷上具有脱氧核糖骨架的原子团。在人工核苷残基处具有糖骨架的原子团可以是，例如，在人工核苷残基处具有双环糖骨架的原子团，并且其具体实例可以是具有核糖骨架的原子团，其中ena(2'-o，4'-c-亚乙基桥连的核酸)或lna(锁定核酸)的2'位的氧原子和4'位的碳原子被交联。在核苷酸残基上具有磷酸糖骨架的原子团没有特别限制，其实例包括在已知天然或人工核苷酸残基处具有磷酸糖骨架的原子团。在天然核苷酸残基上具有磷酸糖骨架的原子团的实例包括在核糖核苷酸残基处具有磷酸核糖骨架的原子团和在脱氧核糖核苷酸上具有磷酸脱氧核糖骨架的原子团。在人工核苷酸残基上具有磷酸糖骨架的原子团可以是，例如，在人工核苷残基处具有磷酸双环糖骨架的原子团，其具体实例可以是具有磷酸核糖骨架的原子团，其中2'-o，4'-c-亚乙基桥连的核酸(ena)或锁定核酸(lna)的2'位的氧原子和4'位的碳原子被交联。

在化学式(1)中，在核苷残基处具有糖骨架的原子团或在核苷酸残基处具有磷酸糖骨架的原子团优选由下列化学式(2)表示。

在化学式(2)中，r²是氢原子、保护基团或由下列化学式(3)表示的基团，r³是氢原子、保护基团或亚磷酰胺基团，r⁴是氢原子、氟原子、羟基、氨基或巯基。

在化学式(3)中，y是氧原子或硫原子，z是羟基或咪唑基，且m是1-10的整数。

在化学式(2)中，r²是氢原子、保护基团或由以下化学式(3)表示的基团。所述保护基团没有特别限制并且可以是，例如，核酸合成方法中使用的已知羟基的保护基团，并且作为具体实例，保护基团可以是dmtr基团(4，4'-二甲氧基(三苯基甲基)基团)。当r²是由化学式(3)表示的基团时，本发明的核苷衍生物也可以称为例如核苷酸衍生物。

在化学式(2)中，r³是氢原子、保护基团或亚磷酰胺基团。保护基团没有特别限制，例如，r²的描述可以通过引用并入到所述保护基团的描述中。亚磷酰胺基团由化学式(5)表示。当r³是亚磷酰胺基团时，本发明的核苷衍生物也可以称为例如核苷衍生物的亚磷酰胺化合物。当r²是由化学式(3)表示的基团并且r³是亚磷酰胺基团时，本发明的核苷衍生物也可以称为例如核苷酸衍生物的亚磷酰胺化合物。

在化学式(2)中，r⁴是氢原子、氟原子、羟基、氨基或巯基，并且优选为氢原子或羟基。当r⁴是氢原子时，本发明的核苷衍生物具有脱氧核糖骨架作为糖骨架，并且可以用于例如dna的合成。当r⁴是羟基时，本发明的核苷衍生物具有核糖骨架作为糖骨架，并且可以用于例如rna的合成。

在化学式(3)中，y是氧原子或硫原子。当y是氧原子时，包括作为结构单元的本发明的核苷衍生物的多核苷酸也可以称为具有磷酸二酯键的多核苷酸。当y是硫原子时，包括作为结构单元的本发明的核苷衍生物的多核苷酸也可以称为具有硫代磷酸酯键的多核苷酸。

在化学式(3)中，z是羟基或咪唑基。在咪唑基中，咪唑例如通过1-位的氮原子与磷酸原子结合。

在化学式(3)中，m是1-10的整数，优选1-3、1-2或1。

本发明的核苷衍生物优选由下列化学式(4)表示。由下式(4)表示的核苷衍生物也称为ia8。

本发明的核苷衍生物或其盐可以是立体异构体，诸如其对映异构体、互变异构体、几何异构体、构象异构体和旋光异构体，及其盐。具体地，在化学式(1)和下面描述的化学式中，糖骨架是d体，但是本发明的核苷衍生物不限于此，糖骨架可以是l体。

本发明的核苷衍生物的盐可以是酸加成盐或碱加成盐。进一步地，形成酸加成盐的酸可以是无机酸或有机酸，形成碱加成盐的碱可以是无机碱或有机碱。所述无机酸没有特别限制，其实例包括硫酸、磷酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氟酸、次氯酸、次溴酸、次碘酸、亚氟酸、亚氯酸、亚溴酸、亚碘酸、氟酸、氯酸、溴酸、碘酸、全氟酸、高氯酸、高溴酸和高碘酸。所述有机酸没有特别限制，其实例包括对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸。无机碱没有特别限制，并且其实例包括氢氧化铵、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。其更具体的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙和碳酸钙。所述有机碱没有特别限制，并且其实例包括乙醇胺、三乙胺和三(羟甲基)氨基甲烷。

本发明的核苷衍生物的制备方法没有特别限制，可以通过组合已知的合成方法来制备本发明的核苷衍生物。作为具体例子，本发明的核苷衍生物可以通过诸如下述实施例的合成方法来合成，例如使用6-氯嘌呤作为起始原料，通过包括4个阶段的反应制备胸苷衍生物，然后使在胸苷衍生物的5'位的羟基三磷酸化并除去胸苷衍生物o6位的保护基团。

(多核苷酸合成试剂)

如上所述，本发明的多核苷酸合成试剂(以下也称为“合成试剂”)包含含有本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐。本发明的合成试剂的特征在于含有本发明的核苷衍生物，并且其他组成和条件没有特别限制。例如可以通过引用将本发明的核苷衍生物或其盐的描述并入本发明的合成试剂的描述中。通过本发明的合成试剂，例如，可以合成下面描述的本发明的多核苷酸。

在本发明的合成试剂中，核苷衍生物优选含有例如所述亚磷酰胺化合物或核苷酸衍生物中的至少一种。

例如，本发明的合成试剂可以进一步含有用于合成多核苷酸的另一种试剂。

(制备多核苷酸的方法)

如上所述，本发明的多核苷酸的制备方法包括使用包括本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐合成多核苷酸的步骤。本发明的多核苷酸的制备方法的特征在于，在合成步骤中使用包括本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐，并且其他步骤和条件没有特别限制。例如，可以通过引用将本发明的核苷衍生物或其盐和合成试剂的描述并入本发明的多核苷酸的制备方法中。例如，通过本发明的多核苷酸的制备方法可以制备下述的本发明的多核苷酸。

在本发明的多核苷酸的制备方法中，本发明的合成试剂可以用作包括本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐。

在合成步骤中，多核苷酸的合成方法没有特别限制，并且上述多核苷酸可以通过已知的多核苷酸合成方法来合成。当亚磷酰胺化合物用作核苷酸衍生物或其盐时，多核苷酸可以在合成步骤中通过亚磷酰胺方法合成。

本发明的多核苷酸的制备方法还可包括例如纯化在合成步骤中获得的多核苷酸的步骤。纯化步骤中的纯化方法没有特别限制，多核苷酸可以通过已知的纯化方法如柱色谱法来纯化。

(多核苷酸)

如上所述，本发明的多核苷酸包括作为结构单元的含有本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐。本发明的多核苷酸的特征在于，包括作为结构单元的含有本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐，并且其他组成和条件没有特别限制。例如，可以通过引用将本发明的核苷衍生物或其盐、多核苷酸合成试剂和多核苷酸的制备方法的描述并入本发明的多核苷酸的描述中。例如，用本发明的多核苷酸可以制备与靶标结合的结合核酸分子，如下所述。在本发明的多核苷酸中，结构单元意指例如多核苷酸的一部分。

本发明的多核苷酸具有由例如以下化学式(6)表示的结构。例如，可以通过引用将每个取代基的描述并入化学式(6)中每个取代基的描述中。

本发明的多核苷酸可以是，例如，与靶标结合的结合核酸分子。所述靶标没有特别限制并且可以是任何靶表，并且作为具体实例，所述靶标可以是生物分子。所述生物分子的实例包括分泌型免疫球蛋白a(siga)、淀粉酶、嗜铬粒蛋白a、β-防御素(防御素)2、激肽释放酶、c-反应蛋白(c-反应蛋白、crp)、钙卫蛋白、富酪蛋白(statherins)、皮质醇和褪黑激素。所述结合核酸分子可以通过下面描述的本发明的结合核酸分子的制备方法来制备。

除了核苷酸衍生物之外，本发明的多核苷酸还可以包括例如其他核苷酸。核苷酸的实例包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本发明的多核苷酸的实例包括仅由脱氧核糖核苷酸组成的dna、包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的dna/rna以及仅由核糖核苷酸组成的rna。其他核苷酸可以是例如经修饰的核苷酸。

经修饰的核苷酸的实例包括经修饰的脱氧核糖核苷酸和经修饰的核糖核苷酸。例如，经修饰的核苷酸可以是具有修饰的糖的核苷酸。糖的实例包括脱氧核糖和核糖。核苷酸中的修饰位点没有特别限制，例如可以是糖的2'-位或4'-位。修饰的实例包括甲基化、氟化、胺化和硫杂化。经修饰的核苷酸可以是，例如，具有用嘧啶碱基(嘧啶核)作为碱基的经修饰的核苷酸或具有用嘌呤碱基(嘌呤核)作为碱基的经修饰的核苷酸，并且优选是前者。在下文中，将具有嘧啶碱基的核苷酸称为嘧啶核苷酸，将修饰的嘧啶核苷酸称为经修饰的嘧啶核苷酸，将具有嘌呤碱基的核苷酸称为嘌呤核苷酸，将修饰的嘌呤核苷酸称为经修饰的嘌呤核苷酸。嘧啶核苷酸的实例包括具有尿嘧啶的尿嘧啶核苷酸、具有胞嘧啶的胞嘧啶核苷酸和具有胸腺嘧啶的胸腺嘧啶核苷酸。当经修饰的核苷酸中的碱基是嘧啶碱基时，优选例如糖的2'-位和/或4'-位被修饰。经修饰的核苷酸的具体实例包括其核糖的2'-位被修饰的经修饰的核苷酸，诸如2'-甲基化-尿嘧啶核苷酸、2'-甲基化-胞嘧啶核苷酸、2'-氟化-尿嘧啶核苷酸、2'-氟化-胞嘧啶核苷酸、2'-胺化-尿嘧啶核苷酸，2'-胺化-胞嘧啶核苷酸、2'-硫杂化-尿嘧啶核苷酸和2'-硫杂化-胞嘧啶核苷酸。

其他核苷酸中的碱基可以是，例如，天然碱基(非人工碱基)，诸如腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)，或非天然碱基(人工碱基)。人工碱基的实例包括修饰的碱基和改变的碱基。人工碱基优选具有与天然碱基(a、c、g、t或u)相同的功能。具有与天然碱基相同功能的人工碱基的实例包括能够代替鸟嘌呤(g)结合胞嘧啶(c)、能够代替胞嘧啶(c)结合鸟嘌呤(g)、能够代替腺嘌呤(a)结合胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)、能够代替胸腺嘧啶(t)结合腺嘌呤(a)、以及能够代替尿嘧啶(u)结合腺嘌呤(a)的人工碱基。对经修饰的碱基没有特别限制，可以是例如甲基化碱基、氟化碱基、胺化碱基和硫杂化碱基。经修饰的碱基的具体实例包括2'-甲基尿嘧啶、2'-甲基胞嘧啶、2'-氟尿嘧啶、2'-氟胞嘧啶、2'-氨基尿嘧啶、2'-氨基胞嘧啶、2'-硫尿嘧啶和2'-硫胞嘧啶。在本发明中，例如，由a、g、c，t和u表示的碱基除了天然碱基之外还包括具有与天然碱基相同功能的人工碱基的含义。

除了核苷酸衍生物之外，本发明的多核苷酸还可以包括例如人工核酸单体。人工核酸单体的实例包括肽核酸(pna)、lna和ena。例如，单体残基中的碱基与上述相同。

本发明的多核苷酸的长度没有特别限制，其下限为例如10聚体、20聚体或25聚体，其上限为例如150聚体，100聚体或70聚体，其范围是例如10-150聚体，20-100聚体或25-70聚体。

例如，本发明的多核苷酸可以进一步包括附加序列。例如，优选地，附加序列与多核苷酸的5'末端或3'末端中的至少一个结合，更优选结合至3'末端。附加序列没有特别限制，且其长度也没有特别限制。

例如，本发明的多核苷酸可以进一步包括标记物。例如，优选地，标记物与多核苷酸的5'末端或3'末端中的至少一个结合，更优选结合至5'末端。标记物没有特别限制，并且其实例包括荧光物质、染料、同位素和酶。荧光物质的实例包括芘、tamra、荧光素、3染料、5染料、fam染料、罗丹明染料、德克萨斯红染料、荧光团(诸如joe、max、hex和tye)，染料的实例包括alexa染料，诸如488和647。

标记物可以例如直接与核酸分子连接或通过附加序列间接连接。

例如，本发明的多核苷酸可以以固定在载体上的状态使用。例如，优选固定本发明多核苷酸的5'末端或3'末端，更优选固定3'末端。例如，当固定本发明的多核苷酸时，可以将多核苷酸直接或间接固定在载体上。在后一种情况下，例如，优选通过附加序列固定核酸分子。

(结合核酸分子的制备方法)

如上所述，本发明的结合核酸分子的制备方法包括以下步骤：使候选多核苷酸和靶标彼此接触；选择与靶标结合的候选多核苷酸作为与靶标结合的结合核酸分子，候选多核苷酸是本发明的多核苷酸。本发明的结合核酸分子的制造方法的特征在于，候选多核苷酸例如是本发明的多核苷酸，并且其他步骤、条件等没有特别限定。例如，可以通过引用将核苷衍生物或其盐、合成试剂、多核苷酸的制备方法和多核苷酸的描述并入本发明的结合核酸的制备方法中。在本发明的结合核酸分子的制备方法中，候选多核苷酸包括作为结构单元的包括本发明的核苷衍生物或其盐的核苷酸衍生物或其盐。因此，例如，通过本发明的结合核酸分子的制备方法，可以制备对靶标具有优异结合能力的结合核酸分子。

关于本发明的结合核酸分子，接触步骤和选择步骤可以通过例如selex方法进行。

接触步骤中候选多核苷酸的数量没有特别限制，并且接触步骤中候选多核苷酸的数量为例如4²⁰-¹²⁰种(约10¹²-10⁷²)和4³⁰-4⁶⁰种(约10¹⁸-10³⁶)。

在接触步骤中，使候选多核苷酸和靶标彼此接触。然后，通过接触，候选多核苷酸和靶标反应以在候选多核苷酸和靶标之间形成复合物。在接触步骤中使用的靶标可以是例如靶标本身或其分解产物。候选多核苷酸和靶标结合的条件没有特别限制，例如，结合可以通过将二者在溶剂中温育一段时间来进行。溶剂没有特别限制，例如，优选二者的结合得以保持的溶剂，并且其具体实例包括各种缓冲溶液。

接下来，在选择步骤中，选择与靶标结合的候选多核苷酸作为结合靶标的结合核酸分子。具体地，收集与靶标形成复合物的候选多核苷酸作为结合核酸分子。除了复合物之外，接触步骤后候选多核苷酸和靶标的混合物还含有例如不参与复合物形成的候选多核苷酸。因此，例如，优选将复合物和未反应的候选多核苷酸从混合物中彼此分离。分离方法没有特别限制，并且可以是，例如，利用靶标和候选多核苷酸之间的吸附性差异或复合物和候选多核苷酸之间的分子量差异的方法。

除了该方法之外，分离方法可以是，例如，使用固定在载体上的靶标以形成复合物的方法。也就是说，靶标预先固定在载体上以使载体和候选多核苷酸接触，从而形成固定化靶标和候选多核苷酸的复合物。然后除去未与固定化靶标结合的未反应候选多核苷酸，并将靶标与候选多核苷酸之间的复合物与载体解离。将靶标固定在载体上的方法没有特别限制，可以通过已知方法进行。载体没有特别限制，可以使用已知的载体。

以上述方式，可以制备与靶标结合的结合核酸分子。

本发明的结合核酸分子的制备方法可以进一步包括，例如，确定所选择的结合核酸分子的碱基序列的步骤。确定碱基序列的方法没有特别限制，可以通过已知的碱基序列确定方法确定碱基序列。

在本发明的结合核酸分子的制备方法中，例如，一组接触步骤和选择步骤可以总共进行两个或更多个循环，并且其具体实例是3-15个循环。

实施例

下文参考实施例更具体地描述本发明。然而，应注意，本发明的范围不受这些实例的限制。除非另有说明，否则实施例中的市售试剂根据其方案使用。

[实施例1]

通过以下合成实施例制备ia8。

使用质谱仪(api2000，供应商：appliedbiosystems)以正离子或负离子模式进行电喷雾电离质谱(esi-ms)。使用核磁共振仪(jnm-ecs400，由jeol制造)获得¹hnmr光谱。化学位移表示为相对于内标四甲基硅烷(me4si)的δ(ppm)。使用色谱系统(econo系统，由bio-rad制造)进行离子交换色谱。在离子交换色谱中，使用填充有二乙基氨基乙基(deae)a-25-sephadex的玻璃柱(由amershambiosciences制造)。

(合成实施例1)tb4的合成

称量2-溴乙基胺氢溴酸盐(501mg，2.28mmol)并将其悬浮在1，4-二恶烷(5ml)中，然后将如此获得的混合物在冰浴下搅拌30分钟。向这样得到的混合物中加入二碳酸二叔丁酯(558mg，2.56mmol，1.1eq.)，滴加三乙胺(318μl，2.28mmol，1eq.)。然后将混合物在冰浴下搅拌30分钟，并在室温下搅拌48小时。通过抽滤除去沉淀物，并收集滤液。将滤液溶解在二氯甲烷中，然后将由此获得的溶液用蒸馏水分离两次。将硫酸镁加入到有机相中，并将由此获得的混合物过滤。减压下从滤液中蒸馏除去溶剂，得到液体tb4。tb4的物理特性如下所示。

产量：0.443g，产率：86.7％

esi-ms(正离子模式)m/z，实测值＝223.2，[(m+h)⁺]的计算值＝223.0

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.27(1h，s)3.53(2h，t)3.46(2h，t)1.45(9h，s)

(合成实施例2)ia1的合成

用ar代替6-氯嘌呤(107mg，692μmol)的气氛，并将6-氯嘌呤悬浮在干燥的dmf中，并将由此获得的混合物在冰浴下搅拌30分钟。将nah(32mg，1.31mmol，1.9eq.)加入到由此获得的混合物中，然后在冰冷却下搅拌混合物2小时。然后将溶解在干燥的dmf中的tb4(352mg，1.57mmol，2.2eq.)加入混合物中，然后在室温下搅拌。反应后，蒸馏除去溶剂。将残余物悬浮在氯仿中，收集滤液。将收集的滤液用水分离，并通过柱色谱法纯化有机相得到ia1。ia1的物理特性如下所示。

产量：108mg，产率：52.4％

esi-ms(正离子模式)m/z，实测值＝296.2，[(m+h)⁺]的计算值＝296.1

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.75(1h，s)8.10(1h，s)4.47(2h，t)3.60(2h，q)1.39(9h，s)

(合成实施例3)ia2的合成

用ar代替ia1(130mg，4.38×10^-4mol)的气氛，然后将ia1悬浮在干燥的ch2cl2(1.5ml)中，并将由此获得的混合物在冰浴下搅拌30分钟。然后将1-甲基吡咯烷(126μl，1.21mmol，3eq.)加入混合物中，然后在冰浴下进一步搅拌30分钟。将2-氰乙醇(ethylenecyanohydrin)(90μl，1.32mmol，3eq.)和dbu(29μl，1.94×10^-4mol，0.46eq.)加入混合物中，在冰浴下反应。反应后，将混合物用水分离两次，并通过柱色谱法纯化有机相得到ia2。ia2的物理特性如下所示。

产量：78mg，产率：53％

esi-ms(正离子模式)m/z，实测值＝333.1，[(m+h)⁺]的计算值＝333.2

实测值＝355.3，[(m+na)⁺]的计算值＝355.2

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.53(1h，s)，7.94(1h，s)，4.85(2h，t)，4.43(2h，t)，3.59(2h，q)，3.00(2h，t)，1.41(1h，s)

(合成实施例4)ia3的合成

将ia2(118mg，3.55mmol)溶解在甲醇(1ml)中，然后将三氟乙酸盐(5ml)滴加到如此获得的溶液中，在室温下反应。反应后，蒸馏除去溶剂，将残余物悬浮在乙醚中，然后将由此获得的混合物过滤。收集残余物得到ia3。ia3的物理性质如下所示。

产量：128mg，产率：104.1％

esi-ms(正离子模式)m/z，实测值＝233.1，[(m+h)⁺]的计算值＝233.2

实测值＝255.2，[(m+na)⁺]的计算值＝255.2

实测值＝271.2，[(m+k)⁺]的计算值＝271.2

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ8.68(1h，s)，8.49(1h，s)，4.84(2h，t)，4.60(2h，t)，3.24(2h，t)

(合成实施例5)ia4的合成

用ar代替(e)-5-(2-羧基乙烯基)-2'-脱氧尿苷(98mg，3.29×10^-4mol)的气氛，向其中加入hobt·h2o(69mg，4.51×10^-4mol，1.3eq.)和pybop(223mg，4.42×10^-4mol，1.3eq.)。然后将如此获得的混合物溶于干燥的dmf(1ml)中，然后将dipea(1.18ml，6.61mmol，20eq.)加入到由此获得的溶液中。然后将该溶液滴加到ia3(128mg，3.70×10^-4mol，1.1eq.)中(其气氛已经用ar代替，然后将其溶解在干燥的dmf(0.5ml)中)，在室温下反应。反应后，蒸馏除去溶剂，将残余物悬浮在cdcl3中，然后将混合物进行超声处理和过滤。收集残余物并悬浮在meoh中，然后将混合物进行超声处理和过滤。收集残余物得到ia4。ia4的物理特性如下所示。

产量：84mg，产率：49.7％

esi-ms(正离子模式)m/z，实测值＝513.1，[(m+h)⁺]的计算值＝513.2，

实测值＝535.2，[(m+na)⁺]的计算值＝535.2，

实测值＝551.1，[(m+k)⁺]的计算值＝551.2，

esi-ms(负离子模式)m/z，实测值＝511.3，[(m-h)^-]的计算值＝511.2

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ8.51(1h，s)，8.30(1h，s)，8.22(1h，s)，7.05(1h，d)，6.89(1h，d)，6.11(1h，t)，5.25(2h，d)，5.13(1h，t)，4.70(2h，t)，4.32(2h，t)，3.77(1h，d)，3.58(2h，m)，3.11(2h，t)，2.12(2h，m)

(合成实施例6)ia5的合成

在氩气氛下，将真空干燥的ia4(80mg，1.56×10^-4mol)和干燥的dmf(20ml)共沸两次，并且将ia4和干燥的mecn(10ml)共沸三次。将由此获得的共沸物悬浮在干燥的磷酸三甲酯(30ml)中，并在冰浴下将磷酰氯(620μl，6.65×10^-4mol，42.6eq.)滴加到由此获得的混合物中，并且然后将混合物搅拌19小时。此后，向混合物中加入1mol/lteab缓冲液，然后搅拌15分钟。然后，在减压下蒸馏出溶剂，在醚和mecn中进行结晶，并进行过滤以获得黄色沉淀物。将该黄色沉淀物溶解在水中，通过阴离子交换柱色谱法纯化，并冷冻干燥得到ia5。ia5的物理特性如下所示。

产量：57.96μmol，产率：37％

esi-ms(负离子模式)m/z，实测值＝590.9，[(m-h)^-]的计算值＝591.1

(合成实施例7)ia6的合成

将真空干燥的ia5(57.96μmol)和干燥的吡啶(5ml)共沸三次，然后将由此获得的共沸物真空干燥过夜。将共沸物的气氛用ar代替，然后将共沸物溶于干燥的dmf(2ml)和干燥的tea(55μl，3.95×10^-4mol，6.8eq.)中，将咪唑(26mg，3.82×10^-4mol，6.6eq.)、2，2'-二硫代二吡啶(24mg，1.09×10^-4mol，1.9eq.)和三苯基膦(30mg，1.37×10^-4mol，2eq.)加入到如此获得的溶液中，然后在室温下搅拌。搅拌9小时后，将如此得到的反应溶液加入到通过将高氯酸钠(86mg，7.02×10^-4mol，12eq.)溶于干燥的丙酮(18ml)、干燥的醚(27ml)和干燥的tea(2ml)中得到的溶液中，然后在4℃静置30分钟，并用干燥的醚(12ml)倾析两次得到沉淀物。将该沉淀物真空干燥得到ia6粗产物。ia6的物理特性如下所示。

理论产量：57.96μmol

esi-ms(负离子模式)m/z，实测值＝641.3，[(m-h)^-]的计算值＝641.2

(合成实施例8)ia7的合成

真空干燥的ia6(57.96μmol)的气氛用ar代替，将ia6和干燥的吡啶(5ml)共沸两次，然后将由此获得的共沸物悬浮在干燥的dmf(1毫升)中。将干燥的n-三丁胺(55μl，2.30×10^-4mol，4eq.)和0.5mol/l的n-三丁胺焦磷酸盐在dmf(0.6ml，2.96×10^-4mol，5eq.)中加入到由此得到的混合物中，然后在室温下搅拌。搅拌12小时后，向混合物中加入1mol/lteab缓冲液(5ml)，然后搅拌30分钟，然后减压蒸馏除去溶剂。加入水，水层用醚分离两次，通过阴离子交换柱色谱法纯化，并冷冻干燥得到ia7。ia7的物理特性如下所示。

粗产量：16.65μmol，产率：28.7％

esi-ms(负离子模式)m/z，测定值＝751.0，[(m-h)^-]的计算值＝751.1

(合成实施例9)ia8的合成

将ia7(12.49μmol)溶解在meoh(500μl)中，将28％nh3(1500μl)和三乙胺(300μl)加入到由此获得的溶液中，然后在室温下反应1.5小时。反应后，减压蒸馏除去溶剂，将残渣冷冻干燥得到ia8。ia8的物理特性如下所示。

产量：8.39μmol，产率：67.2％

esi-ms(负离子模式)m/z，实测值＝697.9，[(m-h)^-]的计算值＝699.1

[实施例2]

本实施例检测了结合siga的结合核酸分子和结合淀粉酶的结合核酸分子是否可以使用ia8获得。

(1)结合核酸分子

通过selex方法获得结合各自靶标的结合核酸分子，不同之处在于，除了分别含有腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶(分别为datp、dgtp和dctp)的脱氧核糖核苷酸，还使用ia8作为脱氧核糖核苷酸来制备候选多核苷酸。具体地，以下列方式获得结合核酸分子。根据产品附带的方案，将siga(由mpbiomedicals，llc-cappel产品)或人唾液淀粉酶(由leebiosolutions公司制造)作为靶标与珠子(dynabeadsmyonecarboxylicacid，由invitrogen制造)结合。结合靶标后，用选择缓冲液(sb缓冲液：40mmol/lhepes、125mmol/lnacl、5mmol/lkcl、1mmol/lmgcl2、0.01％tweenph7.5)洗涤珠子，由此制备靶珠。使用其5'末端用生物素修饰(正向(fw)引物区-n30(30个碱基)-反向(rv)引物区)的互补链、正向引物和dna聚合酶(koddash，toyobo有限公司)以及datp、dgtp、dctp和ia8来制备插入ia8的dsdna。随后，将dsdna与珠子(dynabeadsmyonecarboxylicacid)结合，然后用0.02mol/lnaoh水溶液洗脱ss(单链)dna。进一步地，用0.08mol/l盐酸水溶液中和naoh水溶液。因此，制备了ssdna文库。将20pmol的文库与250μg的靶珠在25℃下混合15分钟。然后，用7mol/l尿素水溶液洗脱与珠子结合的ssdna。使用正向引物和生物素修饰的反向引物通过pcr扩增被洗脱的ssdna。在pcr中，datp、含腺嘌呤的脱氧核糖核苷酸(dttp)、dgtp和dctp用作脱氧核糖核苷酸。将获得的dsdna与磁珠(dynabeadsmyonesac1磁珠，由invitrogen制造)结合。然后，用0.02mol/lnaoh水溶液洗脱正向链并将其除去。除去正向链后，用sb缓冲液洗涤磁珠。通过使用其上固定有互补链的磁珠、正向引物和dna聚合酶(koddash，toyobo有限公司)、datp、dgtp、dctp和ia8，以上述方式制备其中插入ia8的dsdna。接下来，通过用0.02mol/lnaoh水溶液洗脱正向链来制备ssdna文库，并将该文库用于后续轮次。通过进行八轮相同的过程来选择与siga或淀粉酶结合的核酸分子。此后，使用正向引物和没有生物素修饰的反向引物进行pcr。使用测序仪(gsjuniorsequencer，roche)对获得的核酸分子进行测序。

结果，获得了由以下seqidno:1的碱基序列组成的结合核酸分子作为结合淀粉酶的结合核酸分子，以及由以下seqidno:2的碱基序列组成的结合核酸分子作为结合siga的结合核酸分子。在seqidno:1和2的碱基序列中，带下划线的碱基t是ia8。

α-淀粉酶结合核酸分子(seqidno:1)

5'-ggaatcagtccgccgctaatacgctggtatggttgaagtgcgtattagacatgtgaacgatcctgtgcccgataaag-3'

siga结合核酸分子(seqidno:2)

5'-ggaatcagtccgccgctaatactagtcatcgcttttaatttcgcattgtaccgtgaacgatcctgtgcccgataaag-3'

(2)通过表面等离子体共振(spr)检查结合

在以下spr条件下测量淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶之间的结合以及siga结合核酸分子与siga之间的结合。适用于在3'末端添加20聚体的聚(dt)的淀粉酶结合核酸分子和siga结合核酸分子各自用作下列配体2。此外，作为对照，检测结合以相同的方式进行，除了在检测淀粉酶结合核酸分子的结合的系统中，使用siga、嗜铬粒蛋白a(cga，creativebiomart)和牛血清白蛋白(bsa)作为以下分析物，在检测siga结合核酸分子的结合的系统中，使用淀粉酶、cga和bsa作为以下分析物。

(spr测量条件)

测量设备：proteon^tmxpr36(biorad)

测量芯片：proteon^tmnlc传感器芯片(由biorad制造)

配体1：聚(dt)(20聚体)，其5'端用生物素修饰：5μmol/l

缓冲液：40mmol/lhepes，125mmol/lnacl，1mmol/lmgcl2，5mmol/lkcl，0.01％20，ph7.4

配体2：含有结合核酸分子的缓冲液，其3'末端添加聚(a)(20聚体)，200nmol/l，

配体流速：25μl/min，80秒

分析物：含有400nmol/l靶标的缓冲液

分析物流速：50μl/min

接触时间：120秒

解离：300秒

·淀粉酶：α-淀粉酶(由leebiosolutions制造，产品编号：#120-10)

·siga：iga(分泌型)，人类(由mpbiomedicals，llc制造，cappel产品，产品编号：#55905)

·cga：重组全长人类嗜铬粒蛋白a(由creativebiomart制造，产品编号：#chga26904th)

·bsa：牛血清白蛋白(由sigma制造，产品编号：#a7906)

注射配体2后，测量信号强度(ru)。在0秒开始注射配体2，测定信号强度从115秒到125秒的平均值(ru115-125)。然后，计算当添加聚(dt)的适配体与生物素化的聚(da)结合时的ru值(ruimmob)和ru115-125的比例(ru115-125/ruimmob)。

图1a和1b是说明淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶的结合能力的图。在图1a中，横轴表示注入配体后经过的时间，纵轴表示结合力的相对值(ru)。在图1b中，横轴表示分析物的种类，纵轴表示ru115-125/ruimmob。如图1a和1b所示，淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶结合，而它不与任何对照结合。

图2a和2b是说明siga结合核酸分子与siga的结合能力的图。在图2a中，横轴表示注入配体后经过的时间，纵轴表示结合力的相对值(ru)。在图2b中，横轴表示分析物的种类，纵轴表示ru115-125/ruimmob。在图2a和2b中可见，siga结合核酸分子与siga结合，而它不与任何对照结合。

从这些结果发现，使用ia8(其是本发明的核苷衍生物)可以获得结合淀粉酶的结合核酸分子和结合siga的结合核酸分子。

(3)结合力的检测

以与上述项目(2)中相同的方式测量结合力的相对值(ru)，不同之处在于，将在其3'末端添加20聚体的聚(t)的淀粉酶结合核酸分子用作配体2，并将作为分析物的α-淀粉酶的浓度设定为12.5、25、50、100或200nmol/l。此外，以与上述(2)中相同的方式测量结合力的相对值(ru)，不同之处在于，将在其3'末端添加20聚体的聚(t)的siga结合核酸分子用作配体2，并将作为分析物的siga的浓度设定为12.5、25、50、100或200nmol/l。

图3是显示淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶的结合能力的图。图4是显示siga结合核酸分子与siga的结合能力的图。在图3和4的每个图中，横轴表示注入配体后经过的时间，纵轴表示结合力的相对值(ru)。如图3所示，对于淀粉酶结合核酸分子，随着淀粉酶浓度的增加，信号强度增加。而且，如图4所示，对于siga结合核酸分子，随着siga浓度的增加，信号强度增加。

然后，基于在上文中测量的结合力的相对值(ru)，计算了淀粉酶结合核酸分子与α-淀粉酶之间的解离常数和siga结合核酸分子与siga之间的解离常数。结果，淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶之间的解离常数为38.6nm，siga结合核酸分子与siga之间的解离常数为3.61nm。这些结果表明该结合核酸分子都对靶标具有优异的结合能力。

(4)通过毛细管电泳检测结合

淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶之间的结合通过毛细管电泳在以下条件下测量。使用适于用试剂盒中包括的荧光染料标记的淀粉酶结合核酸分子。作为对照，除了不添加作为靶标的淀粉酶之外，以相同的方式进行测量。

(毛细管电泳的条件)

测量装置：cosmo-isv1210(日立高新技术公司)(日立ハイテクノロジー社)

测量芯片：i-chip12(日立化成工业株式会社)(hitachichemical社)

电泳凝胶：0.6％(羟丙基)甲基纤维素，粘度2,600-5,600(由sigma制造，产品编号：#h7509)

凝胶溶解缓冲液：40mmol/lhepes(ph7.5)，5mmol/lkcl，1mmol/lmgcl2

克隆：含有600nmol/l的标记有试剂盒中包括的荧光染料的淀粉酶结合核酸分子的溶液，40mmol/lhepes(ph7.5)，125mmol/lnacl，5mmol/lkcl和1mmol/lmgcl2

靶标：含有5.9μmol/l淀粉酶的溶液(α-淀粉酶-高纯度，人，由leebiosolutions公司制造，产品编号：#120-10)，40mmol/lhepes(ph7.5)，125mmol/lnacl，5mmol/lkcl和1mmol/lmgcl2

折叠：95℃，5分钟后，在冰上5分钟

混合：加入靶标后，室温(约25℃)，30分钟，1000rpm

注入电压：300v.

注射时间：120秒

分离电压：350v.

分离时间：260秒

获得的结果显示在图5中。图5是说明毛细管电泳结果的图。在图5中，电泳时间显示在照片的左侧，并且各个泳道从左侧起显示获得的关于对照(没有淀粉酶)结果和使用淀粉酶时获得的结果。在图5中可见，存在淀粉酶时的电泳时间长于不含淀粉酶的对照中的电泳时间。根据该结果，发现淀粉酶结合核酸分子与淀粉酶结合。

[比较例]

比较例检查了仅使用天然碱基不能获得结合淀粉酶的结合核酸分子。除非另有声明，否则以与实施例2中相同的方式进行操作。

使用含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的各脱氧核糖核苷酸(分别为datp、dgtp、dctp和dttp)合成候选多核苷酸，并进行selex方法。然后，通过spr检测获得的每种结合核酸分子与淀粉酶的结合。该核酸分子的序列如下所示。

aml2196r8m4(seqidno:3)

ggtaagactcccgccagatttgggtggggggcgggggtggaggaggtggcggtgaagccctcggtcgaaatc

aml1217r8m4(seqidno:4)

ggaaaccctgcgtcctgaaattgcgctgcgatagtgaaggcataacaggttcactcatctgtgctggcggaatag

获得的结果显示在图6中。图6显示说明每种结合核酸分子与淀粉酶的结合能力的图。横轴表示各结合核酸分子的种类，纵轴表示ru115-125/ruimmob。在每个图中，各自的结果，从左侧起，为使用淀粉酶获得的结果、使用siga获得的结果、使用cga获得的结果以及使用bsa获得的结果。如图6所示，所获得的每种核酸分子与淀粉酶的结合力(ru115-125/ruimmob)约为0。此外，还测定了与靶标以外的物质结合的交叉反应。

从这些结果发现，仅使用天然碱不能获得结合淀粉酶的任何结合核酸分子。

尽管以上参考实施方案和实施例描述了本发明，但是本发明不限于此。可以在本领域技术人员可以理解的本发明的范围内进行各种修改。

本申请基于并要求2016年11月28日提交的日本专利申请no.2016-230196的优先权，并且其全部公开内容通过引用整体并入本文。

工业实用性

本发明可提供新的核苷衍生物或其盐。本发明的核苷衍生物具有嘌呤环状结构和嘧啶环状结构中的两种结构。因此，与具有一个嘌呤环状结构或一个嘧啶环状结构的核苷衍生物相比，本发明的核苷衍生物具有例如相对较大数量的能够在分子内或分子间相互作用的原子。因此，与具有一个嘌呤环状结构或一个嘧啶环状结构的核苷衍生物相比，包括本发明的核苷衍生物的结合核酸分子对靶标具有改善的结合能力。因此，用本发明的核苷衍生物，可以制备例如对靶标表现出优异结合能力的结合核酸分子。因此，本发明在例如分析、医学、生命科学等领域中确实是有用的。