来源于卵泡抑素的生物活性肽及其用途的制作方法

本发明涉及来源于生长因子的生物活性肽的新用途。
背景技术：
：动物有按季节整体替换毛的换毛期，而人类是每天继续替换整个毛发中的一部分来始终维持相似的数量。毛发的周期(haircycle)可分为三个周期，即，生长期、退行期、休止期，其中，生长期(anagen)为在毛乳头发生活跃的细胞分裂而促进新的毛发的生长的时期，在这个时期可生长毛发。就毛发的生长周期而言，男性大致为3至5年，女性大致为4至6年左右，整体上，约80至85％的毛发相当于生长期。退行期(catagen)为逐渐停止细胞分裂的时期，大致为3至4周左右。最后，休止期(talogen)为毛乳头萎缩而毛发与毛细血管分离，从而单纯地扎进头皮的时期，大致为3个月左右，处于休止期的毛发大体上因物理刺激而容易从毛皮中脱离。通常，脱发是指这种周期中生长期的毛发比率变短，因退行期或休止期的毛发增加而大量毛发异常脱落的情况。人类的毛发虽然与生命无关，但因对人的印象及外貌产生决定性的影响而受到社会上很多关注，以往，认为脱发是一种症状，但与其不同，最近多认为是一种疾病。尤其，最近，因高度化、工业化加速导致的过度压力、生活习惯的多种社会文化因素，脱发人口急剧增加。并且，最近，不仅是中年男性，壮年层的脱发也增加，从而用于分析脱发的多种原因并解决其的研究正在活跃地进行。为了周期性的毛发生长，应进行毛囊的再生和干细胞的激活，众所周知，通过wnt/β-连环蛋白(catenin)的生成、激活来实现。并且，众所周知，之前提及的dkk-1为wnt/β-连环蛋白的拮抗剂，当调节毛发生长时，上述的信号体系非常重要。另一方面，转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，tgf-β)超家族为调节器官的发达和分化的多功能性生长分化因子，尤其，当调节毛囊的形成和毛发的循环及生长时，是必不可少的。卵泡抑素(follistatin)与骨形成因子(bonemorphogenicprotein)和激活素(activin)(参照：nakamura,science.1990,247；4944,p836-838)之类的转化生长因子家族强烈地结合(对于激活素的解离常数kd＝540-680pmil/l)，并使它们的活性中和。并且，卵泡抑素在生物体内直接或间接地参与激活素的多种生物活性的控制。众所周知，通过分析卵泡抑素的氨基酸序列，由四个域形成，即，n末端域、卵泡抑素域ⅰ、卵泡抑素域ⅱ、卵泡抑素域ⅲ(shimasaki,proc.natl.acad.sci.1988,85；12,p4218-4222)。众所周知，其中，卵泡抑素域参与激活素的结合。毛发的生长及退化的过程与非常多的因素相关联，而本研究人员执行应用用于促进毛囊的生成中最重要的毛发的毛乳头(humandermalpapilla，hdp)细胞的增殖并调节头皮的生物活性的生长因子的研究。尤其，调节毛发的生长及退化的多种生长因子从毛囊的毛乳头细胞中形成而被调节。据报告，之前提及的激活素也从毛乳头细胞中表达来诱导毛囊的形成，并使毛发的生长周期激活(sung,experimentaldermatology.2017,26；2,p108-115)。激活素的活性妨碍进入毛发的收缩期，通过调节激活素-卵泡抑素来表达的多种蛋白质对毛发的生长和分化起到重要的作用，可生成新的毛细胞。不仅如此，激活素的调节通过调节表皮的增殖和分裂来执行对表皮的稳态性调节必要的信号传递作用。至今为止开发的脱发症的治疗或预防用制剂有包含将用于促进血液循环、强化毛根功能、保湿头皮及抑制雄性激素的雌性激素作为主要成分的制剂或米诺地尔(minoxidil)、非那斯特莱(finasteride)、粘多糖生长素(trichosaccharide)等的制剂等，但因性功能障碍、畸形儿分娩可能性、全身生发等的副作用而使用上受到很多限制。并且，上述医药品价格昂贵且需要持续性的使用，当中断使用时，存在重新引起脱发的缺点。并且，存在对于功效的每个人的差异大，且对于副作用每个人有所差异的缺点。本发明人重新鉴定卵泡抑素的特定部位利用激活素结合基序来起作用，并确认包含上述基序的肽在激活素之类的结合位点竞争性地结合，通过抑制天然的卵泡抑素和激活素的结合来促进毛发的生长。并且，本发明人提供上述肽不仅对于脱发症，又对于与上述信号体系相关的多种疾病的治疗的应用可能性。技术实现要素：技术问题本发明是为了解决上述的现有技术的问题而提出的，本发明的目的在于，提供生物体稳定性优秀，促进生发及皮肤状态改善效果优秀的生物活性肽。技术方案根据本发明的一实施方式，提供由选自由序列号1至7组成的组中的一种以上的氨基酸序列形成的生物活性肽。在一实施例中，上述肽可促进成纤维细胞、角质细胞或毛囊细胞的生长。在一实施例中，上述肽可使毛乳头细胞的生长因子激活。根据本发明的再一实施方式，提供由以下化学式1表示的生物活性肽结构体。[化学式1]r1–a–r2在上述化学式中，上述a为连接子，上述r1为由选自由序列号1至3组成的组中的一种以上的氨基酸序列形成的肽，上述r2为由序列号4的氨基酸序列形成的肽。在一实施例中，上述a可以为由以下化学式2表示的化合物。[化学式2]h2n(ch2)nco2h在上述化学式中，n为1≤n≤18的整数。在一实施例中，上述a可以为6-氨基己酸(6-aminohexanoicacid)。在一实施例中，上述生物活性肽结构体可促进成纤维细胞、角质细胞或毛囊细胞的生长。在一实施例中，上述生物活性肽结构体可使毛乳头细胞的生长因子激活。根据本发明的另一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的脱发防止及生发促进用组合物。根据本发明的还一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的皱纹改善、皮肤弹性改善、皮肤保湿改善或皮肤再生用组合物。根据本发明的又一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的化妆品组合物。根据本发明的又一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的皮肤外用剂组合物。根据本发明的又一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的脱发预防或治疗用药学组合物。有益效果根据本发明的一实施方式，通过使用大小小的肽，可实现优秀的皮肤渗透率，由此可提高毛发及皮肤状态改善效果。上述肽因生物活性而可应用于医药品、医药外品、保健食品、化妆品等多种目的的产品。本发明的效果不局限于上述的效果，应理解为包括可从本发明的详细说明或发明要求保护范围中所记载的发明的结构推论的所有效果。附图说明图1为本发明一实施例的肽的高效液相色谱(hplc)分析结果。图2a为表示对本发明一实施例的肽进行处理的角质细胞中细胞生长促进效果的图表。图2b为表示对本发明一实施例的肽进行处理的成纤维细胞中细胞生长促进效果的图表。图2c为对本发明一实施例的肽进行处理的毛囊细胞中细胞生长促进效果的图表。图3a利用显微镜并通过三维立体细胞培养法确认对本发明一实施例的肽进行处理的毛囊细胞中细胞生长促进效果。图3b表示对本发明一实施例的肽进行处理的三维立体细胞中毛囊细胞球体的大小。图4确认根据本发明一实施例的肽处理的smad2磷酸化增加。图5确认将根据本发明一实施例的肽处理的毛囊激活的信号机制的增加。图6通过免疫染色化学法确认根据本发明一实施例的肽处理的毛乳头的自组装促进效果及毛发生长因子的表达增加。图7观察对本发明一实施例的肽进行处理的小鼠等部位中毛发生长。具体实施方式本说明书中使用的术语考虑本发明中的功能的同时尽可能选择当前广泛使用的一般术语，但这可根据本发明所属
技术领域：
的普通技术人员的意图或判例、新技术的出现等而不同。并且，特定情况下，也有申请人任意选定的术语，此时，在相应的说明书部分中详细记载其含义。因此，本发明中使用的术语应基于其术语所具有的含义和本发明的全文内容进行定义，而不是单纯的术语的名称。除非有不同定义，则包括技术或科学术语在内的在此使用的所有术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。应解释为通常使用的词典上定义的术语具有与相关技术的文脉上所具有的含义相一致的含义，除非本申请中有明确定义，则不被解释为理想或过度形式性的含义。数值范围包括上述范围内定义的数值。本说明书中的所有最大数值限制如同明确写有低的数值限制，包括所有更低的数值限制。本说明书中所有最小数值限制如同明确写有更高的数值限制，包括所有更高的数值限制。本说明书中所有数值限制如同明确写有更窄的数值限制，包括更宽的数值范围内的更好的所有数值范围。以下，详细记述本发明的实施例，但本发明不局限于以下实施例，这是显而易见的。本发明的一实施方式提供由选自由序列号1至7组成的组中的一种以上的氨基酸序列形成的生物活性肽。本发明人为了发掘具有生物学上有效的活性的肽而锐意研究，最终，查明上述肽的生物体内生物活性，尤其，查明上述肽的皮肤状态改善效果及毛发生长促进效果。不仅如此，上述生物活性肽作为统称生物体内具有规定的生物作用的肽的概念，通过调整遗传表达和生物功能，可当在生物体内因参与功能调节的物质的缺少或过度分泌而呈现异常病态时起到改正其的作用。上述肽可由上述序列号1至7的氨基酸序列形成或可包含上述氨基酸序列作为一部分。上述肽(peptide)是指由通过酰胺键(或肽键)连接的一种以上的氨基酸形成的聚合物。根据本发明的目的，上述肽可指呈现皱纹改善、皮肤弹性改善效果的肽或其片段。命名上述肽的一般规则若无具体指示的例外事项，则可基于3字母或1字母氨基酸代码。例如，氨基酸结构的中心部由3字母代码(例如，ala、lys)表示，通过在3字母代码前面记录“d-”，当不具体指示d-立体形态(例如，d-ala、d-lys)的情况时，可假定为l-立体形态。形成上述肽的氨基酸残基可以为天然或非天然氨基酸残基。上述肽随机地部分合成卵泡抑素蛋白质的多个部位来对针对受体蛋白质可结合的部位进行第一次探索之后，将预测到的部位的氨基酸序列进行优化，并通过将候选肽中活性最优秀的肽进行筛选来完成。上述肽包含天然卵泡抑素的激活素结合基序，通过与激活素相结合来妨碍与天然卵泡抑素的结合，可促进激活素的活性。上述肽具有成纤维细胞、角质细胞或毛囊细胞生长促进能力，即使存在有天然的卵泡抑素，也可传递激活素的信号。上述肽对于作为毛囊的主要基因的wnt5、fgf7、versican、lef1表达，可增加肽，并通过三维立体细胞培养增加毛乳头细胞的大小。尤其，众所周知，上述wnt配体通过在细胞内使β-连环蛋白信号机制激活来抑制脱发。上述wnt可与毛囊细胞的卷曲受体相结合来使毛乳头细胞激活，并抑制包括tgf-b、dkk-1、bmp等在内的毛囊细胞破坏物质来抑制脱发。即，上述肽可使wnt的生成量显著地增加，并促进毛囊细胞的生长来实现优秀的脱发防止及生发促进效果。上述肽与天然的卵泡抑素蛋白质竞争性地作用来抑制天然卵泡抑素的功能，与天然的卵泡抑素蛋白质相比，稳定性及皮肤渗透度优秀。上述肽可促进成纤维细胞或角质细胞的生长来向皮肤赋予弹性，由此可抑制皱纹形成。进而，上述肽可促进毛囊细胞的生长来诱导毛发的生长。皮肤内角质细胞和成纤维细胞可因精神压力、外部的有害因素、内因性老化等多种原因而受损导致退化，并减小密度。尤其，内外压力引起的角质细胞及成纤维细胞的受损降低皮肤细胞的密度，并妨碍胶原蛋白(collagen)的合成，因而可加深皮肤皱纹的形成。上述胶原蛋白为结合组织的主要成分，是主要分布于骨头和皮肤的成分，是维持皮肤的结构和形态，并提供坚固的强度和弹性的硬蛋白质。当皮肤老化或露在紫外线、热等时，胶原蛋白合成能力有可能降低，且胶原蛋白量显著减少。当上述胶原蛋白量减少时，无法维持肌肉的形态，因而可生成皮肤皱纹(wrinkle)。上述肽来源于人体内卵泡抑素，因小的分子量和大小而皮肤渗透率高，且皮肤生长促进效果优秀。上述肽促进成纤维细胞及角质细胞的生长，并促进胶原蛋白合成，因而可使皮肤的角质层、上皮层、真皮层生长，并呈现皱纹改善、皮肤弹性改善、皮肤老化防止、皮肤保湿改善、皮肤再生等的效果。当上述肽局部适用于皮肤时，可同时实现皱纹改善之类的皮肤状态改善、脱发改善、毛发生长促进等的整个效果。上述肽在提取生物体内的蛋白质之后，利用蛋白质分解酶来进行处理，以实现低分子量化，或者可利用基因重组及蛋白质表达系统来实现生物学制备，或者通过利用肽合成仪等的化学合成方法进行制备。例如，上述肽通过该领域中公知的化学合成方法，尤其，可通过固相合成技术(solid-phasesynthesistechniques)进行制备(参照：merrifield,j.amer.chem.1963,soc.85:2149-54；stewart,etal.solidphasepeptidesynthesis,2nd.ed.,piercechem.1984,co.:rockford,111)。例如，可通过基因操作制备对由融合配偶体及上述肽形成的融合蛋白质进行编码的基因，并利用上述基因来使宿主微生物进行转化之后，在宿主微生物中以融合蛋白质形态进行表达。上述融合蛋白质可利用蛋白质分解酶或化合物来进行切断及分离，并可获取上述肽。具体地，将对可利用因子(factor)xa或肠激酶之类的蛋白质分解酶、cnbr或羟胺之类的化合物来切断的氨基酸残基进行编码的脱氧核糖核酸(dna)序列可插入于上述融合配偶体及上述肽的基因之间。上述肽的n或c-末端可结合有乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(peg)。上述肽通过上述变形可显著改善稳定性。上述稳定性是包括体内(invivo)稳定性及储存稳定性的概念。上述保护基可从生物体内的蛋白质切断酶的攻击保护本发明的肽。上述肽可包含含有上述氨基酸序列的肽的功能同等物。上述“功能同等物”因氨基酸的添加、取代或缺失，其结果具有上述氨基酸序列和至少40％以上，优选为80％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上的序列同源性，是指与上述氨基酸序列具有实质上同质的生物活性的蛋白质。上述“实质上同质的生物活性”是指上述肽的结构性、功能同源性引起的抗炎活性等皮肤状态改善活性。上述序列同源性对比两个以最佳的方式排列的序列和比较区域而确定，可添加或删除比较区域中的一部分核酸序列。根据本发明的再一实施方式，提供由以下化学式1表示的生物活性肽结构体。[化学式1]r1–a–r2在上述化学式中，上述a为连接子，上述r1为由选自由序列号1至3组成的组中的一种以上的氨基酸序列形成的肽，上述r2为由序列号4的氨基酸序列形成的肽。上述肽结构体包含由上述序列号1至3中的一种氨基酸序列形成的肽及由上述序列号4的氨基酸序列形成的肽，上述肽可由连接子相连接。上述连接子可以为柔性连接子(flexiblelinker)，具体为肽连接子或非肽连接子。上述“非肽连接子”是指重复单位结合2个以上的生物适应性连接子，上述重复单位可通过非肽键的任意共价键相连接。上述非肽连接子可以为聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯乙醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类、透明质酸或它们的组合，但不局限于此。具体地，上述a可以为由以下化学式2表示的化合物，可优选为6-氨基己酸(6-aminohexanoicacid)。[化学式2]h2n(ch2)nco2h在上述化学式中，n为1≤n≤18的整数。上述6-氨基己酸(6-aminohexanoicacid)可由以下化学式3表示，对于上述肽起到连接子的作用的同时可更增大对于上述肽的生物活性。[化学式3]根据本发明的另一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的脱发防止及生发促进用组合物。上述“脱发”是指在正常毛发应存在的部位，毛发缺损的状态，通常，是指头皮的成毛掉下的情况。成毛与无色且细的软毛不同，缺损时有可能引起美容方面的问题。上述脱发可区分为临床上形成伤痕的情况和并非如此的两种，形成伤痕的脱发(瘢痕性)因毛囊被破坏而毛发不会再生，相反，不形成伤痕的脱发(非瘢痕性)维持毛囊，因而在症状部位消失之后，毛发有可能再生。上述脱发可以为圆形脱发(alopeciaareata)、全头脱发(alopeciatotalis)、泛发性脱发(alopeciauniversalis)、男性型脱发(androgenicalopecia)、休止期脱发(telogeneffluvium)、生长期脱发(anageneffluvium)或化疗引起的脱发(chemotherapy-inducedalopecia)，但不局限于此。由于上述肽可促进毛囊细胞的生长，因而可从根本上促进毛发的生长的同时可有效保护生长的毛发。上述“脱发防止”或“生发促进”能够以类似的含义使用，这可内含与本领域中使用的另一个术语，即，脱发改善、养毛促进、育毛促进相同的含义。根据本发明的还一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的皱纹改善、皮肤弹性改善、皮肤保湿改善或皮肤再生用组合物。上述“皱纹”是指皮肤衰落而产生的细纹，可由基因引起的原因、存在于皮肤真皮的胶原蛋白及弹性的减少、外部环境等诱发。上述“皱纹改善”是指抑制或阻碍在皮肤生成皱纹，或缓解已生成的皱纹的现象。上述“皮肤弹性”是指因由存在于真皮层的弹性蛋白(elastin)形成的弹性纤维而实现的弹性，上述弹性纤维如同橡胶具有低的弹性模量，因此，可因外力而容易发生变形，当外力被去除时，容易恢复到原状态。上述弹性纤维在被称为弹性蛋白的无定形的基质扎有微原纤维(microfibrils)，上述弹性蛋白是指由仅在被称为来源于赖氨酸的锁链素(desmosine)及异锁链素(isodesmosine)的弹性纤维中发现的独特的氨基酸形成的蛋白质。上述锁链素及异锁链素可在长的肽链内形成交联(cross-links)，上述结构可对弹性蛋白赋予橡胶类似性质。上述“皮肤弹性改善”是指由弹性蛋白形成的弹性纤维与胶原蛋白一同存在，在上述弹性蛋白和胶原蛋白充分存在的状态下，维持或提高皮肤弹性的现象。上述“包含…作为有效成分的”可指包含可呈现脱发防止、生发促进或皮肤改善效果，例如，可呈现与毛发生长功效相关的wnt活性促进、与皱纹改善功效相关的胶原蛋白合成或弹性改善等的程度的有效量。根据本发明的又一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的化妆品组成或皮肤外用剂组合物。上述皮肤外用剂或化妆品组合物可通过常规方法进行剂型化。在皮肤外用剂的剂型化中，可参照remington'spharmaceuticalscience,mackpublishingcompany,eastonpa中揭示的内容，在化妆品组合物的剂型化中，可参照internationalcosmeticingredientdictionary,6thed.,thecosmetic,toiletryandfragranceassociation,inc.,washington,1995中揭示的内容。上述皮肤外用剂或化妆品组合物可包含通常可接受的载体，例如，可适当调配油分、水、表面活性剂、保湿剂、低级醇、增粘剂、螯合剂、色素、防腐剂、香料等，但不局限于此。并且，上述组合物还可包含可调配于一般的头皮及毛发用外用剂的基剂成分，具体地，可包含溶解助剂、表面活性剂、保湿剂、粘增剂、ph调节剂、防腐剂、抗氧化剂、金属离子螯合剂、杀菌剂、抗炎剂、抗微生物剂、溶剂、着色剂或着香剂等。另一方面，上述组合物可作为乳液、乳霜、糊剂、啫喱、化妆水、面膜、护肤液、粉饼、喷剂、香皂等的毛发处理用组合物进行剂型化，具体地，可由选自由爽发水、护发液、发膏、定发剂、发用摩丝、发胶、发皂、洗发水、护发素、发膜及焗油膏组成的组中的一种以上进行剂型化，具体地，能够以液态型洗发水进行剂型化。在上述剂型中，除了上述的必要成分之外，其他成分可根据其他外用剂的用途或使用目的由本发明所属
技术领域：
的普通技术人员适当地选定来进行调配。例如，当上述组合物的剂型为糊剂、乳霜或啫喱时，作为载体成分，可使用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。当上述组合物的剂型为粉饼或喷剂时，作为载体成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉饼，尤其，追加地，还可包含氯氟碳氢化合物、丙烷、丁烷或二甲基醚之类的推进剂。当上述组合物的剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成分，可使用溶剂、溶剂化剂或乳化剂，例如，可使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或山梨糖醇酐的脂肪酸酯。当上述组合物的剂型为悬浮液时，作为载体成分，可使用水、乙醇或丙二醇之类的液态稀释剂、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯之类的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。只是，上述助剂及其混合比率可适当选择，以防止对本发明的产品的优选性质产生影响。根据本发明的又一实施方式，提供包含上述肽或上述肽结构体作为有效成分的脱发预防或治疗用药学组合物。上述“预防”是指减少病理学现象的产生频率或程度的所有行为。预防可以完整或部分。此时，可指个体内的脱发症状与不使用上述组合物的情况相比，减少的现象。上述“治疗”是指为了变更要治疗的对象或细胞的天然过程而临床上介入的所有行为，可在临床病理状态进行的期间或为了预防其而执行。目的的治疗效果可包括预防疾病的产生或复发，或缓解症状，或降低疾病引起的所有直接或间接的病理学结果，或预防转移，或减少疾病进行速度，或减轻或临时缓解疾病状态，或改善预后。上述组合物能够以口服传递、非口服传递的形态进行给药。上述组合物能够以全身或局部的方式进行给药，上述给药可包括口服给药及非口服给药。上述组合物可与适当量的药学上接受的赋形剂或载体一同进行剂型化，以提供适当的给药形态。上述组合物还可包含药学组合物的制备中使用的载体、赋形剂及稀释剂。作为上述载体、赋形剂及稀释剂，可例举乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油，但不局限于此。并且，上述组合物能够以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等的口服型剂型、外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态进行制剂化来使用。用于口服给药的固体制剂可使用片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，上述固体制剂可通过在上述化合物和其分馏物混合一种以上的赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶等来进行调配。并且，除了上述赋形剂之外，可使用硬脂酸镁、滑石之类的润滑剂。用于口服给药的液体制剂可使用悬浮剂、内服溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了作为单纯稀释剂的水、液体石蜡之外，可使用多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等。用于非口服给药的制剂可使用灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂、栓剂。上述非水性溶剂、悬浮剂可使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油、油酸乙酯之类的可注射的酯。作为上述栓剂的基剂，可使用威泰索尓(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂酯(laurinum)、甘油明胶。上述药学组合物能够以药剂学上有效的量向对象进行给药。上述“药剂学上有效的量”是指以可适用于医学治疗的合理受益/危险比率治疗疾病的充分量，有效容量水平可根据包括患者的疾病的种类、重症度、药物的活性、对于药物的敏感度、给药时间、给药途径及排出比率、治疗期间、同时使用的药物的因素及其他医学领域中众所周知的因素而确定。上述药学组合物可利用个别治疗剂来进行给药，或与其他治疗剂并用来进行给药，可与以往的治疗剂依次或同时进行给药，能够以单一或多重的方式进行给药。优选地，能够以均考虑上述因素而在无副作用的情况下以最少量获得最大效果的量进行给药，这可由本发明所属
技术领域：
的普通技术人员容易确定。通过以下实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不局限于以下实施例，这是显而易见的。制备例：肽的制备将链接酰胺甲基二苯甲基胺树脂(147mg，0.1mmol)放入3ml的二甲基甲酰胺(dmf)无水(anhydrous)有机溶剂中，并膨润约30分钟。在1.5ml的二甲基甲酰胺无水有机溶剂中添加及混合0.3mmol的fmoc-lys(boc)-oh(141mg)、作为羧基活性剂的n，n-二异丙基碳二亚胺(dic，n,n-diisopropylcarbodiimde，48μl)及作为添加助剂的n-羟基苯并三唑(hobt，n-hydrobenzotriazole，40mg)来使它们激活约20分钟。将激活的溶液和树脂搅拌2小时进行反应之后，对反应溶液进行过滤，并利用二甲基甲酰胺和甲醇多次清洗树脂之后，执行茚三酮检测(kaisertest)。当茚三酮检测显示为阳性时，制备上述的激活溶液来进行添加。当测试结果为阴性时，与以20重量百分比浓度溶解于二甲基甲酰胺溶剂的3ml的哌啶溶液进行混合，并反应约15分钟来去除n-末端的fmoc组之后，以相同的方法将下一顺序的氨基酸激活，从而与结合于固体状树脂的氨基酸进行反应。最后序列的氨基酸部分的合成结束之后，利用20重量百分比的哌啶/二甲基甲酰胺来去除n-末端的fmoc组，并利用二甲基甲酰胺和甲醇来数次清洗树脂之后，进行干燥。与树脂相结合的肽在常温条件下与裂解(cleavage)溶液(三氟乙酸(trifluoroaceticacid，80％)、三异丙基硅烷(triisopropylsilane，5％)、苯甲硫醚(thioanisole，5％)、1,2-乙二硫醇(1,2-ethanedithiol，5％)、水(5％))进行反应来去除(4hr)氨基酸的侧链(sidechain)保护基(protectiongroup)，并从树脂(resin)中分离肽。吹入氮气来去除肽溶液的三氟乙酸(trifluoroaceticacid)，并添加以-20℃冷却的二乙醚(diethylether)之后，利用离心分离器(3000rpm，20分钟)来分离沉淀的肽。获取的肽利用反相高效液相色谱仪(hplc)(c-18柱c18-120a，50mm*250mm)进行纯化(eluent：0.1％的反式脂肪酸(tfa)(梯度，gradient)中的水/乙腈(water/acetonitrile)：流速(flowrate)50ml/分钟)。利用esi-mass质量分析仪来确认1308分子量的物质。根据上述方法来合成的肽如下列表1。[表1]实验例1：毛乳头细胞增殖促进效果的评价为了分析对于合成例中合成的序列肽的天然卵泡抑素抑制功效及激活素活性功效，利用mtt染色法来测定人类表皮角质细胞(humanepidermalkeratinocytes，hek)、人类真皮成纤维细胞(normalhumandermalfibroblasts，nhdf)、人类毛乳头细胞(humandermalpapilla，hdp)的细胞生长能力。将分别包含10％胎牛血清(fbs)的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dmem，dulbecco’smodifiedeagle’smedium，美国吉毕科(gibco，u.s.a))作为培养基，在37c温度且5％的co2条件下的培养箱中培养人类表皮角质细胞(lonza，switzerland)及人类真皮成纤维细胞、人类毛乳头细胞。利用1％的胰蛋白酶溶液在培养容器底面分离培养的细胞株之后进行离心分离，从而获取细胞沉淀物。在不包含胎牛血清(fbs)的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基培养液中重新悬浮之后，以各孔成为3×103细胞的方式放入96-孔组织培养用平板，并在37℃温度且5％的co2条件下培养24小时。经过24小时之后，以完全除了血清之外的相同的培养液交换培养基之后，以灭菌状态将用于确定标准的空试料和合成肽溶解于10％的二甲基亚砜(dmso)之后，以1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml的浓度以与上述相同的条件培养48小时。培养结束之后，利用包的mtt来测定生存率(viability)。将上述实施例的处理肽(10μg/ml)的各个细胞和未做任何处理的细胞(阴性对照组)的细胞增殖率进行比较，并将基于此的相对数值示于下列表2中。[表2]参照图2，可知实施例8的肽以浓度依赖的方式促进角质细胞、成纤维细胞、毛囊细胞的生长。参照图3，可知形成通过毛乳头细胞三维立体培养的毛乳头球体(sung,j.invest.dermatol.2012,132；237)，实施例8的肽有效促进毛囊细胞的生长及形态学毛乳头球体自形成。上述结果启示实施例的肽促进人类毛乳头细胞的增殖，且生发或脱发防止效果优秀。并且，启示上述肽不仅对皮肤或人体的稳定性优秀，还有效促进合成胶原蛋白的成纤维细胞的生长，且可作为皮肤美容，尤其，皮肤皱纹改善的用途来应用。实验例2：基因表达量的评价对培养的人类毛乳头细胞将实施例的肽进行处理，经过48小时之后，测定作为由卵泡抑素调节的激活素的信号的smad2的磷酸化量和毛发的生长因子的表达量。利用phospho-smad2抗体(abcam)及β-连环蛋白(β-catenin)抗体(abcam)来执行免疫印迹法，对于作为利用激活素来激活的毛发生长因子的fgf7、wnt5a、lef1、vcan的表达，通过实时逆转录-聚合酶链式反应(real-timert-pcr)评价生长因子的表达量，并将结果示于下列表3中。[表3]区分vcanmrnafgf7mrnawnt5amrnalef1mrna实施例12.02.51.42.7实施例22.12.41.52.6实施例32.02.51.42.8实施例41.92.61.52.7实施例52.12.71.33.0实施例61.92.61.42.7实施例72.22.51.52.9实施例82.33.01.63.3参照图4，当在细胞内天然卵泡抑素的表达得到维持的状态下处理实施例8的肽结构体时，确认到smad2的磷酸化通过激活素的激活增加，作为毛发的生长的主要因子的β-连环蛋白的表达增加。参照图5，当处理实施例8的肽结构体时，确认到作为毛乳头中生成的毛发生长因子的fgf7、wnt5a、lef1、vcan的表达增加。上述结果启示不仅具有实施例的肽非常优秀的生发促进及脱发抑制功能，且抗老化效果也优秀。实验例3：蛋白聚糖(versican)表达量的评价评价实施例的肽是否增加作为毛乳头细胞球体自组装活性因子的蛋白聚糖的表达。以各孔成为1×104细胞的方式将毛乳头细胞放入96-孔低附着性组织培养平板，并在37℃温度且5％的co2条件下培养48小时。当放入细胞时，添加以灭菌状态将用于确定标准的空试料及实施例8的肽结构体溶解于10％的二甲基亚砜的培养基。参照图6，确认到48小时之后将毛乳头细胞球体固定于2％的甲醛(formaldehyde)、磷酸盐缓冲液(pbs)，并执行免疫荧光染色法，并确认到细胞内蛋白聚糖的表达的增加。上述结果启示利用实施例8的肽结构体来激活的自组装活性因子促进毛乳头球体自组装，由于实施例的肽，毛乳头细胞的毛发生长促进因子活性增加，可实现生发促进及脱发抑制的效果。实验例4：生发促进活性的评价去除毛发处于休止期的出生约50天的小鼠(c57bl/6)的毛发之后，评价实施例及比较例的毛发生长促进效果。在本实验中，按每组10只，将体重、大小等特性类似的小鼠分为9组之后，个别饲养来测定毛发的生长程度。涂敷包含实施例的肽的溶液之后，饲养30天，并分离在除毛部位生长的毛发来测定重量。将涂敷磷酸化缓冲溶液的小鼠设定为对照组来更明确评价基于肽的毛发生长促进效果。测定结果如下列表4。[表4]区分毛发重量(mg)实施例1194.1±10.1实施例2195.7±11.2实施例3193.2±11.5实施例4188.3±10.6实施例5193.4±11.4实施例6196.5±12.1实施例7194.9±11.4实施例8212.1±12.2对照组69.5±4.5参照图7，观察涂敷实施例8的肽结构体的小鼠的背部位，其结果，用肉眼确认到经过10天之后，背部位变黑，涂敷经过15天之后，与阴性对照组相比，有大量的毛发生长。即，基于实施例的肽的毛发生长促进效果非常优秀，因而评价为可增进毛发健康，并抑制脱发。实验例5：胶原蛋白生物合成诱导试验确认到胶原蛋白的合成是否根据成纤维细胞的生长而促进。以1.0×104细胞/ml的浓度，将每100μl的人类真皮成纤维细胞分注于96孔板，并在37℃温度且5％的co2加湿条件下培养3天。使用每孔100μl的培养基(medium)106s(kurashikiboshiki公司制备)中包含10重量百分比的低血清生长补充剂(lsgs，lowserumgrowthsupplement，kurashikiboshiki公司制备)的培养基。将上述培养基交换为达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dmem，dulbecco'smodifiedeagle'smedium，西格玛(sigma)公司制备)，并以50mg/l的浓度处理上述肽之后进行培养。将不处理上述肽而添加纯化水的情况作为对照组。将上述细胞培养7天之后，采集培养液，并通过酶结合免疫测定法(前胶原i型c-肽eia试剂盒，procollagentypeic-peptideeiakit，takara生物公司制备)定量培养液中分泌的i型胶原蛋白浓度。以对照组的i型胶原蛋白量为基准(100％)计算出各个试验样品培养液中的胶原蛋白量，测定结果如下列表5。[表5]区分胶原蛋白生产量(％)实施例1185.1实施例2179.5实施例3182.2实施例4184.8实施例5182.4实施例6185.7实施例7183.1实施例8189.5对照组100[对照组％]上述结果启示由上述实施例的氨基酸序列形成的肽不仅毛发生长促进效果优秀，皮肤弹性改善及皮肤皱纹改善效果也优秀。实验例6：层粘连蛋白及透明质酸生成促进效果试验用上述实施例1及实施例2的肽处理培养48小时的hacat细胞，经过72小时之后，测定作为皮肤皱纹改善的标记的层粘连蛋白及透明质酸的浓度。此时，浓度测定利用层粘连蛋白酶联免疫吸附实验(lamininelisa)试剂盒及透明质酸酶联免疫吸附实验(hyaluronicacidelisa)试剂盒来实施。即，比较处理实施例的肽的hacat细胞和未做任何处理的hacat细胞(阴性对照组)的层粘连蛋白和透明质酸的浓度，并将基于此的相对数值示于下列表6中。[表6]参照表6，当处理实施例的肽时，层粘连蛋白和透明质酸的浓度与阴性对照组相比都显著地增加。上述结果启示实施例的肽的皱纹改善效果卓越，从而可呈现整个皮肤状态改善效果。上述的本发明的说明用于例示，本发明所属
技术领域：
的普通技术人员应当理解，在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下，能够以其他具体的形态容易变形。因此，应理解为以上记述的多个实施例在所有方面是例示性的，而非限定。例如，以单一型说明的各个结构要素能够以分散的方式实施，同样，说明分散的多个结构要素也能够以结合的形态实施。本发明的范围由所附的发明要求保护范围表示，应解释为从发明要求保护范围的含义及范围以及其等同概念导出的所有变更或变形的形态包括在本发明的范围。序列目录(自由文本)序列序号1：来源于卵泡抑素的生物活性肽1序列序号2：来源于卵泡抑素的生物活性肽2序列序号3：来源于卵泡抑素的生物活性肽3序列序号4：来源于卵泡抑素的生物活性肽4序列序号5：来源于卵泡抑素的生物活性肽5序列序号6：来源于卵泡抑素的生物活性肽6序列序号7：来源于卵泡抑素的生物活性肽7<110>株式会社臻世纺<120>来源于卵泡抑素的生物活性肽及其用途<130>17pp11089<160>7<170>kopatentin3.0<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>seqidno.1<400>1glyasncystrpleu15<210>2<211>5<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>seqidno.2<400>2glyasnmettrpleu15<210>3<211>5<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>seqidno.3<400>3glyasnsertrpleu15<210>4<211>5<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>seqidno.4<400>4asnthrleuphelys15<210>5<211>10<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>seqidno.5<400>5glyasncystrpleuasnthrleuphelys1510<210>6<211>10<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>seqidno.6<400>6glyasnmettrpleuasnthrleuphelys1510<210>7<211>10<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>seqidno.7<400>7glyasnsertrpleuasnthrleuphelys1510当前第1页12