一种复合生化制剂及其在铬修复中的应用的制作方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种复合生化制剂及其在铬修复中的应用。

背景技术：

铬属于重金属的一种，是一种人体的非必需元素，它可影响神经、造血、生殖和发育、内分泌、免疫、骨骼等各类系统和器官。全世界平均每年排放约500万吨铬，其中大部分进入土壤，致使世界各国土壤出现不同程度的铬污染。随着工农业的发展和含铬化学物质的广为应用，铬在矿产开采、电镀冶金、废物处理处置等过程中，大量含铬污染物进入土壤环境，造成世界范围内土壤中铬污染现象普遍存在。铬对人类健康的危害很大，能对神经、心血管和内分泌等个系统造成危害，甚至危及生命。因此铬污染土壤的治理及修复受到越来越多的关注。

目前土壤铬污染修复主要修复途径有三种：物理修复、化学修复和生物修复。物理修复具有彻底、稳定的优点，但实施工程量大、投资费用高，破坏土壤结构，并且还要对换出的污土进行堆放或处理。化学修复虽然简单易行，见效快，但往往修复剂用量较大，且重金属元素易活化。生物修复则包括植物修复和微生物修复，其中植物修复虽然标本兼治，但修复周期长，投资大。微生物修复虽然处理费用低、对周边环境扰动小、不产生二次污染，但合适微生物资源少，修复周期长，无法对重金属进行有效地固定吸附，修复效果并不明显。现有专利技术“CN102101123A,一种重金属污染土壤的原位修复方法”，其对重金属进行了固定，但是原料成本较高，处理周期较长；专利技术“CN102909215A，化学喷淋与生物修复相结合修复重金属污染土壤的方法”，其采用化学和生物技术结合的方式，主要采用化学喷淋进行螯合反应，然后采用生物修复残留，其需要采用特定的操作仪器，工艺复杂繁琐，推广效果较差。

技术实现要素：

为了克服现有技术中修复铬污染土壤工艺的缺陷，本发明提供了一种复合生化制剂及其在铬修复中的应用。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种复合生化制剂，其包括成晶节杆菌、荚膜红细菌、希瓦氏菌以及柠檬色短小杆菌。

进一步地，

所述复合生化制剂按照如下步骤制备而得：步骤1）制备颗粒物，步骤2）制备固定载体，步骤3）制备复合菌液，步骤4）制备生化制剂。

进一步地，

所述复合生化制剂按照如下步骤制备而得：

步骤1）制备颗粒物：将腐植酸、草炭土、锯末、尿素、碳酸氢钠和水按照5:3:3:1:1:10的质量比混合，搅拌均匀，再升温至55-60℃，保温30-40min，然后添加到造粒机中进行造粒，制得粒径为3mm的颗粒物；

步骤2）制备固定载体：将颗粒物添加到2-3倍重量的壳聚糖溶液中，100rpm搅拌60min，然后静置10-20min，过滤收集截留物，70-80℃烘干至水分含量为5-10wt%，得到固定载体；

步骤3）制备复合菌液：将成晶节杆菌、荚膜红细菌 、希瓦氏菌以及柠檬色短小杆菌分别培养成浓度为1×10⁸个/ml的菌液，再按照5-7:3-5:3-5:2-3的体积比混合得到复合菌液；

步骤4）制备生化制剂：将固定载体与复合菌液混合搅拌均匀，最后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为8-10wt％，即得生化制剂。

优选地，

所述壳聚糖溶液的制备方法为：称取1g壳聚糖，加入到400ml水中，然后添加20ml质量分数为20%的硝酸溶液，搅拌均匀，加水定容至1000ml，即得。

优选地，

所述步骤4）中，固定载体与复合菌液的质量比为2-3:1-2。

本发明还要求保护上述任其一所述的复合生化制剂在铬修复中的应用。

优选地，

所述铬修复为土壤铬修复。

本发明所述的菌种属于已知菌株，均可以从ATCC等商业途径购买得到。本发明的各菌种的培养步骤为本领域的常规技术，并不是本发明创新点，此处不详述。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

与现有技术相比较，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明固定载体中的壳聚糖是自然界存在的唯一碱性多糖，具有胺基极易形成四级胺正离子，其分子中的氨基和与氨基相邻的羟基与重金属铬能形成稳定的螯合物，具有很好的固定作用；腐殖酸是是自然界来源较为丰富的一种生物质，可以改善土壤以及吸附大量的重金属离子；除了上述组分各自的固定吸附作用外，草炭土以及锯末的加入能很好地改善土壤理化性质，大大增强土壤的通透性；尿素和碳酸氢钠属于造孔剂，二者协同作用，使得颗粒物孔径数目大小合适，通气性能好，有利于菌株富集；本发明固定载体能够有效地固定吸附铬离子，从而有利于菌株的修复；本发明选用四种菌株，配伍合理，共生协调，互不拮抗，形成优势菌群的菌种，与固定载体按照一定比例配制成生化制剂，能够有效地修复铬污染土壤，修复成本低，不会产生二次污染。

说明书附图

图1：生化制剂中菌株配伍对铬污染土壤修复效果的影响；

图2：不同处理时间对铬污染土壤的影响；

图3：载体选择对铬污染土壤修复效果的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种复合生化制剂，其包括成晶节杆菌、荚膜红细菌 、希瓦氏菌以及柠檬色短小杆菌；

具体地，所述复合生化制剂按照如下步骤制备而得：

1）将腐植酸、草炭土、锯末、尿素、碳酸氢钠和水按照5:3:3:1:1:10的质量比混合，搅拌均匀，再升温至55℃，保温40min，然后添加到造粒机中进行造粒，制得粒径为3mm的颗粒物；

2）将颗粒物添加到2倍重量的壳聚糖溶液中，100rpm搅拌60min，然后静置10min，过滤收集截留物，70℃烘干至水分含量为10wt%，得到固定载体；所述壳聚糖溶液的制备方法为：称取1g壳聚糖，加入到400ml水中，然后添加20ml质量分数为20%的硝酸溶液，搅拌均匀，加水定容至1000ml，即得；

3）将成晶节杆菌ATCC15481、荚膜红细菌 ATCC11166、希瓦氏菌ATCC700550以及柠檬色短小杆菌ATCC15828分别培养成浓度为1×10⁸个/ml的菌液，按照5:3:3:2的体积比混合得到复合菌液；

4）将固定载体与复合菌液按照2:1的质量比混合搅拌均匀，最后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为8wt％，即得生化制剂。

实施例2

一种复合生化制剂，其包括成晶节杆菌、荚膜红细菌 、希瓦氏菌以及柠檬色短小杆菌；

具体地，所述复合生化制剂按照如下步骤制备而得：

1）将腐植酸、草炭土、锯末、尿素、碳酸氢钠和水按照5:3:3:1:1:10的质量比混合，搅拌均匀，再升温至60℃，保温30min，然后添加到造粒机中进行造粒，制得粒径为3mm的颗粒物；

2）将颗粒物添加到2倍重量的壳聚糖溶液中，100rpm搅拌60min，然后静置20min，过滤收集截留物，80℃烘干至水分含量为5wt%，得到固定载体；所述壳聚糖溶液的制备方法为：称取1g壳聚糖，加入到400ml水中，然后添加20ml质量分数为20%的硝酸溶液，搅拌均匀，加水定容至1000ml，即得；

3）将成晶节杆菌ATCC15481、荚膜红细菌 ATCC11166、希瓦氏菌ATCC700550以及柠檬色短小杆菌ATCC15828分别培养成浓度为1×10⁸个/ml的菌液，按照7:5:5:3的体积比混合得到复合菌液；

4）将固定载体与复合菌液按照3:2的质量比混合搅拌均匀，最后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为8wt％，即得生化制剂。

实施例3

一种复合生化制剂，其包括成晶节杆菌、荚膜红细菌 、希瓦氏菌以及柠檬色短小杆菌；

具体地，所述复合生化制剂按照如下步骤制备而得：

1）将腐植酸、草炭土、锯末、尿素、碳酸氢钠和水按照5:3:3:1:1:10的质量比混合，搅拌均匀，再升温至55℃，保温40min，然后添加到造粒机中进行造粒，制得粒径为3mm的颗粒物；

2）将颗粒物添加到2倍重量的壳聚糖溶液中，100rpm搅拌60min，然后静置10min，过滤收集截留物，75℃烘干至水分含量为7wt%，得到固定载体；所述壳聚糖溶液的制备方法为：称取1g壳聚糖，加入到400ml水中，然后添加20ml质量分数为20%的硝酸溶液，搅拌均匀，加水定容至1000ml，即得；

3）将成晶节杆菌ATCC15481、荚膜红细菌 ATCC11166、希瓦氏菌ATCC700550以及柠檬色短小杆菌ATCC15828分别培养成浓度为1×10⁸个/ml的菌液，按照6:4:3:2的体积比混合得到复合菌液；

4）将固定载体与复合菌液按照1:1的质量比混合搅拌均匀，最后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为9wt％，即得生化制剂。

实施例4

本发明生化制剂中菌株配伍对铬污染土壤的修复试验：

设置组别：实验组为实施例1组；对照组1（不添加成晶节杆菌，其他同实施例1），对照组2（不添加荚膜红细菌，其他同实施例1），对照组3（不添加希瓦氏菌，其他同实施例1），对照组4（不添加柠檬色短小杆菌，其他同实施例1）；

样品选择：含六价铬分别为10、50、100mg/kg的土壤样品；取上述样品置于容器中，每个容器装有样品1000kg，每个容器的生化制剂添加量为200g，搅拌均匀，然后加水至土壤水分含量在30-50wt%，温度控制在25-30℃，处理时间为6天；然后将土壤样品烘干至处理前的土壤样品水分含量，测定六价铬的含量。如图1所示，在低浓度的铬污染组，实验组能够将六价铬离子完全去除，修复效果明显优于对照组1-4；在中高浓度组，实验组的修复效果也大大优于仅使用三种菌株配伍的对照组1-4；提示本发明生化制剂中选择的四种菌株配伍合理，相互促进，具备较好的协同性能，能够有效修复不同浓度的铬污染。如图2所示，随着修复时间的增加，在修复前期，六价铬浓度降幅并不明显，修复4天后，六价铬浓度降低明显，修复6天后，铬离子降低到5.9mg/L，8天后为0.8mg/L，本发明生化制剂几乎对高浓度铬污染实现了完全去除。

实施例5

不同载体的选择对铬污染土壤修复效果的影响：

样品选择：含六价铬为100mg/kg的土壤样品；

组别：实验组为实施例2组；对照组1（载体选用硅藻土，其他同实施例2），对照组2（载体选用锯末，其他同实施例2），对照组3（载体选用草炭土，其他同实施例2），对照组4（不使用载体，使用等量的复合菌液处理污染土壤，其他同实施例2）；

操作流程同实施例4；如图3所示，实验组和对照组1-4均可以修复高浓度铬污染土壤，通过比较发现，实验组的修复效果最佳，原因可能是实验组使用的固定载体具备较好的固定吸附铬离子的功能，从而有利于菌株的修复，而且实验组的固定载体具备一定数目的孔径，通气性能好，有利于菌株富集增殖；而硅藻土、锯末以及草炭土等常规载体对菌株的富集效果差，对重金属也没有明显的固定吸附功能。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。