本发明属于微生物发酵工程领域，涉及一种能够有效降低发酵中恶臭气味的新型红霉素生产菌株及其应用。
背景技术：
红霉素是由链霉属红色糖多孢菌(saccharopolysporaerythraea)产生的次级代谢产物，是一类抗革兰氏阳性菌的广谱十四元大环内酯类抗生素。根据侧链基团的不同，将红霉素分为六种，分别为红霉素a、红霉素b、红霉素c、红霉素d、红霉素e和红霉素f。其中红霉素a是临床上最常用的药用成分，而b、c、d组分是红霉素a合成过程中的中间产物。红霉素b的生物活性比红霉素a低，但毒性却是红霉素a的两倍。红霉素e和f是两种天然产物，含量很少，活性很低，研究较少[mironovvetal,appl.biochem.microbiol.2004；andzouxetal,jindmicrobiolbiotechnol,2008]。美国elililly公司在1952年从红色糖多孢菌发酵液中分离得到红霉素a，开发出第一代大环内酯类抗生素红霉素，上市之后，红霉素成为当时治疗革兰氏阳性细菌感染的重要药物。目前为止，红霉素仍然是一种临床常用的抗生素，对于一些常见的细菌感染类疾病具有非常有效的治疗效果。以红霉素a为前体合成的第二、三代红霉素衍生物也已经被广泛应用于临床。
红霉素在临床上的广泛使用，大大增加了对红霉素原料的供应需求，从而推动了整个红霉素产业的发展。目前，我国是世界最大的红霉素生产和出口国，年产量超过9000吨。红霉素原料药主要依靠菌株发酵生产。由于近年来基因组学与蛋白组学的发展，结合国内研究者多年的微生物育种筛选，国内红霉素的发酵生产能力有了一定的提高，但与国外较高的生产水平相比仍然存在提高空间。
同时，随着近年来企业和民众环保意识的提高，红霉素生产中所伴随的发酵尾气恶臭气味问题也越来越受到人们的重视。目前去除恶臭气味的主要方法包括采用生化或物理的方法对尾气进行处理和降解。
樊晓宇等(樊晓宇，医药工程设计，34(4)，2013年)使用臭氧与硫氰酸红霉素生产尾气进行混合氧化反应，随后进入uv照射室，臭氧经紫外照射分解产生羟基自由基，在湿式氧化塔内羟基自由基氧化发酵尾气挥发性有机物vocs，降解成co2、h2o和微量的有机酸，再进入喷淋洗浆塔，洗涤净化，对微量有机酸用水吸收后排放，洗涤后发酵尾气无污染排空。上述方法消除红霉素发酵尾气的苦涩气味效果明显。
伊犁川宁生物技术有限公司(经济观察者网，2016-4-25)采用分子筛、疏水性活性炭、高温热氧化燃烧等集成技术，对尾气进行系统性的处理；同时通过“生化处理+mvr深度处理及回用”工艺技术净化污水，并循环利用，减少排放；对固体废弃物进行无害化处理和资源化利用，解决了发酵生产过程带来的尾气异味等问题。
张志宏等(张志宏等，河南师范大学学报，37(5)，2009)以白地霉、地衣芽胞杆菌、假丝酵母、乳酸菌、光合菌制备复合微生物菌剂,对红霉素菌渣进行固态发酵，去除了红霉素菌渣中特殊异味。
上述针对红霉素发酵尾气、废料、污水进行理化处理的方式虽然去除了恶臭气味，但大大增加了红霉素的生产成本。而通过菌株改造和驯化，减弱和消除红霉素生产菌株自身产生恶臭气味的能力，无疑是解决上述问题的根本方法。目前，国内外尚未见能够解决红霉素菌株自身发酵恶臭气味问题且适宜工业化生产的优良菌株和发酵技术。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种能够有效降低发酵中恶臭气味的红霉素生产菌株及其应用。
本发明一个方面提供一种红色糖多孢菌(saccharopolysporaerythraea)，其名称为klcndx-01，保藏编号为cctccno:m2017647；或名称为klcndx-02，保藏编号为cctccno:m2017648。
本发明另一个方面提供由保藏编号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01培养得到的红色糖多孢菌；或由保藏编号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02培养得到的红色糖多孢菌。
本发明另一个方面提供一种红色糖多孢菌，其具有保藏编号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏编号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02的鉴定特征。
本发明另一个方面提供一种红色糖多孢菌培养物，其中含有保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02，或其中含有具有klcndx-01或klcndx-02鉴定特征的菌株。
在某些优选的实施方案中，本发明红色糖多孢菌培养物为生物学纯培养物，其由菌株klcndx-01或klcndx-02培养获得；或所述生物学纯的培养物具有klcndx-01或klcndx-02培养物的鉴定特征。
本发明另一个方面提供一种红色糖多孢菌或其培养物，所述红色糖多孢菌由保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02衍生获得。
在优选的实施例中，本发明红色糖多孢菌相对于衍生前具有同等或更高的红霉素生产能力，和/或在培养或发酵中不产生或产生更少的恶臭气味。
本发明另一个方面提供一种红色糖多孢菌，其与klcndx-01或klcndx-02具有相同的或基本相同的基因组序列，所述基本相同的基因组序列指菌株基因组内仅存在自然条件下增殖传代中发生的自发突变。在优选的实施方案中，所述红色糖多孢菌与klcndx-01或klcndx-02具有基本相同的红霉素生产能力和/或在培养或发酵中不产生或少产生恶臭气味能力。在优选的实施方案中，所述红色糖多孢菌基因组序列与klcndx-01或klcndx-02具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
本发明另一方面提供一种发酵方法，其以保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02进行发酵。
在某些实施方式中，本发明的发酵方法包括将低温保存的菌株孢子进行斜面培养，再将斜面培养获得的孢子悬浮液经多级种子罐培养，最终接入发酵罐中发酵。
在某些实施方式中，所述斜面培养包括母斜面培养和子斜面培养；所述多级种子罐培养为一级种子罐培养，或两级、三级或更多级种子罐连续培养。优选的，所述种子罐培养为三级培养。
在某些实施方式中，本发明的发酵方法中菌株的培养温度为28-37℃，优选30-35℃。
在某些实施方式中，本发明的发酵方法包括如下步骤：(1)红霉素种子液培养：①母斜面孢子制备：将冷冻保存在砂土管中的红霉素链霉菌孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度32-34℃条件下，培养7-9天；②子斜面孢子制备：将母斜面孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度32-34℃条件下，培养7-9天；③种子培养：将子斜面孢子，接种于灭菌的液体种子培养基中，经过三级种子扩大培养，得到红霉素种子液；(2)红霉素发酵：将红霉素种子液按10-20％体积比接种于灭菌的培养基中，通入无菌空气并开启搅拌，添加营养物质，在温度32-34℃条件下，培养7-10天，得红霉素发酵液。
在某些实施方式中，本发明的斜面培养基包括如下组分：淀粉0.1-1.0重量份，玉米浆0.05-0.2重量份，琼脂0.1-1.0重量份，葡萄糖0.1-1.0重量份，氯化钠0.5-2.0重量份，氯化钙0.1-1.0重量份，用自来水定容到100体积份。
在某些实施方式中，本发明一级种子扩大培养条件为：(1)培养基组成：黄豆粉2-4重量份，淀粉1-2重量份，caco30.6-0.8重量份，糊精1-2重量份，硫酸铵0.2-0.4重量份，玉米浆1-4重量份，植物油0.5-1重量份，用自来水定容到100体积份；(2)温度为32-34℃；(3)培养时间48-96小时。
在某些实施方式中，本发明所述的二、三级种子扩大培养条件为：(1)培养基组成：黄豆粉2.0-4.5重量份，淀粉2.5-4.0重量份，caco30.5-0.7重量份，氯化钠0.4-0.6重量份，糊精2.5-4.0重量份，硫酸铵0.1-0.3重量份，玉米浆1-2重量份，植物油0.8-1.5重量份，消沫剂0-0.02重量份，用自来水定容到100体积份；(2)温度为32-34℃；(3)培养时间24-48小时。
在某些实施方式中，本发明的发酵培养基组成：黄豆粉3.5-5.5重量份，淀粉2.0-4.0重量份，硫酸铵0.08-0.15重量份，caco30.6-1.0重量份，植物油0.5-1.0重量份，消沫剂0.005-0.02重量份，用自来水定容到100体积份。
在某些实施方式中，本发明所述的添加营养物质组成为：20-70％葡萄糖溶液10-50重量份，植物油1-10重量份，正丙醇溶液0.5-5重量份。
在某些实施方式中，本发明所述的植物油包括花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、香油、葵花籽油、橄榄油、莪术油、大蒜油、沙棘油、当归油、生姜油、连翘油、紫苏油、陈皮油、蓖麻油、薄荷油、肉豆蔻油中的任一种；优选为大豆油，菜籽油中的任一种。
在某些实施方式中，本发明所述的正丙醇溶液为20-70％正丙醇溶液；本发明所述的消沫剂为聚醚类消沫剂；优选的，本发明所述的聚醚类消沫剂为聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油中的任一种。
本发明另一方面提供一种生产红霉素或硫氰酸红霉素的方法，包括将保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02进行发酵，得到红霉素发酵液。
在某些实施方式中，本发明红霉素的生产方法包括：1)培养本发明的微生物以获得细胞培养物；和2)从细胞培养物或微生物收集红霉素发酵液，通过对红霉素发酵液进行处理获得红霉素或硫氰酸红霉素成品。
在某些实施方式中，本发明红霉素的生产方法包括：将红霉素生产菌株发酵液通过陶瓷膜过滤，菌渣经环保处理，滤液经进一步纳滤、结晶、干燥，获得红霉素产品。
在某些实施方式中，本发明硫氰酸红霉素的生产方法包括：将红霉素发酵液通过陶瓷膜过滤，菌渣经环保处理，滤液经过纳滤膜进行浓缩得到红霉素浓缩液，向浓缩液中加入适量硫氰酸钠溶液，结晶得到硫氰酸红霉素粗品，通过二次结晶、干燥获得硫氰酸红霉素成品。
在某些实施方式中，本发明硫氰酸红霉素的生产方法包括如下步骤：
(1)发酵液浓缩：将红霉素发酵液调ph为7.5-9.0，采用50nm-100nm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩,得到红霉素浓缩液；
(2)结晶：将红霉素浓缩液置于结晶罐,加入适量5～20％硫氰酸钠溶液，调ph为5.5～7.0,结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品；在硫氰酸红霉素粗品中加入适量丙酮，调ph为9.5～10.5，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置；取丙酮溶液，加入适量硫氰酸钠溶液，调ph至5.5～7.5，按溶解液体积的1～3倍加入45～60℃纯化水，控制结晶温度20-35℃，搅拌10分钟，静置降温0.5～2小时，离心获得硫氰酸红霉素湿品,进一步通过丙酮、45～60℃纯化水淋洗,离心分离直到母液排出,干燥,得硫氰酸红霉素成品。
本发明另一方面提供保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02在生产红霉素中的应用。
本发明另一方面提供一种降低红霉素发酵生产中恶臭气味的方法，所述方法包括以保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02进行发酵生产红霉素。
在某些优选的实施方式中，本发明降低红霉素发酵生产中恶臭气味的方法还包括对发酵产生的尾气、废水和/或废渣进行处理，降低其中的恶臭气味。
在某些优选的实施方式中，本发明对发酵产生的尾气、废水和/或废渣进行处理的方法包括采用物理和/或化学的方法处理尾气、废水和/或废渣，降低其中的恶臭气味。
在某些优选的实施方式中，所述物理的方法包括：吸附法(如：采用疏水性活性炭、硅胶、活性氧化铝、沸石分子筛等吸附)、等离子体法等。
在某些优选的实施方式中，所述化学的方法包括：吸收法(如：碱水吸收)、燃烧法(如：直接燃烧法、催化燃烧法、热力燃烧法)、光催化氧化等。
红色糖多饱菌在发酵过程中会形成特征性尾气，但由于发酵气体多为多种异味气体的混合物，不容易识别，因此需要一种红色糖多饱菌的标准发酵尾气作为参照，来识别发酵气体中是否存在红色糖多饱菌发酵产生的特征性尾气。
本发明另一方面提供一种应用，将保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02的发酵尾气用作标准发酵尾气，应用于红色糖多孢菌发酵特征性尾气的识别。
本发明另一方面提供保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02在红色糖多孢菌发酵特征性尾气识别中的应用。
本发明另一方面提供一种红色糖多孢菌发酵特征性尾气的识别方法，以保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02的发酵尾气作为标准发酵尾气，识别红色糖多孢菌发酵特征性尾气。
本发明另一方面提供一种红色糖多孢菌标准发酵尾气，该尾气由保藏号为cctccno:m2017647的菌株klcndx-01或保藏号为cctccno:m2017648的菌株klcndx-02发酵收集获得。
在某些实施方式中，红色糖多饱菌发酵产生尾气的识别可参照gb/t14675-93《空气质量-恶臭的测定-三点式比较式臭袋法》方法进行。本发明的红色糖多孢菌标准发酵尾气可用于嗅辨员的技术培训或嗅辨员的嗅辨识别，使嗅辨员了解红色糖多孢菌发酵特征性尾气的气味特性，提高对相应尾气的嗅辨能力。本发明的红色糖多孢菌标准发酵尾气和特征性尾气的识别方法，也可用于非专业嗅辨人员识别红色糖多孢菌发酵特征性尾气或辨别红色糖多孢菌发酵尾气。
本发明的红色糖多孢菌klcndx-01和klcndx-02由红霉素工业化生产中使用的红色糖多孢菌经基因改造和驯化育种获得，所述菌株的菌落呈菊花型，菌苔色素呈鼠灰色，基内菌丝色素呈红褐色。所述菌株相对于改造和驯化前的原始菌株有效降低了红霉素发酵生产中恶臭气味的产生。同时，改造后的驯化育种进一步提高了红霉素的生产能力，klcndx-01为基因改造后菌株经两代驯化获得，klcndx-02为进一步传代驯化到第四代获得。其中klcndx-01比驯化前菌株摇瓶效价提高了64％，klcndx-02比驯化前菌株摇瓶效价提高了67.8％；两菌株相对于基因改造前的生产菌株红霉素生产能力提高了14-16.7％。
本发明的红色糖多孢菌klcndx-01和klcndx-02在发酵过程中，种子罐和发酵罐的尾气排放能够达到直排标准，减少了发酵尾气的处理成本。同时，由于尾气直排，从而可以减轻发酵尾气管道系统压力，减少染菌风险。
综上，本发明菌株即解决了发酵生产中的恶臭气味问题又提高了红霉素的生产能力，具有非常重大的工业生产价值和环保价值。
生物材料保藏
本发明的红色糖多孢菌(saccharopolysporaerythraea)klcndx-01已于2017年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc，地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctccno:m2017647。
本发明的红色糖多孢菌(saccharopolysporaerythraea)klcndx-02已于2017年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc，地址：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为ccctccno:m2017648。
具体实施方式
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明中，术语“培养”指允许微生物在人工控制的条件下生长。多种本领域熟知的方法可用于培养本发明的菌株，可以用分批方法或连续方法如补料分批方法或重复补料分批方法培养，但本发明不限于此。
用于培养的培养基必须满足所使用菌种的要求。本领域熟知适用于培养放线菌的培养基如高氏一号培养基和面粉琼脂培养基。培养基的碳源可以是：可溶性淀粉、糊精、液化糖、葡萄糖等。用于培养本发明菌株的氮源可以是：黄豆饼粉、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、硝酸钾等。培养基的其他成分可包括氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾等。上述这些材料可以单独或组合使用。
本发明中，“具有[规定菌株的]鉴定特征的菌株”，或“具有[规定菌株的]鉴定特征的培养物”，包括规定菌株的同源物或突变体，与规定菌株紧密相关(即与其享有共同祖先)或来源于规定菌株，但通常与规定菌株在一种或多种基因型或表型特征上有差异。通常通过遗传差异的评估，可鉴定突变体。具有鉴定特征的菌株，包括具有规定菌株的所有鉴定特征(例如，对应于规定菌株的dna指纹的基于dna分析的dna指纹)的同源菌株或突变菌株。
本发明中，术语“培养物”指通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分，只要这些成分不会实质上影响该培养物生产产物的活性。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。所述(传代)培养物产生红霉素的能力与本发明的klcndx-01或klcndx-02基本上相同。
本发明中，术语“生物学纯的培养物”指基本没有生物污染的并具有遗传一致性从而使得从中取得的不同传代培养物将呈现基本相同的基因型和表型的培养物(例如，培养物具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、最高100％纯的纯度)。
本发明中，通过“衍生”获得的菌株指通过任何方式的转化，例如通过一次或更多次的杂交和/或通过变异和/或通过转基因而衍生出的菌株。
通过杂交衍生出的菌株可通过将根据本发明的菌株与相同菌株或另一种根据本发明的菌株，或者任何其他的菌株进行杂交来获得。
通过变异衍生出的菌株可以为经过至少一次其基因组中的自发变异或经过通过例如致突变而诱发的至少一次变异的菌株。所述衍生菌株的变异是或不是无声的。用表述“致突变”表示通过辐射(例如紫外线)或致突变化学品得到的标准的致突变，和通过转座或外源dna片段的整合实现的插入诱变。通过射线致突变包括使用紫外线、x射线或伽马射线。致突变化学物质例如ems(乙基-甲基磺酸酯)、ees(乙基-乙基磺酸酯)、亚硝基胍、亚硝酸、黄曲霉素b1，羟胺、5-溴-尿嘧啶、2-氨基-嘌呤、前黄素、吖啶橙。
通过转基因衍生出的菌株为引入外源dna的菌株。所述外源dna优选通过质粒引入或直接整合到基因组中。
本发明中，术语“同源性”指多核苷酸或多肽与另一序列有一定百分数的“序列同一性”(sequenceidentity)。在比较两个序列时，当联配时，这些百分数的碱基或氨基酸是相同的。可以用本领域中已知的软件程序来确定这种联配和同源性百分数或序列同一性，例如描述于currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等人编辑，1987)增刊30，7.7.18部分中的那些程序。优选的联配程序是alignplus(scientificandeducationalsoftware，pennsylvania)，优选地应用缺省参数，如下：错配＝2；开放空位(opengap)＝0；延伸空位(extendgap)＝2。可以应用的另一序列软件程序是tfastadatasearchingprogram，可以从sequenceanalysissoftwarepackage版本6.0(geneticcomputergroup，universityofwisconsin，madison，wi)得到。
本发明中，术语“同等或更高的红霉素生产能力”中同等的红霉素生产能力指在相同的条件下培养时，与衍生前的放线菌宿主细胞相比，改变的放线菌细胞中的红霉素的产生量或摇瓶效价与改变前相同，或变化量不大于±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或更小；更高的红霉素生产能力指上述变化为增加至少6％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％或更多。
本发明中，术语“在培养或发酵中不产生或产生更少的恶臭气味”中不产生恶臭气味指在培养或发酵中不产生恶臭气体，或者恶臭气体的产生量低于嗅觉阈值。所述嗅觉阈值包括可以嗅觉气味存在的感觉阈值或能够定出气味特性的识别阈值(见国家标准gb/t14675-93)。所述产生更少的恶臭气味是指培养或发酵中产生的恶臭气体浓度更低。所述恶臭气体浓度指单位体积内恶臭气体的质量数。
在本发明中，恶臭气体浓度也可以参照国家标准gb/t14675-93所述《空气质量-恶臭的测定-三点比较式臭袋法》中的方法测定。其中恶臭气体浓度指根据嗅觉器官试验法对臭气气味的大小予以数量化表示的指标，用无臭的清洁空气对臭气样品连续稀释至嗅辨员阈值时的稀释倍数。
在本发明中，红霉素生产能力及恶臭气味产生水平或能力的比较，可选择在相同条件下培养待比较的两种或多种微生物宿主细胞，并且使用相同条件、优选使用相同测定方法分别测定红霉素的产生量或恶臭气味的大小。
本发明中，术语“恶臭气味”指红霉素发酵生产过程中产生的刺激嗅觉器官引起人们不愉快的气体气味，可以是多种气体异味的集合，或单种气体的气味。所述气味可以通过人们的感知思维进行分析判断，也可以根据红色糖多孢菌标准发酵尾气进行对比识别，或者由专业的嗅辨员根据国家标准gb/t14675-93所规定的三点比较式臭袋法进行识别。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制。本领域技术人员根据本发明的教导，可以做出各种修改或改进，而不脱离本发明的基本思想和范围。
实施例1菌株的发酵液的发酵方法
本发明菌株klcndx-01或klcndx-02发酵液的发酵方法可参考本公司公开的发明专利cn102409071a进行，该专利公开内容作为本发明的一部分引入本发明。
作为其中一个实施例，该培养和发酵方法可包括如下步骤：
(1)红霉素种子液培养：①母斜面孢子制备：将冷冻保存在砂土管中的红霉素链霉菌孢子，接种于经灭菌的斜面培养基上,在温度34℃条件下,培养9天；②子斜面孢子制备：将母斜面孢子,接种于经灭菌的斜面培养基上,在温度34℃条件下,培养9天；③种子培养：将子斜面孢子,接种于经灭菌的种子培养基,经过三级种子扩大培养,得到红霉素种子液；(2)发酵：将红霉素种子液按10％体积比接种于经灭菌的培养基中,通入无菌空气并搅拌20小时,添加营养物质,经过8天培养,得红霉素发酵液。
其中，母斜面培养基组成为：淀粉0.5g，玉米浆0.1g，琼脂0.5g，葡萄糖0.5g，氯化钠1g，氯化钙0.5g，用自来水定容到100ml；子斜面培养基组成为：淀粉0.4g，玉米浆0.2g，琼脂0.4g，葡萄糖0.4g，氯化钠1.5g，氯化钙1.0g，用自来水定容到100ml；发酵培养基组成为：黄豆粉4.5g，淀粉3.0g，硫酸铵0.12g，caco30.8g，大豆油0.7g，聚氧丙烯甘油0.01g，用自来水定容到100ml；营养物质为40％葡萄糖溶液20g，大豆油4g，60％正丙醇溶液2g；一级种子培养基为：黄豆粉3g，淀粉1.5g，caco30.7g，糊精1.5g，硫酸铵0.3g，玉米浆2g，大豆油0.7g，用自来水定容到100ml；二、三级种子培养基为：黄豆粉3.5g，淀粉3.2g，caco30.6g，氯化钠0.5g，糊精3.2g，硫酸铵0.2g，玉米浆1.5g，大豆油1.1g，聚氧丙烯甘油0.005g，用自来水定容到100ml。
实施例2硫氰酸红霉素的提取方法
本发明从菌株klcndx-01或klcndx-02发酵液中制备硫氰酸红霉素的方法，可参考本公司公开的发明专利cn102408462a进行，该专利公开内容作为本发明的一部分引入本发明。
作为其中一个实施例，该制备方法可包括如下步骤：
(1)发酵液浓缩：红霉素发酵液除渣后，用浓度为15％的氢氧化钠溶液调ph为7.8-8.2，采用50nm-100nm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到红霉素浓缩液。
(2)重结晶：将红霉素浓缩液置于结晶罐，加入15％的硫氰酸钠溶液(每十亿单位红霉素加入0.15kg的15％硫氰酸钠溶液)，用40％的冰醋酸溶液调节ph为6.0-6.5，结晶析出硫氰酸红霉素，固液混合物经离心分离得硫氰酸红霉素粗品，硫氰酸红霉素粗品按照1：3比例加入丙酮，用浓度为15％的氢氧化钠溶液调节ph为9.6-9.8，将硫氰酸红霉素转化成红霉素碱，静置，取丙酮溶液，加入15％的硫氰酸钠溶液(每十亿单位红霉素加入0.15kg的15％硫氰酸钠溶液)，用40％冰醋酸溶液调ph至6.5，按溶解液体积的1.0倍加入50-55℃纯化水，控制结晶温度25-30℃，停搅拌，静置2小时进入离心机分离得硫氰酸红霉素湿品，硫氰酸红霉素湿品分别用丙酮、50-55℃纯化水淋洗，干燥，即得硫氰酸红霉素成品。
实施例350l发酵恶臭气味测定
恶臭气味的测定方法采用的是“三点比较式臭袋法”，根据中华人民共和国国家标准gb/t14675-93《空气质量-恶臭的测定-三点比较式臭袋法》的方法进行测定，该标准全部内容作为本发明的一部分引入本发明。
三点比较式臭袋法测定恶臭气体浓度的方法是：先将三只无臭袋中的二只充入无臭空气、另一只则按一定稀释比例充入无臭空气和被测恶臭气体样品供嗅辨员嗅辨，当嗅辨员正确识别有臭气袋后，再逐级进行稀释、嗅辨，直至稀释样品的臭气浓度低于嗅辨员的嗅觉阈值时停止实验。每个样品由若干名嗅辨员(通常不少于6名)同时测定，最后根据嗅辨员的个人阈值和嗅辨小组成员的平均阈值，求得臭气浓度。
针对本发明红霉素生产菌株klcndx-01和klcndx-02不同发酵时间的尾气进行采集，采样方法参照《恶臭培训教材》(由国家环境保护恶臭污染控制重点实验室编制)第二章恶臭样品的采集，通过“三点比较式臭袋法”进行检测。
以本发明菌株klcndx-01为例，当其发酵136小时时平均臭气浓度为220，基因工程改造前原生产菌种发酵136小时臭气浓度为549，经测定klcndx-01菌株同期发酵恶臭气味与基因工程改造前的原生产菌株相比，臭气浓度降低了60％。
实施例4红霉素的生产能力测定
通过化学显色法、高效液相色谱法对菌株的生产能力进行测定，方法如下：
化学显色法：
(1)原理：红霉素与磷酸应生成黄色物质，其最大吸收波长为483nm。用分光光度计进行比色测定，能够定量分析。
(2)试剂，混合显色液：将磷酸与纯化水按7:3的配比进行配制，混合摇匀后待用。
(3)标准曲线的绘制，分别量取红霉素标准溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml于7个25ml容量瓶中(约64u/ml-256u/ml),使用煮沸后冷却的纯化水定容，分别制得红霉素工作标准溶液。置2-8℃冰箱中冷藏。分别精密量取各个红霉素工作标准溶液2.0ml于7支(30×200mm)试管中，精密加入混合显色溶液8ml,摇匀，放置80℃水浴中加热6min，取出后，立即用水冷至室温，使用分光光度计以纯化水为空白，在483nm波长处测定吸光度。以加入红霉素效价含量(u)对吸光度值绘制标准曲线，求得回归线方程。
(4)化学效价的测定：取经滤纸过滤或离心分离后的各工序提炼液上清液适量，用稀释剂稀释使成约100-200u/ml红霉素的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试液2.0ml，置30×200mm试管中，再精密加入混合显色溶液8ml，摇匀，放入80℃水浴中加热6min，取出后，立即用水冷至室温，使用分光光度计以纯化水为空白，在483nm波长处测定吸光度。同时利用标准曲线项下火的的回归线方程。
计算公式：发酵液效价(u/ml)＝回归线方程效价计算值×稀释倍数
高效液相色谱法：
(1)色谱条件，色谱柱：c18柱(4.6*250㎜,5μm)，柱温：35℃，检测波长：215nm，流动相：0.025mol/l磷酸氢二钾：乙腈＝59:41，流速：1.0ml/min。
(2)样品制备，①标准品溶液制备：取红霉素标准品0.04克，精密称定，置10ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度。②供试品溶液制备：取5克红霉素发酵液滤液至25ml容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，静置，用甲醇定容。取该溶液用离心机(3500r/min,20min)离心后取上清液，过0.22um的有机系滤膜，待用。(3)测定取10ul标准品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪。按外标法，以a组分标准品峰面积计算供试品红霉素a组分、b组分、c组分和e组分。
红霉素a含量＝红霉素a峰面积*标准品a组分浓度*稀释倍数/红霉素标准品a组分峰面积
红霉素b含量＝红霉素b峰面积*标准品a组分浓度*稀释倍数/红霉素标准品b组分峰面积
红霉素c含量＝红霉素c峰面积*标准品a组分浓度*稀释倍数/红霉素标准品c组分峰面积
红霉素e含量＝红霉素e峰面积*标准品a组分浓度*稀释倍数/红霉素标准品e组分峰面积
其结果如表1所示：
表1红霉素生产菌株摇瓶效价及各组分含量
(注：效价为化学显色发测定结果。总组分、红霉素a、红霉素b、红霉素c、红霉素e为高效液相色谱法测定结果)
由表1可知，klcndx-01发酵生产红霉素总组分效价较基因工程改造前生产菌株提高了14％，其中主要活性成分红霉素a组分提高9.68％，且红霉素b组分降低了36％；与经过基因工程改造但未经驯化筛选的菌株相比，klcndx-01发酵生产红霉素总组分效价提高了64％，主要活性成分红霉素a组分提高了70.4％，且红霉素b组分降低了28％。
klcndx-02发酵生产红霉素总组分效价较基因工程改造前生产菌株提高了16.7％，其中主要活性成分红霉素a组分提高9.66％，且红霉素b组分降低了44％；与经过基因工程改造但未经驯化筛选的菌株相比，klcndx-02发酵生产红霉素总组分效价提高了67.8％，主要活性成分红霉素a组分提高了70.34％，且红霉素b组分降低了36.8％。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。