本发明涉及一种来源于地衣芽孢杆菌的新型漆酶及其基因、工程菌、制备方法和应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株，以及该细菌漆酶蛋白在染料脱色工业上的应用，属于酶的基因工程
技术领域：
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背景技术：
：：漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)，又称为酚酶、多酚氧化酶，是一种含铜的多酚氧化酶。最早是由日本学者发现，10多年后又在真菌中发现了这种酶，并将其命名为漆酶。漆酶大多为500-550个左右的氨基酸组成的单体糖蛋白，具有N-端分泌肽，分子量为50-500kDa，糖基含量10％-80％，它与抗坏血酸氧化酶、血浆铜蓝蛋白、吩嗪合酶、胆红素氧化酶、二氢地曲菌素氧化酶、硫赭曲菌素氧化酶和FET3同属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶是具有重要应用价值的绿色催化剂，广泛存在于真菌、细菌、昆虫和高等动植物体内。相对于动植物而言，微生物漆酶来源比较丰富，主要是真菌和细菌两大类。真菌漆酶糖基化程度高，占酶分子的10％～49％，包括葡萄糖、半乳糖、氨基己糖、岩藻糖、阿拉伯糖等，糖基的组分和比例差异会产生同工酶，糖基也有利于漆酶结构的热稳定性。而细菌漆酶不需要糖基化的修饰，漆酶通常以单体蛋白体的形式存在，酸性pH催化效率较高，适宜温度低的环境。真菌漆酶来源广泛，产漆酶的真菌绝大多数为担子菌亚门(Basidiomycotina)，约占80％。目前工业化的商品漆酶主要来源于真菌，但是，一般真菌漆酶在酸性条件下(pH4-6)和30-55℃下保持较高的活性，而造纸和纺织等工业领域往往伴随着高温、强碱等反应条件，使真菌漆酶的应用受到限制且使用成本较高。而且丝状真菌生长周期长，对培养基要求较高，在发酵罐中容易受到较高的机械损伤，这些问题严重影响了真菌漆酶在工业上的应用。细菌漆酶包括芽胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌CueO蛋白等，与真菌漆酶相比，细菌漆酶在铜离子抗性和热稳定性等方面更具有优势。而且细菌漆酶具有自己一些独特的优点：细菌漆酶没有糖基化修饰，分子组成单一，绝大多数为单体酶，最适pH范围广、温度稳定性好、存在Cu2+抗性等。这些性质正是目前工业上漆酶应用所需要的。因此，细菌漆酶的研究对于漆酶应用领域的扩展具有十分重要的意义。目前，关于细菌漆酶的研究很少，更多具有高活力高稳定性能力的细菌漆酶基因有待进一步发掘和研究。由于漆酶来源不同，并且不同来源的漆酶在结构和性质方面存在一定的差别，但是大部分漆酶都具有三个典型的结构，即肽链、糖配基和铜原子。漆酶多为糖基化酶，不易结晶，稳定性好，氧化还原电位高(780mV)，作用底物范围广，可氧化多酚、二元胺、芳香胺、对苯二酚、氨基酚、芳香硫醇等。漆酶与木素过氧化物酶、苦瓜过氧化物酶等酶一样，能氧化小分子物质并进一步氧化一些不能被其它酶直接氧化的物质，这些小分子物质称为介体。漆酶与氧气、介体结合可以氧化本来不能氧化的不含酚基的化合物。特别是在生物消除和有机膦酸酯消毒方面，通过有效的介体，漆酶可以催化降解异型生物质。介体的发现，显著扩大了漆酶底物范围，使得漆酶具有更加广阔的应用前景。目前，漆酶已被应用于纸浆造纸、有机合成、污水处理、食品等行业，此外，漆酶在服装行业、生物传感器、环境修复、毒品检测和清除军用化学毒剂等方面也有其相关应用。枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统在表达外源目的蛋白时具有很多优点，具有广阔的前景，适合工业化和规模化生产，该表达系统的优点主要表现在：1、表达量高：毕赤酵母表达系统的表达载体，是以醇氧化酶基因的启动子启动表达的，其外源目的蛋白的表达量很高，P.pastoris的表达量比一般表达系统的表达量(常用表达系统的表达量一般在毫克级)高10倍甚至100倍。2、稳定性高：毕赤酵母表达系统的表达载体通过整合在酵母的染色体上而存在，并且随染色体的复制而复制，不是以质粒自我复制的形式存在，因此重组菌株的稳定性很高。3、高分泌表达：毕赤酵母表达系统的表达载体中a因子前导序列是一个具有很好的分泌效果的分泌信号序列，能够通过一定的途径使表达产物分泌到细胞外，同时减轻了宿主细胞的代谢负荷，有利于细胞的持续生长。4、目的蛋白翻译后的加工和修饰：毕赤酵母具有真核生物完整的亚细胞结构，能够进行真核生物蛋白翻译后的加工修饰过程(如糖基化、脂酞化、磷酸化、蛋白裂解、折叠以及二硫键的形成等)，从而使分泌蛋白的结构更接近于天然蛋白，而且糖基化程度合适，适于临床使用。5、遗传背景研究较清楚，能够通过基因表达调控机制实现目的蛋白的高水平表达。6、易于进行工业化生产，毕赤酵母属于单细胞微生物，具有生产成本低，营养要求简单(酵母的碳源一般为甘油、葡萄糖以及甲醇等)，发酵工艺简单，可进行高密度发酵等优点，酵母具有大规模发酵生产外源蛋白的潜力，而且酵母表达系统自我分泌的杂蛋白很少，对于目的蛋白的纯化有利。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因较为理想的工具。在本发明中，新型漆酶编码基因来源于地衣芽孢杆菌，它属于细菌，对地衣芽孢杆菌基因组中新型漆酶编码基因进行克隆，并将新型漆酶基因在枯草芽胞杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性漆酶游离表达重组菌株，重组菌株发酵后，经过相应的处理，可以得到高稳定性漆酶催化剂，并且该新型重组漆酶可以对蒽醌类和偶氮类染料进行脱色。技术实现要素：：本发明的目的在于克服和避免目前工业上生产漆酶所存在的不足之处，并提供一种来源于地衣芽孢杆菌的新型细菌漆酶、其编码基因以及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。本发明实现目的的技术路线如下：以地衣芽孢杆菌的基因组为模板，并根据已报道的地衣芽孢杆菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2、P3和P4，其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI；上游引物P3和下游引物P4是用来扩增在毕赤酵母GS115中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI。通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的漆酶基因Lac，将其分别与pBSA43载体和pPIC9K载体分别连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac和pPIC9K-Lac；转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac和JM109/pPIC9K-Lac。再次将验证正确的重组质粒pBSA43-Lac和pPIC9K-Lac，分别在枯草芽胞杆菌WB600和毕赤酵母GS115中成功表达，得到产高稳定性新型漆酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型漆酶。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一为：一种新型漆酶，所述漆酶来源于一株经发明人筛选的地衣芽孢杆菌，其氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示；所述漆酶以丁香醛连氮(SGZ)为底物测定酶学性质时，最适作用温度为70℃，最适作用pH为7.0；同时，以SGZ为底物测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果表明：该新型细菌漆酶在70℃以下，pH5～9的范围内稳定性良好，与已报道的来源于地衣芽孢杆菌的漆酶相比，本专利所要保护的新型漆酶的pH稳定性和温度稳定性更好；所述漆酶的编码基因为Lac，碱基序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述基因重新构建重组载体，并在枯草芽胞杆菌WB600和毕赤酵母GS115中的高效表达，得到产高稳定性新型漆酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型漆酶；用于表达所述的新型细菌漆酶的宿主细胞为枯草芽胞杆菌WB600，表达载体为pBSA43；用于表达所述的新型细菌漆酶的宿主细胞为毕赤酵母GS115，表达载体为pPIC9K。实现上述方案的步骤概述如下：1、一种来源于地衣芽孢杆菌的新型漆酶基因，构建表达该新型漆酶的重组菌株(枯草芽胞杆菌WB600/pBSA43-Lac)并制备该新型漆酶的过程包括如下步骤：(1)以地衣芽孢杆菌的基因组为模板，根据已报道地衣芽孢杆菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2，通通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的漆酶基因Lac，或者根据SEQIDNO:1所示的序列进行全基因合成获得Lac基因，将Lac基因与大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac；(2)将重组质粒pBSA43-Lac转化入枯草芽胞杆菌WB600，构建获得重组菌株WB600/pBSA43-Lac；(3)将重组菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌漆酶；(4)提取纯化获得高稳定性新型漆酶。2、一种来源于地衣芽孢杆菌的新型漆酶基因，构建游离表达该新型漆酶的重组菌株(毕赤酵母GS115/pPIC9K-Lac)并制备该新型细菌漆酶的过程包括如下步骤：(1)以地衣芽孢杆菌的基因组为模板，根据已报道地衣芽孢杆菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶成熟肽基因的扩增引物P3和P4，通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的漆酶基因Lac，或者根据SEQIDNO：1所示的序列进行全基因合成获得Lac基因，将Lac基因与大肠杆菌-毕赤酵母穿梭质粒pPIC9K连接后，构建重组质粒pPIC9K-Lac，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pPIC9K-Lac；(2)将重组质粒pPIC9K-Lac转化入毕赤酵母GS115，构建获得重组菌株GS115/pPIC9K-Lac；(3)将得到的重组菌株经遗传霉素筛选，结合漆酶的酶活测定，得到产高稳定性漆酶的重组菌株；(4)将高产菌株进行发酵制备高稳定性新型细菌漆酶；(5)提取纯化制备高稳定性新型漆酶。有益效果：1、本发明通过特定的能够产生漆酶的高通量菌株筛选，获得一株能够产生漆酶的细菌菌株，即地衣芽孢杆菌，通过PCR扩增获得的该菌株的漆酶基因，经测序为一段新的碱基序列，如SEQIDNO：1所示。2、本发明中通过枯草芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株和毕赤酵母游离表达新型漆酶重组菌株发酵后制备的新型漆酶具有如下的酶学性质的优点：以SGZ为底物测定酶学性质时，最适作用温度为70℃，最适作用pH为7.0；同时该新型细菌漆酶在70℃以下，pH5～9的范围内活力稳定。3、该新型细菌重组漆酶对偶氮类和蒽醌类染料具有较好的脱色效果。因此，该漆酶在实际应用中具有较大应用潜力。附图说明：图1为本发明新型漆酶成熟肽基因的PCR扩增电泳图；其中：M为DNAMarker，1、2分别为漆酶成熟肽基因Lac；图2为本发明重组质粒pBSA43-Lac酶切验证图；其中：M为DNAMarker，1为重组质粒pBSA43-Lac经EcoRI和NotI双酶切图，2为重组质粒pBSA43-Lac经EcoRI单酶切图；图3为本发明重组质粒pPIC9K-Lac酶切验证图；其中：M为DNAMarker，1为重组质粒pPIC9K-Lac经EcoRI和NotI双酶切图，2为重组质粒pPIC9K-Lac经EcoRI单酶切图。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。实施例1：地衣芽孢杆菌新型漆酶成熟肽基因的获得1、新型漆酶成熟肽基因来源于本实验室筛选出的地衣芽孢杆菌，提取其基因组DNA，其中地衣芽孢杆菌基因组DNA的提取步骤如下：(1)从甘油管中接种划线于LB固体平板中，37℃静置培养12h；(2)从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，于220r/min，37℃条件下培养12h；(3)将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中，12000r/min离心1min收集菌体，弃上清；(4)将沉淀重悬于100μL的TEbuffer中，用枪头反复吹打混匀，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴1h；(5)加入100μLBTLbuffer和20μL蛋白酶K，漩涡振离；；(6)55℃水浴40-50min，每隔20-30min震荡混匀；(7)加入5μLRNaseA，颠倒混匀数次，室温放置5min；(8)以12000r/min离心2min，将上清转移到另一EP管中，勿吸沉淀；(9)加入200μLBDLBuffer，振荡混匀，65℃水浴10min；(10)加入200μL无水乙醇，吹吸混匀；(11)吹吸混匀后转移到吸附柱，12000r/min离心1min，弃残液；(12)加500μLHBCBuffer，12000r/min离心1min，弃残液；(13)加入700μLDNA洗脱液，12000r/min离心1min，重复步骤(13)；(14)空离12000r/min2min，空气中干燥20-30min，加入30μL灭菌的ddH2O，12000r/min离心洗脱。2、通过NCBI基因库查找，根据已报道的地衣芽孢杆菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本发明的漆酶成熟肽编码基因的扩增引物如下：上游引物P1(SEQIDNO：3)：5’—CCGGAATTCGATGAAACTTGAAAAATTCGTTG—3’下游引物P2(SEQIDNO：4)：5’—AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTGATGACGAACATCTGTCAC—3’上游引物P3(SEQIDNO：5)：5’—CCGGAATTCATGAAACTTGAAAAATTCGTTGAC—3’下游引物P4(SEQIDNO：6)：5’—AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTGATGACGAACATCTGTCAC—3’其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI；上游引物P3和下游引物P4是用来扩增在毕赤酵母GS115中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI。扩增模板为地衣芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：10×PyrobestBuffer5μLdNTPMixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)(2.5mM)5μL上游引物P1或者上游引物P32μL下游引物P2或者下游引物P42μLDNA模板2μLPyrobestDNAPolymerase(5U/μL)0.5μLddH2O33.5μL总体积50μL扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min40s反应30个循坏；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1600bp的条带(图1)，用小量DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，并进行双酶切和纯化回收，得到本发明的地衣芽孢杆菌新型漆酶成熟肽编码基因Lac，序列见SEQIDNO：1。实施例2：枯草芽胞杆菌高稳定性新型漆酶重组菌的构建1、表达载体pBSA43的构建pBSA43是以大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽胞杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Kmr基因，可以在枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。2、新型漆酶表达载体pBSA43-Lac的构建将经PCR扩增并经EcoRI和NotI双酶切后回收的新型漆酶基因(Lac)与同样双酶切的枯草芽胞杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株JM109/pBSA43-Lac。3、重组表达载体pBSA43-Lac转化枯草芽胞杆菌WB600将1μL(50ng/μL)的pBSA43-Lac重组质粒加入到50μL的枯草芽胞杆菌WB600感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得成功转化重组表达载体pBSA43-Lac的枯草芽胞杆菌重组菌株WB600/pBSA43-Lac。实施例3：毕赤酵母高稳定性新型漆酶游离表达重组菌的构建1、新型漆酶表达载体pPIC9K-Lac的构建将经PCR扩增并经EcoRI和NotI双酶切后回收的新型漆酶基因(Lac)与同样双酶切的毕赤酵母表达载体pPIC9K用连接酶进行连接；将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子；提取阳性转化子质粒，经37℃摇管培养后抽提质粒，并进行单、双酶切初步验证，并将酶切验证正确的重组质粒命名为pPIC9K-Lac；将酶切验证正确的阳性克隆送至北京华大基因科技股份有限公司测序，以进一步确保目的基因的正确性，最终确定构建获得正确的重组菌株JM109/pPIC9K-Lac。2、新型漆酶重组菌株的构建及新型漆酶高表达重组菌株的筛选(1)线性化重组表达质粒pPIC9K-Lac的制备重组质粒在电转化毕赤酵母GS115前，要先将构建好的重组表达质粒pPIC9K-Lac进行线性化以提高重组质粒在毕赤酵母染色体上的整合效率。每次转化需要线性化质粒DNA15μg，且质粒越纯，转化效率越高。用SacⅠ和SalⅠ这2种限制性内切酶进行线性化酶切。酶切完之后，用小量DNA回收试剂盒回收线性化酶切产物。(2)线性化质粒pPIC9K-Lac电转化毕赤酵母GS115、阳性转化子的鉴定及新型漆酶高表达菌株的筛选a、将经线性化回收的重组质粒DNA(15μg)加入到提前制备好的100μL毕赤酵母GS115感受态细胞中，混匀，冰浴20min后，将混匀的反应液加入到预先冰浴的电转杯中。b、冰浴装有转化液的转化杯5min，根据电转装置推荐的参数(电压2500V，电击时间5ms)，进行毕赤酵母电转化。c、脉冲后，立即向电转杯中加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液，把转化液再转移到一个新的1.5mL的离心管中。d、30℃静置培养1-2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200μL涂布在MD培养基(YNB:1.34％；葡萄糖：2％；生物素：4x10-5％；琼脂粉：1.5％)平板上。e、30℃静置培养直至转化子出现。f、挑取转化子单菌落溶解在10μL去离子水中，取2μL菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反应10min，反应液立即放入-80℃冰箱冷冻10min，使酵母细胞壁充分裂解，释放的基因组作为模板进行PCR。以转入空质粒pPIC9K的毕赤酵母GS115/pPIC9K作为对照，确定阳性转化子。g、在确定阳性转化子的基础上，先用含不同浓度遗传霉素的抗性平板筛选高遗传霉素抗性的转化子，然后分别测定这些高遗传霉素抗性的转化子的新型漆酶的酶活，以得到新型漆酶的高产菌株GS115/pPIC9K-Lac。实施例4：漆酶酶活的测定在0.1mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液或0.1mol/L的Tris-HCL缓冲液中加入0.1mmol/L的SGZ，加入漆酶后在特定温度和pH下进行反应，在525nm下检测反应初始的OD值和反应3分钟的OD值。(1)测定最适pH：在30℃条件下测定漆酶在pH＝3.0-9.0条件下的酶活，以确定最适反应pH；(2)测定最适温度：在最适反应pH下，测定漆酶在20-100℃下的酶活，以确定其反应最适温度；(3)测定热稳定性：在最适pH和温度下，测定漆酶在50-80℃之间保温0-10h后的残余酶活，以确定其热稳定性；(4)测定pH稳定性：在最适pH和温度下，测定漆酶在pH3.0-9.0之间保藏0-10h后的残余酶活，以确定其pH稳定性；酶活的测定为三次平行实验，结果取平均值。酶活的定义：在一定的条件下，每分钟氧化1μmolSGZ所需要的酶量定义为一个酶活单位U。酶活力计算酶活力式中：△OD代表从反应开始到结束，吸光度的变化量。V1代表反应体系的总体积。△t代表从反应开始到结束，所用时间。V2代表在反应体系中，酶液的体积。ε代表以SGZ为底物时，其产物在525nm处摩尔吸光系数65mM-1cm-1。d代表吸光杯的内径或光程厚度(cm)。通过上述方法测定新型漆酶的酶学性质，该新型漆酶酶学性质如下：以SGZ为底物测定新型漆酶酶学性质时，最适作用温度为70℃，最适作用pH为7.0；以SGZ为底物测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果表明：该新型细菌漆酶在70℃以下，pH5～9的范围内稳定性良好。实施例5：新型漆酶在枯草芽胞杆菌重组菌株中的表达及制备将枯草芽胞杆菌重组菌株WB600/pBSA43-Lac接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，经12000rpm离心10min，即可制备获得高稳定性新型漆酶粗酶液，以SGZ为底物测定新型漆酶粗酶液酶活力(pH7、70℃条件下)，枯草芽胞杆菌表达新型漆酶重组菌株发酵后漆酶酶活可达到16.8U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型漆酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型漆酶纯酶酶粉，将酶粉溶解后按照实施例4所述测定酶活的方法在pH7，70℃条件下测定酶活为120U/g。实施例6：新型漆酶在毕赤酵母游离表达重组菌株中的表达及制备将培养于YPD固体平板上的毕赤酵母游离表达新型漆酶重组菌GS115/pPIC9K-Lac接种至YPD液体培养基中，30℃，220r/min培养24h。以2％的接种量转接到新鲜BMGY培养基(2％蛋白胨；1％酵母粉；1.34％YNB,0.02％生物素，10％1M磷酸钾缓冲液；10％甘油)中，继续以30℃，220r/min培养24h，然后以6000rpm/min离心10min收集菌体，将菌体转接到BMMY培养基(1.34％YNB；0.02％生物素；10％磷酸钾缓冲液；0.5％甲醇)中。再以30℃，220r/min培养，并每隔12h补加一次甲醇，使其终浓度保持在0.5％(V/V)，培养120h后，经12000rpm离心10min，可得到新型漆酶的粗酶液，以SGZ为底物测定新型漆酶粗酶液酶活力(pH7、70℃条件下)，毕赤酵母游离表达新型漆酶重组菌株发酵后漆酶酶活可达到15.3U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型漆酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型漆酶纯酶酶粉，将酶粉溶解后按照实施例4所述测定酶活的方法在pH7，70℃条件下测定酶活为97U/g。实施例7：新型漆酶对染料的脱色处理及脱色率的计算利用新型漆酶酶液对蒽醌和偶氮染料进行脱色处理，需要考虑催化反应体系中：反应温度、反应pH值、染料种类及浓度、介体种类及浓度、酶液用量、脱色时间等因素。本研究中使用的染料包括：活性艳蓝X-BR、活性艳蓝K-GR、活性艳蓝KN-R、活性深蓝M-2GE、刚果红、棉蓝、孔雀石绿、偶氮荧光桃红、溴酚蓝、酸性媒介黑PV。(1)新型漆酶对染料脱色的方法及步骤漆酶催化染料脱色的处理采用300μL的反应体系：a、取275μL的含4mmol/LCu2+的0.1mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝4)或者含4mmol/LCu2+的0.05mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH＝8)，于96孔板中，70℃保温1min。b、加入15μL的浓度为2000mg/L的上述染料。c、再加入10μL的稀释适当倍数的漆酶酶液(对应酶活力为0.05U/mL)(在相同实验条件下，加入等量的100℃灭活15min的酶液作为空白对照)，测其吸光度A0。d、于70℃条件下脱色60min，测定其吸光度为A1。以上每个脱色处理均重复3次，结果取平均值。(2)脱色率的计算：将得到的两株重组菌发酵后，利用制备的新型漆酶酶粉(实施例5，6)，按照上述脱色步骤，对上述染料进行脱色处理，60min脱色率都达到了85％以上。实施例8：漆酶对氨基酸底物交联的分析室温下,分别取2g酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸，放入250mL广口瓶中，加入250mL蒸馏水，溶解后使用鼓泡装置通空气5min,启动磁力搅拌器，调整pH为7.0，温度为50℃，添加少量蒸馏水，再加入新型漆酶酶液或酶粉启动反应，立即连接溶解氧分析仪，同时启动秒表记录氧气质量浓度，每30s记录1次。结果显示，反应过程中氧气消耗速率由高到低依次为酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸，表明新型漆酶对酪氨酸的催化氧化效能最好。实施例9：漆酶对酪蛋白底物交联的分析利用新型漆酶酶液或酶粉，在pH7.0、50℃下，催化酪蛋白24小时，利用SDS-PAGE进行检测，催化产物分子量明显大于催化前酪蛋白分子量，表明新型漆酶对蛋白底物具有交联能力。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>天津科技大学<120>一种新型漆酶及其基因、工程菌、制备与应用<130>1<141>2018-01-30<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>1542<212>DNA<213>地衣芽孢杆菌()<400>1atgaaacttgaaaaattcgttgaccggctccccattccgcaagtgcttcaaccccaaagc60aaaagcaaggaaatgacctattatgaagtcaccatgaaagaatttcagcagcagcttcac120cgcgatctgccgccgactcggctgtttggatataacggagtttatcccggccctaccttc180gaagtgcagaaacacgaaaaagtcgcagtcaggtggttaaataagcttccggatcgccat240tttctccccgtcgaccatacgcttcacgatgacggccatcacgaacatgaagtgaagacg300gtcgttcatttgcacggaggctgtacgcctgctgacagcgacggatatcctgaggcttgg360tacacaaaagacttccatgcaaaaggccctttctttgaaagggaggtgtatgaatatccg420aatgagcaggatgctacagctctttggtatcatgaccatgcaatggccatcacaaggctg480aatgtatatgcggggcttgtcggtttatattttattcgcgacagggaagagcgttcattg540aacttgccgaagggagaatatgaaatcccgcttttgattcaggataaatcatttcatgaa600gatggttcattgttttatccgcggcagcctgacaacccttcgccggatcttccggacccg660tcgattgttccggctttttgcggtgataccattttagtcaacggcaaggtatggcctttc720gctgaactggaaccccgaaaataccgttttcggatactgaacgcctccaatacgagaatc780tttgagttgtatttcgatcatgacatcacatgtcatcaaatcggcacggacggcggtctt840ctgcagcatccggtcaaagtcaatgaactggtgatcgcgccggctgaaaggtgcgatatc900atcgttgatttttcacgagcagaaggaaaaaccgtgacactgaaaaaccggatcggctgc960ggcggacaagacgcagatcccgatactgatgccgacatcatgcaattccgcatctcaaaa1020cctttgaagcaaaaagatacaagttcattgccgagaatattgagaaagcgcccattttac1080cggagacacaagatcaatgccctcagaaatctgtcattgggcgcggccgttgaccaatat1140ggaagacctgttctgcttttaaacaacacaaagtggcatgaaccggtaaccgaaacaccc1200gcactcggcagcactgagatctggtcgatcatcaatgccggaagggcgatccatccgatc1260catttacatcttgttcaatttatgattctcgaccaccggccgtttgatatcgagcggtat1320caggaaaacggagaacttgtttttaccggtccggcagtttctccggcaccgaatgaaaag1380gggctgaaagacaccgtcaaagtacccccgggttcagtgacgcgcattatcgccaccttt1440gcgccgtacagcggcagatatgtttggcactgccacatccttgagcacgaagattacgat1500atgatgcgccctcttgaagtgacagatgttcgtcatcaataa1542<210>2<211>513<212>PRT<213>地衣芽孢杆菌()<400>2MetLysLeuGluLysPheValAspArgLeuProIleProGlnValLeu151015GlnProGlnSerLysSerLysGluMetThrTyrTyrGluValThrMet202530LysGluPheGlnGlnGlnLeuHisArgAspLeuProProThrArgLeu354045PheGlyTyrAsnGlyValTyrProGlyProThrPheGluValGlnLys505560HisGluLysValAlaValArgTrpLeuAsnLysLeuProAspArgHis65707580PheLeuProValAspHisThrLeuHisAspAspGlyHisHisGluHis859095GluValLysThrValValHisLeuHisGlyGlyCysThrProAlaAsp100105110SerAspGlyTyrProGluAlaTrpTyrThrLysAspPheHisAlaLys115120125GlyProPhePheGluArgGluValTyrGluTyrProAsnGluGlnAsp130135140AlaThrAlaLeuTrpTyrHisAspHisAlaMetAlaIleThrArgLeu145150155160AsnValTyrAlaGlyLeuValGlyLeuTyrPheIleArgAspArgGlu165170175GluArgSerLeuAsnLeuProLysGlyGluTyrGluIleProLeuLeu180185190IleGlnAspLysSerPheHisGluAspGlySerLeuPheTyrProArg195200205GlnProAspAsnProSerProAspLeuProAspProSerIleValPro210215220AlaPheCysGlyAspThrIleLeuValAsnGlyLysValTrpProPhe225230235240AlaGluLeuGluProArgLysTyrArgPheArgIleLeuAsnAlaSer245250255AsnThrArgIlePheGluLeuTyrPheAspHisAspIleThrCysHis260265270GlnIleGlyThrAspGlyGlyLeuLeuGlnHisProValLysValAsn275280285GluLeuValIleAlaProAlaGluArgCysAspIleIleValAspPhe290295300SerArgAlaGluGlyLysThrValThrLeuLysAsnArgIleGlyCys305310315320GlyGlyGlnAspAlaAspProAspThrAspAlaAspIleMetGlnPhe325330335ArgIleSerLysProLeuLysGlnLysAspThrSerSerLeuProArg340345350IleLeuArgLysArgProPheTyrArgArgHisLysIleAsnAlaLeu355360365ArgAsnLeuSerLeuGlyAlaAlaValAspGlnTyrGlyArgProVal370375380LeuLeuLeuAsnAsnThrLysTrpHisGluProValThrGluThrPro385390395400AlaLeuGlySerThrGluIleTrpSerIleIleAsnAlaGlyArgAla405410415IleHisProIleHisLeuHisLeuValGlnPheMetIleLeuAspHis420425430ArgProPheAspIleGluArgTyrGlnGluAsnGlyGluLeuValPhe435440445ThrGlyProAlaValSerProAlaProAsnGluLysGlyLeuLysAsp450455460ThrValLysValProProGlySerValThrArgIleIleAlaThrPhe465470475480AlaProTyrSerGlyArgTyrValTrpHisCysHisIleLeuGluHis485490495GluAspTyrAspMetMetArgProLeuGluValThrAspValArgHis500505510Gln<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列()<400>3ccggaattcgatgaaacttgaaaaattcgttg32<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列()<400>4aaggaaaaaagcggccgcttattgatgacgaacatctgtcac42<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列()<400>5ccggaattcatgaaacttgaaaaattcgttgac33<210>6<211>42<212>DNA<213>人工序列()<400>6aaggaaaaaagcggccgcttattgatgacgaacatctgtcac42当前第1页1 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