本发明涉及透明质酸生物工程
技术领域：
，特别涉及一种小分子透明质酸干粉的高效生产方法。
背景技术：
：透明质酸(hyaluronicacid)简称ha，俗称玻尿酸，作为一种直链线性高分子黏性多糖，由β-1，3-n-乙酰葡糖胺和β-1，4-葡糖醛酸重复二糖单元组成。是人和动物组织细胞间质的主要成分，因其独特的分子结构和理化性质，使其具有强大的携带水分子能力、黏弹性和良好的生物相容性，已广泛应用于临床医学、化妆品、保健食品、整形美容等领域。透明质酸酶(hyaluronidase，haase)是广泛存在于自然界中的一类糖苷酶，通过特异性识别，作用于β-1，3糖苷键或β-1，4糖苷键来降解透明质酸。利用透明质酸酶可将高分子量透明质酸(mr≥105)降解为小分子量透明质酸(mr＝5kda～20kda)，甚至透明质酸寡聚糖(mr≤10kda)。根据文献研究表明，不同分子量大小的透明质酸分别具有不同的生物活性或生理学作用，高分子量透明质酸因其优良的携带水分子能力以及润滑功效，已广泛应用于化妆品行业及眼科、关节腔手术等领域。而小分子量透明质酸表现出非常高的生物活性，且极易透皮吸收，其在免疫调节、促进il-8，tnf等炎症因子代谢，加速伤口愈合、新骨和新血管生成，甚至抑制肿瘤细胞扩散方面有非常良好的功效，同时具有优良的生物相容性，因此，小分子透明质酸在化妆品、保健食品、临床医药等领域的应用前景非常广阔。当前小分子透明质酸的制备有物理方法，化学法和生物酶解法。物理方法有干热高温降解、超声波降解、机械剪切降解及γ-射线辐照等。化学方法有酸碱水解、强氧化剂水解等。这些方法易导致透明质酸变色，效率较低，终产物分子量范围较大，且有工业废水及涉及射线辐射等各种不足。生物酶解法利用透明质酸酶来酶切高分子量透明质酸，裂解成小分子量透明质酸甚至透明质酸寡糖，反应条件温和，终产物分子量易控制，绿色无污染。专利cn103484513a公开了一种酶法制备小分子寡聚透明质酸的方法，该专利利用水蛭来源透明质酸酶来降解透明质酸，得到寡聚透明质酸四糖、六糖、八糖、十糖。所述方法仅在实验室小批量进行，且酶添加量为100-13000u每毫克ha，酶的用量很大。同时，得到的小分子透明质酸和寡聚透明质酸终产物浓度较低，不易于工业化大规模生产。专利cn105670008a涉及到一种水溶性交联透明质酸干粉的制备方法，该专利的干燥方法是用有机溶剂反复沉淀、洗涤、抽滤、真空干燥得到交联透明质酸干粉。所述的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丙二醇或丙酮。此方法得到的干粉中仍残留有机溶剂，且涉及反复沉淀，有机溶剂的需求量巨大。同时，多次沉淀后的有机溶剂不能完全回收，易形成工业废液，造成污染。而且有机溶剂回收设备造价高昂。为解决现有技术生产小分子透明质酸浓度低，酶耗量大，有机溶剂残留的问题，本发明提供了一种高浓度小分子透明质酸的制备及其干粉的高效生产方法，是向反应体系中多次重复溶解高分子量透明质酸及多次添加一定酶活的透明质酸酶，反应一定时间得到高浓度小分子透明质酸溶液，再将高浓度小分子透明质酸溶液经过喷雾干燥，得到小分子透明质酸干粉。反应条件温和、耗酶量底、易操作、纯度高、产量高、无污染、经济高效，非常利于工业化大规模生产小分子透明质酸。技术实现要素：本发明提供了一种高浓度小分子透明质酸的制备及其干粉的高效生产方法，是通过以下步骤得到的：(1)向反应体系中溶解高分子量透明质酸，添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间。(2)向步骤(1)所得的酶解液中再溶解高分子量透明质酸，再添加一定酶活的透明质酸酶溶液，反应一定时间，完成高浓度小分子透明质酸的制备。(3)将步骤(2)所得的高浓度小分子透明质酸，通过过滤和喷雾干燥，得到小分子透明质酸干粉。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)中高分子量透明质酸的添加量为0.5-6kg(优选1-5kg，更优选3-4kg)，得到浓度为0.5％-6％(优选1％-5％，更优选3％-4％)的溶液。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(2)中高分子量透明质酸的添加量为0.5-6kg(优选1-5kg，更优选3-4kg)，得到浓度为1％-12％(优选2％-10％，更优选6％-8％)的溶液。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)和步骤(2)中分散溶解优选采用直径150mm，最大转速达1500转/分钟，锯齿状，可无级调速的分散盘。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)和步骤(2)中转速10-100转/分钟(优选45-50转/分钟)的搅拌桨，低速均匀搅拌反应。所述高分子量透明质酸的分子量为200kda以上，优选200kda-1200kda。所述反应体系的ph为3.5-8.0之间(优选4.5-6.5之间)，温度为25-50℃(优选35.5-42℃)。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)中反应时间为0.5-3小时(优选1-2小时)。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(2)中反应时间为1-10小时(优选2-7小时)。所述透明质酸酶为动物来源透明质酸酶、重组人透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、细菌来源透明质酸裂解酶中的一种或一种以上。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(1)和步骤(2)中透明质酸酶的添加量为1x104iu-5x106iu每公斤透明质酸(优选1x105iu-5x106iu)。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(2)和步骤(3)中高浓度小分子透明质酸为浓度3％以上优选(6-8％)，分子量150kda以下(优选1kda-100kda)，粘度1000mpa.s以下(优选500mpa.s以下)的透明质酸和透明质酸寡糖混合溶液。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(3)中过滤滤芯为pp熔喷滤芯、pp折叠滤芯、ptfe折叠滤芯中的一种(优选pp熔喷滤芯)，平均孔径是2-20um(优选5um)。所述的透明质酸为透明质酸金属盐或透明质酸衍生物。所述的高浓度小分子透明质酸及其干粉，步骤(3)中喷雾干燥为离心式高转速喷雾干燥，最高转速可达30000转/分钟(优选28000转/分钟)或压力式喷雾干燥中的一种。所述喷雾干燥机的参数为：进风温度：210-300℃(优选240-290℃)出风温度：100-160℃(优选100-140℃)雾化盘转速：18000-30000转/分钟(优选28000转/分钟)进料泵转速：30-120转/分钟(优选30-90转/分钟)所述小分子透明质酸干粉的干燥失重为小于9％(优选1-9％)，得率为75-99％(优选80-97％)。在100l反应体系中，加入92l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入4x106iu酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，再向反应体系中加入3x106iu-6x106iu酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到8％高浓度小分子透明质酸溶液。将喷雾干燥机进风温度控制在260-280℃，出风温度110-115℃，雾化盘转速28000转/分钟，进料泵65转/分钟，得到小分子透明质酸干粉。所述高浓度小分子透明质酸及其干粉，分子量为15kda以下(优选1-10kda)。所述小分子透明质酸干粉，优选易溶于水制成无色、透明、均匀液体。所述高浓度小分子透明质酸及其干粉，优选在化妆品、滴眼液、皮肤及软组织填充、关节腔注射液、胃肠道胶囊中的应用。本发明具有以下优势(1)本发明直接利用透明质酸酶，来降解高分子量透明质酸，得到高浓度小分子量透明质酸，再通过喷雾干燥，得到小分子透明质酸干粉。反应条件温和、耗酶量底、易操作、纯度高、产量高、无污染、经济高效，全程在封闭管道或罐体中进行，无任何废液、废气、废渣的排放。(2)机械操作安全程度高，且所涉及的机械和流水线经济适中。(3)本发明解决了高分子量透明质酸的溶解问题，同时，得到高浓度的小分子透明质酸，高浓度的小分子透明质酸还可根据需要稀释成各种浓度。(4)本发明无需任何有机或无机溶剂，得到的高浓度小分子透明质酸及其干粉，纯度不受外源物的污染，生物相容性好。(5)小分子透明质酸干粉粉末细腻、均匀，平均粒径在1nm-20nm之间，易溶于水的，水溶液清澈、透明，可配制成各种所需要的浓度，且便于储存和运输。(6)专利所涉及的工艺，使小分子透明质酸干粉的生产得率可达85％以上，适合工业化大规模生产。附图说明图1不同来源透明质酸酶制备高浓度小分子透明质酸效果对比图2不同ph值对透明质酸酶制备高浓度小分子透明质酸的影响图3不同高分子量透明质酸浓度对透明质酸酶制备高浓度小分子透明质酸的影响图4不同浓度的小分子透明质酸溶液喷粉前后分子量分布图5不同浓度的小分子透明质酸溶液动力粘度的变化曲线图6不同浓度的小分子透明质酸溶液所得干粉干燥失重率的变化曲线图7不同浓度的小分子透明质酸溶液所得干粉产率的变化曲线具体实施方式小分子透明质酸溶液及其干粉的分析方法：琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min，并和透明质酸标准品进行对比分析。实施例1不同来源透明质酸酶制备高浓度小分子透明质酸效果对比。在100l反应体系中，加入92l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入3x106iu酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，再向反应体系中加入5x106iu酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到8％高浓度小分子透明质酸溶液，取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图1所示，泳道3的重组人透明质酸酶降解得到的小分子透明质酸与泳道1的标准品对比，分子量基本在50kda以下。同理，在100l反应体系中，加入92l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入3x106iu酶活的牛睾丸来源透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，再向反应体系中加入5x106iu酶活的牛睾丸来源透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到8％高浓度小分子透明质酸溶液，取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图1所示，泳道4的牛睾丸来源透明质酸酶降解得到的小分子透明质酸与泳道5的标准品对比，分子量基本在150kda以下。同理，在100l反应体系中，加入92l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入3x106iu酶活的水蛭来源透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，再向反应体系中加入5x106iu酶活的水蛭来源透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到8％高浓度小分子透明质酸溶液，取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图1所示，泳道2的水蛭来源透明质酸酶降解得到的小分子透明质酸与泳道1和泳道5的标准品对比，分子量基本集中在150kda-50kda之间，也有部分小于50kda。实施例2不同ph值对透明质酸酶制备高浓度小分子透明质酸的影响。在7个100ml反应体系中，分别加入92ml水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸4g，将ph分别控制在4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0，温度36.5-37.5℃，分别加入4x103iu酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；取样灭活，进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。再分别向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸4g，再分别向反应体系中加入4x103iu酶活的重组人透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将7个反应体系全部升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到7种不同ph、浓度均为8％的小分子透明质酸溶液，分别取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图2所示，泳道5的重组人透明质酸酶在ph5.0条件下得到的小分子透明质酸与泳道14的标准品对比，分子量集中在50kda以下。实施例3不同高分子量透明质酸浓度对透明质酸酶制备高浓度小分子透明质酸的影响。在100l反应体系中，加入90l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸5kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入5x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸5kg，再向反应体系中加入5x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到10％高浓度小分子透明质酸溶液，取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图3所示，泳道2为得到的10％小分子透明质酸与泳道1和泳道6的标准品对比，分子量全部在150kda以下。同理，在100l反应体系中，加入92l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入4x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸4kg，再向反应体系中加入4x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到8％高浓度小分子透明质酸溶液，取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图3所示，泳道3为得到的8％小分子透明质酸与泳道1和泳道6的标准品对比，分子量全部在150kda以下。同理，在100l反应体系中，加入94l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸3kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入3x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸3kg，再向反应体系中加入3x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到6％高浓度小分子透明质酸溶液，取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图3所示，泳道4为得到的6％小分子透明质酸与泳道1和泳道6的标准品对比，分子量全部在150kda以下。同理，在100l反应体系中，加入96l水，1500转/分钟分散溶解400kda高分子量透明质酸2kg，控制ph5.0-6.0，温度36.5-37.5℃，加入2x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应1小时；，再向反应体系中分散溶解400kda高分子量透明质酸2kg，再向反应体系中加入2x106iu酶活的透明质酸酶溶液，45转/分低速均匀搅拌反应4小时，将反应体系升温至80℃终止反应，保持30分钟将酶灭活后，冷却至50℃以下，泵入5umpp熔喷滤芯过滤，得到4％高浓度小分子透明质酸溶液，取样进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图3所示，泳道5为得到的4％小分子透明质酸与泳道1和泳道6的标准品对比，分子量全部在150kda以下。实施例4不同浓度的小分子透明质酸溶液喷粉前后分子量分布以实施例3制备的10％、8％、6％和4％高浓度小分子透明质酸溶液，分别进行喷雾干燥。喷雾干燥机的参数为：进风温度：260-290℃；出风温度：110-120℃；雾化盘转速：28000转/分钟；进料泵转速：40-99转/分钟。喷雾干燥前的小分子透明质酸及干粉分别取样，进行琼脂糖凝胶水平电泳，80v条件下90min。如图4所示，4％、6％、8％的小分子透明质酸溶液的分子量都在标准品50kda分子量以下，而10％的小分子透明质酸溶液有大于标准品50kda的分子量分布。将泳道1和泳道2；泳道4和泳道5；泳道7和泳道8分别进行对比，喷粉前后，小分子透明质酸的分子量相差不大。实施例5不同浓度的小分子透明质酸溶液得到的干粉参数对比以实施例4得到的4种不同浓度的小分子透明质酸溶液，采用旋转粘度计分别进行动力粘度测试，结果见表1。表1不同浓度的小分子透明质酸溶液动力粘度的比较浓度4％6％8％10％溶液粘度/mpa.s122179263341不同浓度的小分子透明质酸溶液动力粘度的变化曲线，如图5所示，小分子透明质酸溶液粘度随着浓度的增大而增大。以实施例4得到的4种小分子透明质酸干粉，进行干燥失重率测试，结果见表2。表2不同浓度的小分子透明质酸溶液所得干粉的干燥失重率组别4％6％8％10％干燥失重率/％3.573.483.667.26不同浓度的小分子透明质酸溶液所得干粉干燥失重率的变化曲线，如图6所示，浓度为4％、6％和8％的小分子透明质酸溶液所得干粉的干燥失重率基本一致，而浓度为10％的小分子透明质酸溶液所得干粉的干燥失重率较高。以实施例4得到的4种小分子透明质酸干粉，进行产率计算，结果见表3。表3不同浓度的小分子透明质酸溶液所得干粉产率组别4％6％8％10％总体积/l100l100l100l100l高分子量ha添加量/kg46810干粉生产量/kg3.32525.17447.72168.4671干粉产率/％83.1386.2496.5284.67不同浓度的小分子透明质酸溶液所得干粉产率的变化曲线，如图7所示，浓度为4％、6％和8％的小分子透明质酸溶液所得干粉的产率持续升高，而浓度为10％的小分子透明质酸溶液所得干粉的产率较8％的小分子透明质酸溶液所得干粉的产率低。干燥失重率(％)＝(干粉重量值-干粉干燥恒重值)/干粉重量值x100％干粉产率(％)＝干粉产量值/高分子量ha添加量值x100％综上，本发明所得的小分子透明质酸溶液及其干粉，浓度高、干燥失重率小、产率高、分子量恒定、无污染、无需有机溶剂、便于运输和储藏，因此适合规模化工业生产和应用。当前第1页12