本发明涉及一种用于检测活细胞内过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用，属于荧光探针领域。
背景技术：
活性氧(ros)是生物体内含有氧原子并且性质活泼的一类物质的总称，生物体内的ros主要由分子氧经线粒体呼吸链电子传递产生，除线粒体外，其他内源性产生途径还有黄嘌呤氧化酶系统、nadh氧化酶系统、环加氧酶系统和一氧化氮合成酶系统等。过氧化氢作为活性氧的主要成员，是有氧存在时不可避免的副产物，它通过促进氧化应激时机体达到累积的氧化损伤。但生物体内的过氧化氢并不都是有害的，据文献报道，生理水平的过氧化氢对于细胞内多种过程的调控是必不可少的，如免疫细胞的活化、哺乳动物的血管重塑、植物中气孔的关闭和根的生长等。此外，越来越多的证据表明，过氧化氢还可以作为第二信使参与调节多种严重的疾病，包括阿尔茨海默氏综合征、神经退化性帕金森氏症和恶性肿瘤等。由此可见，能够适时准确地检测体内过氧化氢的含量对于某些疾病的预防、诊断以及病理的研究、生理过程的监控具有十分重要的意义。
过氧化氢本身稳定性差，通常情况下稳态浓度极低，反应活性高，且生物体内还存在着多种氧化物和抗氧化物的的干扰，使检测生物体内的过氧化氢存在着许多困难。目前，检测过氧化氢的方法主要有电子自旋共振法、化学发光法、分光光度法和荧光法等。荧光法是目前在生物体内检测过氧化氢的最为有效的方法，探针分子通过与过氧化氢特异性的结合或反应，造成其荧光的变化，通过测定这些变化达到测定过氧化氢的目的。更为重要的是，探针分子可以在不破坏生物活性的情况下进入细胞，靶向结合特定的分子或部位借助于激光共聚焦成像技术，实现细胞内过氧化氢的“可视化”，从而实现对它在生命体内进行“实时在线”的检测。设计合成具有选择性，高灵敏度，生物兼容性的荧光探针用于检测活细胞或组织体内的过氧化氢是目前生命化学领域的研究热点之一。而现如今关于过氧化氢的荧光探针普遍存在探针合成困难、检测选择性低、背景信号高、细胞毒性强、光稳定性差等缺点，使得过氧化氢的准确定量分析、生命体内“实时在线监测”等工作受到了诸多限制。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供一种用于检测活细胞内过氧化氢的荧光探针。
本发明的次要目的在于提供上述荧光探针的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述荧光探针在过氧化氢检测领域的应用。
本发明提供的技术方案具体如下：
一种用于检测活细胞内过氧化氢的荧光探针，具有以下结构：
一种制备上述荧光探针的方法，包括以下步骤：
(1)将4-氯-7-硝基-2,1,3苯并呋喃溶于乙醇中，再加入醋酸钠，边搅拌边滴加甲基哌嗪，室温下搅拌过夜，抽滤后，用乙醇洗涤固体若干次，得到化合物a，其化学结构式如下：
(2)将化合物a加入乙醇中，加热使其溶解，再加入醋酸钠和4-(溴甲基)苯硼酸，搅拌加热回流过夜，抽滤后，用乙醇洗涤固体若干次，即得到权利要求1所述的荧光探针。
优选地，化合物a、醋酸钠和4-(溴甲基)苯硼酸的摩尔用量为1:1.2:1.2。
上述荧光探针在过氧化氢检测领域的应用。
上述荧光探针检测活细胞内过氧化氢的应用。
本发明的原理为：本发明通过有机合成的方法，结合nbd类荧光母体环的结构，合成目标化合物bnbd；此时，化合物bnbd由于“光诱导电子转移效应”而具有极强的荧光强度；然而在过氧化氢氧化下，脱去硼酸基团，形成苯酚基团；此苯酚结构不稳定，继续被氧化后脱去苯醌结构，又生成化合物a。化合物a因失去“光诱导电子转移效应”，荧光强度受到极大的削弱，呈极弱的荧光现象。从而最终实现荧光“从有到无”检测过氧化氢的策略。
本发明具有以下优点和有益效果：
1.本发明首次合成了用于检测活细胞内过氧化氢的nbd类荧光探针，合成方法简单，后处理简便，无需经柱层析纯化，就能得到较高产率的最终产物。
2.本发明首次发现化合物bnbd对过氧化氢响应的机理，是通过过氧化氢氧化下，脱去硼酸基团，形成苯酚基团；此苯酚结构不稳定，继续被氧化后脱去苯醌结构，又生成化合物a(见图1)。
3.本发明实现了过氧化氢的荧光定量分析，在一定的ph范围内荧光性质比较稳定，检测选择性良好(见图2)，并且测试其线性相关性参数r2＝0.98(见图3)，具备定量分析溶液中过氧化氢的重要依据。同时，其检测下限可低至1.5nm，完全可应用于实际样本中过氧化氢的含量分析。
4.本发明实现了内源性过氧化氢的活细胞成像，结合脂多糖的刺激诱导，观察到随着脂多糖剂量的增加，细胞内荧光强度明显降低，表明内源性过氧化氢已明显增加。因此，化合物bnbd可为细胞或活体内过氧化氢的荧光监测提供新的思路。
附图说明
图1为化合物bnbd检测过氧化氢的发光原理示意图。
图2为化合物bnbd对过氧化氢特异性响应的曲线。
图3为化合物bnbd检测过氧化氢的线性关系曲线。
图4为化合物bnbd检测过氧化氢的细胞成像图；其中，图4(a)和图4(d)分别代表空白对照组的暗场和明场成像，图4(b)和图4(e)分别代表加入低剂量脂多糖的实验组的暗场和明场成像，图4(c)和图4(f)分别代表加入高剂量脂多糖的实验组的暗场和明场成像。
具体实施方式
以下通过具体实例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：化合物bnbd的合成
1)取25ml圆底烧瓶，加入4-氯-7-硝基-2,1,3苯并呋喃(502mg，2.5mmol)，使其溶于13ml乙醇后，加入醋酸钠(310mg，3.75mmol)，搅拌下逐滴加入甲基哌嗪(374mg，3.75mmol)，室温下搅拌过夜。抽滤混合物后，用乙醇洗涤数次后，得到590mg橙红色化合物a，产率89.4％，其化学结构式如下：
1h-nmr(300mhz,dmso)δ(ppm):8.435-8.403(d,j＝9.6hz,1h),6.643-6.612(d,j＝9.4hz,1h),4.065(s,4h),2.471-2.505(t,j＝5.1hz,4h),2.178(s,3h).
2)取50ml烧瓶，加入化合物a(199mg，0.75mmol)，加热使其溶解，在加热的状态下向其中加入醋酸钠(78mg，0.94mmol)，并迅速向里面加入4-(溴甲基)苯硼酸(204mg，0.94mmol)，在72℃加热下搅拌回流过夜。趁热抽滤混合物，用乙醇洗涤数次后，得到化合物bnbd220mg，产率60.4％。
1h-nmr(300mhz,dmso)δ(ppm):8.655-8.625(d,j＝9hz,2h),8.276(s,1h),7.956-7.931(d,j＝7.5hz,2h),7.560-7.585(d,j＝7.5hz,2h),6.836-6.806(d,j＝9hz,1h),4.784(s,2h),4.732(d,2h),4.281(t,j＝10.2hz,2h),3.814(t,2h),3.663(d,j＝11.7hz,2h),3.173(s,3h).
实施例2：化合物bnbd检测过氧化氢的选择性实验
将化合物bnbd溶于dmso中，配制成浓度为25μm的溶液，然后加入125μm不同种类的活性氧的磷酸缓冲溶液(ph＝7.8)，包括过氧化氢、一氧化氮、谷胱甘肽、硝酸钠、抗坏血酸钠、二氯二氰基苯醌、过氧化苯甲酰、次氯酸钠。等待0-10分钟后，设置激发波长460nm，收集波长535nm处的荧光信号强度。实验结果如图2所示，化合物bnbd对过氧化氢的响应最为灵敏，其荧光强度变化数值是其它种类活性氧的4倍多，由此证明化合物bnbd对过氧化氢具有良好的选择性。
实施例3：化合物bnbd检测过氧化氢的工作曲线
将化合物bnbd溶于dmso中，配制成125μm的溶液；然后分别加入不同浓度(0.044,0.44,3.33,5.55,8.88,9.99,13.13μm)的过氧化氢溶液；等待0-10分钟后，设置激发波长460nm，收集波长535nm处的荧光信号强度；以过氧化氢的浓度为横坐标，荧光强度的变化值为纵坐标，绘制工作曲线。测试其线性相关性参数r2＝0.98(见图3)，展示了良好的线性相关性，表明化合物bnbd可应用于过氧化氢的定量分析。
实施例4：化合物bnbd检测内源性过氧化氢的细胞成像
先将a549细胞传代培养2-10小时，设实验组加入脂多糖(低剂量500ng/ml，高剂量2μg/ml)共培养1-6小时，设空白对照组(即未添加脂多糖)；然后用大量pbs溶液反复洗涤a549细胞多次，再加入化合物bnbd(10-200μm)共孵育0.5-3小时；在488nm的激发波长下，通过激光共聚焦显微镜观察两组细胞的荧光强度。实验结果如图4所示，与空白对照组相比，实验组视野荧光强度明显降低，表明化合物bnbd具有良好的细胞膜穿透性，且能够响应细胞内的过氧化氢。此外，随着脂多糖剂量的增加，细胞内荧光强度显著降低，表明内源性过氧化氢含量已明显增加。这一结果与脂多糖可诱导产生内源性过氧化氢保持一致。综上所述，化合物bnbd可望应用于活细胞内过氧化氢的实时在线监测。