一组用于检测眼内液中EB病毒的LAMP引物及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，一组用于检测眼内液中eb病毒的lamp引物及应用。

背景技术：

eb病毒(epstein-barrvirus,ebv),又称人类疱疹病毒4型(humanherpesvirus4,hhv-4),它是一种γ亚科嗜淋巴细胞病毒属的dna致病病毒，具有在体内外专一性的感染人类及某些灵长类b细胞的生物学特性。主要通过唾液传播，无症状感染多发生在幼儿，3～5岁幼儿90％以上曾感染eb病毒，90％以上的成人体内都有病毒抗体。随着抗生素和激素类药物的广泛应用，病毒性眼内炎症越来越常见于眼科临床，且上升为主要致盲眼疾之一。

目前临床针对病毒的检测方法主要是分离培养和血清学诊断。这些检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，无法满足快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术,特别是pcr技术,在微生物快速鉴定和检测方面的应用,为病毒的快速检测开辟了新的途径。但是,pcr存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点,使其应用受到限制。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性的dna聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测病毒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一组用于检测眼内液中eb病毒的lamp引物组及应用。

本发明提供的lamp引物组，由引物f3-1、引物b3-1、引物fip-1、引物bip-1、引物lf-1和引物lb-1组成；

所述引物f3-1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；

所述引物b3-1为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子；

所述引物fip-1为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；

所述引物bip-1为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链dna分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；

所述引物lf-1为如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的单链dna分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链dna分子；

所述引物lb-1为如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的单链dna分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链dna分子。

所述引物组中，所述引物f3-1、所述引物b3-1、所述引物fip-1、所述引物bip-1、所述引物lf-1和所述引物lb-1的摩尔比可为0.5：0.5：2：2：1：1。

本发明还保护所述引物组的应用，所述应用为如下(b1)至(b6)中的任意一种：

(b1)在鉴别eb病毒中的应用；

(b2)在制备用于鉴别eb病毒的试剂盒中的应用；

(b3)在鉴定待测细菌是否为eb病毒中的应用；

(b4)在制备用于鉴定待测细菌是否为eb病毒的试剂盒中的应用；

(b5)在鉴定待测样本是否含有eb病毒中的应用；

(b6)在制备用于鉴定待测样本是否含有eb病毒的试剂盒中的应用。

上述应用，所述待测样本可为眼部临床样本培养物、眼液体或抽吸物。

本发明还保护含有所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)鉴别eb病毒；

(c2)鉴定待测细菌是否为eb病毒；

(c3)鉴定待测样本是否含有eb病毒。

所述试剂盒还可包括lamp反应体系中非引物外的其他试剂。

上述试剂盒中，所述待测样本可为眼部临床样本培养物、眼液体或抽吸物。

本发明还保护所述试剂盒在如下(c1)或(c2)或(c3)中的应用：

(c1)鉴别eb病毒；

(c2)鉴定待测细菌是否为eb病毒；

(c3)鉴定待测样本是否含有eb病毒。

上述应用，所述待测样本可为眼部临床样本培养物、眼液体或抽吸物。

本发明还保护所述引物组的制备方法，所述方法包括将各条引物分别独立包装。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，所述方法包括将所述引物组的的各条引物分别独立包装。

本发明中，在利用所述引物组或所述试剂盒鉴别eb病毒时，可按照包括如下步骤的方法进行：

(1)提取待测样本的基因组dna；

(2)以步骤(1)得到的基因组dna为模板，采用所述引物组或所述试剂盒进行lamp扩增反应，然后进行如下判断：

如果可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，所述待测样本为或候选为eb病毒；

如果不可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，所述待测样本不为或候选不为eb病毒。

在利用所述引物组或所述试剂盒鉴定待测细菌是否为eb病毒时，可按照包括如下步骤的方法进行：

(1)提取待测细菌的基因组dna；

(2)以步骤(1)得到的基因组dna为模板，采用所述引物组或所述试剂盒进行lamp扩增反应，然后进行如下判断：

如果可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，所述待测细菌为或候选为eb病毒；

如果不可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，所述待测细菌不为或候选不为eb病毒。

在利用所述引物组或所述试剂盒鉴定待测样本是否含有eb病毒时，可按照包括如下步骤的方法进行：

(1)提取待测样本的基因组dna；

(2)以步骤(1)得到的基因组dna为模板，采用所述引物组或所述试剂盒进行lamp扩增反应，然后进行如下判断：

如果可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，所述待测样本含有或候选含有eb病毒；

如果不可以实现以所述基因组dna为模板的特异性扩增，所述待测样本不含有或候选不含有eb病毒。

上文中，具体可通过如下方法判断“阳性扩增”：用荧光pcr仪检测荧光信号，如果出现阳性扩增曲线则为阳性扩增。所述阳性扩增曲线具体可为s型扩增曲线。

以上任一所述采用引物组进行lamp扩增的反应体系中，所述引物组中各引物的浓度为：0.5μm所述引物f3-1、0.5μm所述引物b3-1、2μm所述引物fip-1、2μm所述引物bip-1、1μm所述引物lf-1、1μm所述引物lb-1。

以上任一所述采用引物组进行lamp扩增的反应体系的10μl反应体系中可含有1μl10×thermopolbuffer，0.8m甜菜碱，0.5mg/mlbsa，4mmmgso4，0.3μl20×evagreen，1.5mmdntps，0.32u/mlbstdna聚合酶大片段，1μl所述引物组溶液，50pg-50ng模板dna，余量为水。其中，10×thermopolbuffer可为thermo产品，20×evagreen可为合肥博美生物科技有限责任公司产品。

以上任一所述lamp扩增的反应程序具体可为：65℃恒温50min。反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。

本发明提供了一组用于检测眼内液中eb病毒的lamp引物组及应用。本发明所述的lamp引物组包括外引物f3和b3，内引物fip和bip以及环引物lf和lb，在检测eb病毒时具有高特异性和高灵敏度。应用本发明的lamp引物组及方法，可快速、准确的检测出eb病毒。

附图说明

图1为实施例3的lamp扩增曲线图。

图2为实施例5的lamp扩增曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pgem-teasyvector载体：promega公司，产品货号a1360。

实施例1、鉴定eb病毒的引物组制备

进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定eb病毒的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于鉴定eb病毒的lamp引物组。

用于鉴定eb病毒的引物组，包括2条外引物(f3-1、b3-1)，2条内引物(fip-1、bip-1)和2条环引物(lf-1、lb-1)，各条引物序列如下所示(5’→3’)：

引物f3-1(序列表的序列1)：gttcgcgttgctaggcc；

引物b3-1(序列表的序列2)：aaggggaaaagttagaaactg；

引物fip-1(序列表的序列3)：ataccaggggcagtggtccctctcagtccagcgcgttta；

引物bip-1(序列表的序列4)：gtcctgcagctatttctggtcgctagggagaggtagaagac；

引物lf-1(序列表的序列5)：ggctgctgtctggcttacg；

引物lb-1(序列表的序列6)：atcagagcgccaggagtc。

该引物组中，引物f3-1、引物b3-1、引物fip-1、引物bip-1、引物lf-1和引物lb-1的摩尔比为0.5：0.5：2：2：1：1，各引物均独立包装。

实施例2、检测方法建立

利用实施例1的鉴定eb病毒的引物组检测eb病毒的方法包括：

1、提取待测病毒的基因组dna或提取待测生物样本的总dna。

2、取步骤1得到的总dna，作为模板，采用实施例1中制备的引物组进行lamp扩增。

10μllamp扩增的反应体系包括：1μl10×thermopolbuffer(thermo)，0.8m甜菜碱，0.5mg/mlbsa，4mmmgso4，0.3μl20×evagreen(合肥博美生物科技有限责任公司)，1.5mmdntps，0.32u/mlbstdna聚合酶大片段，引物混合物(f3-1、b3-1、fip-1、bip-1、lf-1和lb-1的混合物)，2ng模板dna，余量为ddh2o。反应体系中各引物的浓度如下：0.5μmf3-1、0.5μmb3-1、2μmfip-1、2μmbip-1、1μmlf-1、1μmlb-1。

lamp扩增的反应程序：65℃恒温50min。反应过程中，采用荧光pcr仪检测荧光信号。

如果采用引物组可以得到阳性扩增曲线，表明待测病毒为eb病毒或待测样本感染了eb病毒。

如果采用引物组可以得到阳性扩增曲线，表明待测病毒为eb病毒或待测样本含有eb病毒，如果不可以得到阳性扩增曲线，表明待测病毒为eb病毒或待测样本含有eb病毒。

实施例3、鉴定eb病毒的引物组的特异性

eb病毒参考品质粒构建：将序列表的序列7所示的eb病毒的dna片段插入至pgem-teasyvector载体的apai和saci酶切位点之间，得到参考品质粒。

待测样本分别为：eb病毒参考品质粒dna、单纯疱疹病毒ⅰ型基因组dna、单纯疱疹病毒ⅱ型基因组dna、水痘－带状疱疹病毒基因组dna、巨细胞病毒基因组dna。其中，单纯疱疹病毒ⅰ型、单纯疱疹病毒ⅱ型、水痘－带状疱疹病毒和巨细胞病毒参考品质粒dna均记载于文献“朱艳敏,吴亦栋,尚世强.检测7种疱疹病毒的基因芯片法及其初步应用[j].临床检验杂志,2009(5):363-365.”中，提取各病毒的基因组dna，即得到待测样本。

以待测样本为模板，采用实施例2的检测方法进行检测，并利用无菌水作为阴性对照。

结果见图1。图1中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度。由图1可见，eb病毒参考品质粒dna得到s型扩增曲线，扩增结果为阳性，单纯疱疹病毒ⅰ型参考品质粒dna、单纯疱疹病毒ⅱ型参考品质粒dna、水痘－带状疱疹病毒参考品质粒dna和巨细胞病毒参考品质粒dna均没有得到s型扩增曲线，扩增结果为阴性。结果表明，本发明的鉴定eb病毒的引物组具有很高的特异性。

实施例4、鉴定eb病毒的引物组的灵敏度

待测样本为：实施例3的eb病毒参考品质粒dna。

1、用无菌水10倍梯度稀释参考品质粒dna，得到各稀释液。

2、分别取步骤1得到的各稀释液作为模板，采用实施例2的检测方法进行检测，并利用无菌水作为阴性对照。

由于采用的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：

反应体系1中，参考品质粒dna的含量为：10000个拷贝；

反应体系2中，参考品质粒dna的含量为：1000个拷贝；

反应体系3中，参考品质粒dna的含量为：500个拷贝；

反应体系4中，参考品质粒dna的含量为：100个拷贝。

参考品质粒按上述体系进行检测。

结果表明，eb病毒参考品质粒的dna含量为500-10000个拷贝时均得到s型扩增曲线，含量为100个拷贝时和阴性对照没有得到s型扩增曲线。该结果表明本发明的鉴定eb病毒的引物组的可检测到500拷贝的eb病毒，具有较高的灵敏度。

实施例5、临床样本检测

待测样本为：经过临床鉴定为eb病毒的眼部抽吸物样本(eb病毒阳性样本)和经过临床鉴定不存在eb病毒的健康者的眼部抽吸物样本。

以待测样本的dna为模板，采用实施例2的检测方法进行检测，利用实施例3的eb病毒参考品质粒dna作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。

结果见图2。图2中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度。由图2可见，只有eb病毒阳性样本以及阳性对照得到s型扩增曲线，健康者样本和阴性对照没有得到s型扩增曲线，健康者样本的检测结果与临床鉴定结果相符。结果表明，本发明的鉴定eb病毒的引物组在进行eb病毒鉴定时，结果准确可靠。

对比例1、利用其他引物鉴定eb病毒

待测样本为：实施例3的eb病毒参考品质粒dna。

1、用无菌水10倍梯度稀释eb病毒参考品质粒dna，得到eb病毒参考品质粒dna稀释液；

2、以步骤的稀释液为模板，分别采用本发明的鉴定eb病毒的引物组、引物组a和引物组b，按照实施例2的检测方法进行检测，反应体系中eb病毒参考品质粒dna的拷贝数为500，并利用无菌水作为阴性对照。

引物组a序列信息如下：

a-f3:5′-tgtgacccttgggcctgg-3′

a-b3:5′-ctggctctttggcaggcc-3′

a-fip:5′-ccatagactcccatgtaattacatgggagtctatgg-3′

a-fip:5′-gacagggcgcgcatggcccaaaagtagaggctca-3′

a-lf:5′-cgggctgctgtctggctta-3′

a-lb:5′-cagagcgccaggagtcat-3′

引物组b序列信息如下：

b-f3:5′-atctaaggccaggagagg-3′

b-b3:5′-tagcagcagcgcagcc-3′

b-fip:5′-agccccaaagcgggtgattacctgttactgc-3′

b-fip:5′-accatagacccgcttcggcctaaaacccccag-3′

b-lf:5′-cgggctgttactgtctggc-3′

b-lb:5′-cagagcgcatccaggagt-3′

结果表明，本发明的鉴定eb病毒的引物组得到s型扩增曲线，引物组a、引物组b和阴性对照没有得到s型扩增曲线。

<110>一组用于检测眼内液中eb病毒的lamp引物及应用

<120>北京智德臻和医学检验所有限公司

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<213>人工序列

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