本发明属于血清标志物检测技术领域，涉及一种血清mirna组合的微创检测试剂盒。
背景技术：
mirna作为生物分子标志物虽然具有独特的优势，但也存在一些技术问题。如果样本量越大，独立检测队列越多，那么mirna预测准确性越高，越接近肿瘤人群整体的特征，但大样本的收集与处理存在一定难度，原因是入组样本有一定要求，符合要求样本不易收集，样本保存记录工作量大。
目前主流筛选候选标志mirna分子的手段一般是高通量方法初筛，然后再用即时聚合酶链式反应进行验证。虽然方法稳定，技术上比较成熟，但也容易出现一些假阳性结果。利用探针法检测候选mirna分子，在提升检测特异性的同时，也会降低实验灵敏度，一定程度上会存在漏诊率，且不同批次样本与实验试剂之间也会存在一些差异，而影响结果。
人体是一个复杂的体系，单一mirna预测存在一定的误诊及漏诊率，找寻肿瘤特异性的mirna也是问题关键，只有检测出肿瘤来源的mirna，并对其进行分析才能更好的预测患者预后。
目前，同类型标志物试剂盒多数以检测组织样本为主，且属于有创检查。并且，同类型血清检测分子通常为蛋白质，是一类容易降解，含量低，且受到检测方法限制的大分子物质，无法准确预测患者预后。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，其目的在于提供一种用于口腔鳞癌诊断及预后并且含有特定血清标志物的微创检测试剂盒。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
mir-626、mir-1537-3p、mir-4286和mir-5100联合使用作为口腔鳞癌分子标记物的应用，该应用不用于疾病的诊断和治疗，判断的方法为：
y＝0.586×cmir-626+0.407×cmir-1537-3p+0.401×cmir-4286+0.408×cmir-5100；
其中，cmir-626为单个个体100ul血清中mir-626的表达量，cmir-1537-3p为该个体100ul血清中mir-1537-3p的表达量，cmir-4286为该个体100ul血清中mir-4286的表达量，cmir-5100为该个体100ul血清中mir-5100的表达量；
当y≤5.282时，判断为低表达值或低风险值；
当y＞5.282时，判断为高表达值或高风险值。
其中，mir-626的成熟核苷酸序列如seqidno.1所示，mir-1537-3p的成熟核苷酸序列如seqidno.2所示，mir-4286的成熟核苷酸序列如seqidno.3所示，mir-5100的成熟核苷酸序列如seqidno.4所示。
一种口腔鳞癌mirna检测试剂盒，其包括：总rna抽提体系、pcr反转录体系、定量pcr体系；
所述总rna抽提体系含有植物来源的ath-mir159a作为后继定量pcr检测时的标定外参；
所述pcr反转录体系含有taqmanmirnaassay探针引物；
所述定量pcr体系含有分别针对mir-626、mir-1537-3p、mir-4286和mir-5100的扩增引物。
其中，针对mir-626的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，id：001559。
针对mir-1537-3p的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，id：000338。
针对mir-4286的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，id：476406_mat。
针对mir-4286的引物核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，id：477923_mir。
外参引物ath-mir159a的核苷酸序列由赛默飞世尔公司提供，货号：4440887，id：478096_mir。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明针对的样本是人体血清，而非人体组织，属于微创检测。
第二、本发明将mir-626、mir-1537-3p、mir-4286和mir-5100联合使用作为组合分子标记物，经过大数据临床验证实验，在口腔鳞癌的辅助诊断指标方面具有突出优势。这四个分子标记物首次应用于口腔鳞癌mirna检测试剂盒的开发，可以实现口腔鳞癌的辅助诊断，提高患者的生存率。
第三、本发明的口腔鳞癌mirna检测试剂盒选择了mir-626、mir-1537-3p、mir-4286和mir-5100这四个mirna标记物联合使用，检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。
第四、本发明的口腔鳞癌mirna检测试剂盒针对血清中作为定量反应的内参，不同样本中差异很大的因素，特别引入稳定的植物来源的rna序列ath-mir159a作为外参对照rna，极大提高了进行mirna检测时相对定量的准确度。
总之，本发明的新型口腔鳞癌患者的诊断和预后预测试剂盒，采用多个mirna分子组合，提高检测的灵敏度和特异性，降低单一分子预测试剂盒带来的检测误差，从而提高口腔鳞癌患者预后预测的可靠性，是一种为口腔鳞癌患者预后预测提供微创、高效、可靠的分子标志物试剂盒。
附图说明
图1为本发明的关于mir-626的受试者工作特征曲线。
图2为本发明的关于mir-1537-3p的受试者工作特征曲线。
图3为本发明的关于mir-4286的受试者工作特征曲线。
图4为本发明的关于mir-5100的受试者工作特征曲线。
图5为本发明的关于mir-626和mir-5100组合的受试者工作特征曲线。
图6为本发明的关于mir-626的总体生存曲线。
图7为本发明的关于mir-1537-3p的总体生存曲线。
图8为本发明的关于mir-4286的总体生存曲线。
图9为本发明的关于mir-5100的总体生存曲线。
图10为本发明的关于mir-626的另一条受试者工作特征曲线。
图11为本发明的关于mir-1537-3p的另一条受试者工作特征曲线。
图12为本发明的关于mir-4286的另一条受试者工作特征曲线。
图13为本发明的关于mir-5100的另一条受试者工作特征曲线。
图14为本发明的关于mirna组合的另一条受试者工作特征曲线。
具体实施方式
本发明采用了赛默飞世尔科技(中国)有限公司的产品，包括总rna(核糖核酸)抽提试剂(pn：a27828)、pcr反转录试剂(pn：4366596)、pcr定量试剂(pn：4427788)以及taqmanmirnaassays(货号：4440887；id：001559；id：000338；id：476406_mat；id：477923_mir；id:478096_mir)。
本发明的试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)、针对100ul人血清样本进行总rna抽提，抽提过程中外源性地加入植物来源的ath-mir159a，作为后续定量pcr检测实验的标定外参。
(2)、将抽提得到的总rna利用taqman探针引物进行rna反转录，得到特异性的mirna分子样本。这一步是本试剂盒的关键步骤之一，这一步利用探针的高特异性，大大提高了后续试剂盒检测过程中的特异性。
(3)、接下来将反转录得到的样本，进行探针法定量pcr反应，得到健康正常对照，以及肿瘤患者预后好坏的相对表达值，进行统计分析。
其中，本发明的试剂盒含有与口腔鳞癌有关的四个mirna分子，为mir-626、mir-1537-3p、mir-4286和mir-5100。这些mirna分子的筛选过程如下：
(1)、收集了25例口腔鳞癌和15例正常健康对照的血清样本共40例，其中25例口腔鳞癌患者具有完整的4年以上随访资料，将样本送至康成生物芯片公司进行mirna的高通量芯片检测。通过应用生物信息学以及统计学分析，得到在口腔鳞癌患者中相较于正常对照组高表达的mirna。
(2)、将25例患者中高表达的mirna进行样本和mirna共同聚类，发现一类与口腔鳞癌患者预后存在一定关联的mirna。
(3)、再将这些mirna与患者生存状况以及每条mirna所对应的每个患者的值，进行两样本的t检验的统计学分析，得到具有显著统计学差异的一类mirna。
(4)、进行即时聚合酶链式(qrt-pcr)反应，验证依据芯片数据所得到的分析结果。
(5)、针对即时聚合酶链式反应验证，得到与芯片数据分析结果一致的mirna。
(6)、进行扩大样本的验证，即在原来40例样本基础上，增加20例口腔鳞癌患者样本和15例正常对照样本，形成一个新的具有45例口腔鳞癌患者和30例正常对照的新的独立列队，进行即时聚合酶链式反应。
(7)、将所得的qrt-pcr结果进行相对定量分析，应用公式2–δδct计算每条mirna对应的每个患者的相对表达量。
(8)、以口腔鳞癌患者为唯一指标，将75例样本区分成两组，应用受试者工作特征曲线模型检测mirna作为诊断分子的有效性及准确性。
(9)、针对多个mirna进行logistics回归方程拟合统计，确定多个mirna分子联合诊断所对应的系数，建立mirna组合方程：mirna诊断组合＝(a1*mir-a+b1*mir-b+c1*mir-c+…+n1*mir-n)，得到联合预测因子，再进行受试者工作特征曲线模型检测mirna联合预测分子作为诊断分子的有效性及准确性。
(10)、以45例口腔鳞患者的相对表达量的中位数为截断值，小于等于截断值的样本定义为低表达组，大于截断值的样本定义为高表达组。针对两组患者进行生存曲线分析。以死亡口腔鳞患者为唯一指标，将45例口腔鳞患者样本分成两组，同样应用受试者工作特征曲线模型检测mirna作为预后诊断分子的有效应及准确性。针对多个mirna同样进行mirna组合分析，依据cox回归模型建立mirna联合预测因子，mirna预后组合＝(a1*mir-a+b1*mir-b+c1*mir-c+…+n1*mir-n)，得到联合预测因子预测患者预后，利用受试者工作特征曲线模型进行有效性及准确性的判断。
(11)、经过筛选可知，mir-626、mir-1537-3p、mir-4286和mir-5100四个mirna分子与口腔鳞癌有关。mir-626的成熟mirna序列为agcugucugaaaaugucuu，mir-1537-3p的成熟mirna序列为aaaaccgucuaguuacaguugu，mir-4286的成熟mirna序列为accccacuccugguacc，mir-5100的成熟mirna序列为uucagaucccagcggugccucu。
本发明主要通过收集25例具有四年以上完整随访资料的口腔鳞癌患者的术前血清，以及15例正常健康对照组的血清样本，进行mirna芯片检测，得到具有口腔鳞癌特异性的诊断mirna表达谱。
实施例
本实施例通过对25例具有四年以上完整随访资料的口腔鳞癌患者的mirna芯片结果进行统计，以每条mirna的标准化值的中位数作为截断值，将大于这个截断值的芯片值对应的患者定义为高表达组，小于等于这个截断值的芯片值对应的患者定义为低表达组，针对每条mirna计算相应的截断值，并对以此分成的高低表达组进行生存曲线的统计分析，得到能够特异性区分口腔鳞癌患者手术预后状况的特异性mirna，即生存曲线，具有统计学意义(p＜0.05)。具体如下：
(1)、针对芯片结果分析得出的结论，就25例口腔鳞癌患者和20例正常对照组进行qrt-pcr验证，验证得到与芯片结果相符合的mirna分别是mir-626、mir-1537-3p、mir-4286、mir-5100。
(2)、分别增加20例口腔肿瘤患者术前血清和15例正常健康对照组的血清，与进行mirna芯片检测的样本合并，形成一个具有45例口腔鳞癌患者术前血清样本以及30例正常健康对照组血清样本的队列。
(3)、对该队列针对mir-626、mir-1537-3p、mir-4286、mir-5100进行qrt-pcr验证分析。qrt-pcr结果分析如下：以30例正常对照组样本的δct值的中位数，作为标准值，应用公式2-δδct将标准值量化为1，以此方法及公式标准化45例口腔鳞癌患者和30例正常对照的所有血清样本的δct，得到45例患者和30例正常对照组的血清mir-626、mir-1537-3p、mir-4286、mir-5100的相对表达量。
(4)、应用logistic回归模型建立一个mirna组合，作为联合因子共同预测患者和正常对照，mirna组合＝(0.586*mir-626)+(0.407*mir-1537-3p)+(0.401*mir-4286)+(0.408*mir-5100)。
(5)应用4条mirna以及mirna组合对75例样本进行受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve)分析，预测口腔鳞癌的发生概率(见图1至图5)。
(6)、接下来以45例肿瘤患者血清样本的mirna的相对表达量值的中位数为标准，规定小于或等于此中位数的mirna的相对表达量值为此mirna的低表达值或者低风险值(low-riskmirna)。同样的，规定大于此中位数的mirna的相对表达量值为高表达值或者高风险值(high-riskmirna)，规定此mirna的中位数为区分mirna高低表达的截断值(cut-offvalue)。大于此截断值的mirna相对表达量值归为高表达组；小于或等于此截断值的mirna相对表达量值归为低表达组，与对应的患者生存状况以及生存月数，进行生存曲线分析。
(7)、针对血清mir-626、mir-1537-3p、mir-4286、mir-5100分别做上述分析，得出每条mirna的扩大肿瘤样本队列中的截断值，并且以此截断值作为扩大样本队列里的截断值，将扩大验证的样本队列分成mirna高表达组和低表达组。
(8)、与患者生存状况及生存月数对应后，进行生存曲线分析(见图6至图9)。
(9)、以生存死亡作为确定指标，针对mir-626、mir-1537-3p、mir-4286、mir-5100进行受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve)分析(见图10至14)。
(10、)诊断的受试者工作特征曲线的曲线下面积：mir-626：(0.784)；mir-1537-3p：(0.796)；mir-4286：(0.830)；mir-5100：(0.744)；mirna组合：(0.899)。
预测预后的受试者工作特征曲线的曲线下面积：mir-626：(0.788)；mir-5100：(0.845)；mir-626+mir-5100组合：(0.895)。
结果证明：多个mirna组合作为联合诊断因子进行诊断及预后的预测比单一mirna分子预测准确性更高。
总之，本发明采用即时聚合酶链式反应(real-timepolymerasechainreaction)技术将四种血清微小核糖核酸(microrna，mirna)作为新型生物分子标志物组合并用于口腔鳞癌患者预后检测，主要是利用了mirna与蛋白质结合后在血清中十分稳定且不易降解的特性，既保证了检测过程的可靠准确，也提高了检测结果的可信度，这在现有技术中尚未有报道。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院
<120>一种血清mirna组合的微创检测试剂盒
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>rna
<213>人类(hunman)
<400>1
agcugucugaaaaugucuu19
<210>2
<211>22
<212>rna
<213>人类(human)
<400>2
aaaaccgucuaguuacaguugu22
<210>3
<211>17
<212>rna
<213>人类(human)
<400>3
accccacuccugguacc17
<210>4
<211>22
<212>rna
<213>人类(human)
<400>4
uucagaucccagcggugccucu22