本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及梨干旱诱导转录因子pbrwrky53及其在提高植物抗旱能力方面的应用。
背景技术：
梨是当今世界上主要栽培的经济果树树种之一。中国是梨重要的起源地之一，是全世界梨产量位居第一的大国。我国梨优势产区的布局与规划极大地促进了梨产业的快速发展，因为梨产区在我国分布广泛，所以梨树的生长和发育很容易受到地理和气候条件等因素的影响，如干旱，冻害，盐碱等。因此，培育抗逆性强和综合性状良好的的抗逆新品种就成为了梨产业在我国发展至关重要的因素。然而由于梨在育种方面存在遗传杂合度高，世代周期长、大多数自交不亲和、育种目标不可确定性等问题，导致梨育种进展缓慢，常规的育种方法已经不能满足现代梨产业栽培对品种的需求。
根据统计，世界每年农作物50％的产量损失与非生物胁迫相关，20％的产量损失与病虫害等生物胁迫有关。例如，当植物受到干旱胁迫后会导致植物体内出现多种不良反应，如细胞内活性氧的积累以及渗透压的变化等。干旱胁迫通常能触发植物基因表达增强或减弱、代谢产物增加或减少、特异蛋白合成等应答活动。在干旱胁迫的情况下，植物为抵御干旱胁迫，其细胞内可以大量合成甜菜碱、脯氨酸、海藻糖、甘露醇等渗透性的有机小分子物质，以期增加细胞的渗透势，缩小与周围环境的渗透势差，从而使植物避免因高渗透势差导致细胞过度失水死亡。植物能通过积累多胺类化合物，如腐胺、亚精胺、精胺，来应答干旱胁迫。植物主要通过积累多胺类化合物、细胞内活性氧的清除、细胞内渗透压的调节来提高植物的抗旱性。因此，研究干旱胁迫下相关基因的调控途径及作用机理对于培育抗干旱新品种来说具有十分重要的意义。目前，尚没有梨抗干旱相关基因研究报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供梨干旱诱导转录因子pbrwrky53及其在提高植物抗旱能力方面的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：梨干旱诱导转录因子pbrwrky53，所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了所述的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明提供了所述的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53或所述的蛋白质在提高植物抗旱能力方面的应用。
优选的，所述植物包括烟草或梨。
优选的，所述植物为烟草时，包括以下步骤：
1)提供所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53；
2)将所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53与载体连接获得重组载体；
3)将所述重组载体转入根癌农杆菌中获得重组根癌农杆菌；
4)将所述重组根癌农杆菌侵染烟草，获得过表达梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的烟草。
优选的，步骤1)为：以梨叶片cdna为模板，进行pcr扩增得到梨干旱诱导转录因子pbrwrky53；所述扩增用引物对包括正向引物f1和反向引物r1；所述正向引物f1的序列如seqidno.3所示；所述反向引物r1的序列如seqidno.4所示。
优选的，所述梨为秋子梨。
优选的，所述植物为秋子梨时，所述应用采用瞬时转化方法将所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53转入秋子梨中。
本发明的有益效果：本发明提供的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53，经生物学功能验证具有提高植物抗旱能力的作用，过表达所述的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。本发明提供的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好；所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53能够应用于抗旱植物品种的培育，根据实施例部分的记载，烟草和秋子梨的转基因超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升，烟草的转基因超表达株系中过氧化氢(h2o2)及丙二醛(mda)的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。
附图说明
图1为本发明梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的克隆、分离和功能验证的流程示意图；
图2为实施例2中梨干旱诱导转录因子pbrwrky53在脱水、低温4℃和脱落酸胁迫下的表达示意图；
图3为实施例3中本发明梨干旱诱导转录因子pbrwrky53亚细胞定位图；
图4为实施例4中表达重组载体的构建流程和载体结构图，其中图4a为重组表达载体的构建流程，图4b为pmv载体结构图；
图5为实施例4中pbrwrky53转化烟草及植株再生过程示意图；
图6为实施例4中转pbrwrky53基因株系及野生型(wt)干旱处理前后的表型和生理指标测定图；
图7为实施例5中pbrwrky53基因瞬时转化秋子梨株系(oe1和oe2)及野生型植株(wt)室温下干旱处理14天后的表型和生理指标测定图；
图8为实施例4中烟草植株和实施例5秋子梨植株，在室温下干旱处理后未转化株系和转化株系组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子自由基含量和丙二醛含量的测定结果图。
具体实施方式
本发明提供了梨干旱诱导转录因子pbrwrky53，所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的核苷酸序列如seqidno.1所示。在本发明中，所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53优选的来源于杜梨(pyrusbretschneideri)，所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53包含1044bp的开放阅读框。
在本发明中所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53通过以下方法获得：从杜梨叶片中提取获得杜梨的rna；将所述rna反转录获得cdna；以所述cdna为模板，用正向引物f1和反向引物r1扩增获得所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53。在本发明中，所述正向引物f1的序列如seqidno.3所示，具体为5’-ggtgagcttaggagagggccatggactc-3’；所述反向引物r1的序列如seqidno.4所示，具体为5’-cgctgctcgtgtcgattcggagatgccgg-3’。
在本发明中，所述杜梨叶片优选的采用长势健壮的杜梨幼苗的叶片，所述杜梨的rna的提取采用本领域常规的植物组织rna提取方法即可，无其他特殊限定，在本发明具体实施过程中采用ctab法，所述ctab法提取rna的步骤和方法采用本领域常规步骤和方法即可。
本发明在获得杜梨rna后，反转录获得cdna；在本发明中所述反转录采用本领域常规的方法即可，优选的采用toyobo反转录试剂盒进行，具体方法步骤参照所述试剂盒的说明书。
本发明在获得所述cnda后，以获得的cdna为模板，用正向引物f1和反向引物r1扩增获得所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53。在本发明中所述所述正向引物f1的序列如seqidno.3所示；所述反向引物r1的序列如seqidno.4所示。在本发明具体实施过程中，所述扩增体系优选的为50μl体系，所述扩增体系包括100ng模板dna，5×q5反应缓冲液(q5reactionbuffer)，10mmdntps，1uq5高保真聚合酶(q5high-fidelitydnapolymerase)，1.0μm正向引物和1.0μm的反向引物。本发明中所述的5×q5缓冲液和q5高保真聚合酶优选的购自newenglandbiolabs公司。本发明中所述扩增反应的程序优选的为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。
本发明在扩增获得所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53后，优选的将扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收后测序验证获得所述梨转运体基因pbralmt9的核苷酸序列。
本发明还提供了所述的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。所述pbrwrky53编码的蛋白质包括347个氨基酸，等电点为5.80，计算的分子量为38.76kda。本发明所述的蛋白质的亚细胞定位在细胞核，属于核蛋白；能够有效的增强植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。
本发明提供了所述的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53或所述的蛋白质在提高植物抗旱能力方面的应用。
在本发明中，所述植物优选的包括烟草。当本发明所述植物为烟草时，包括以下步骤：1)提供所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53；2)将所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53与载体连接获得重组载体；3)将所述重组载体转入根癌农杆菌中获得重组根癌农杆菌；4)将所述重组根癌农杆菌侵染烟草，获得过表达梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的烟草。
在本发明中，步骤1)优选的为：以梨叶片cdna为模板，进行pcr扩增得到梨干旱诱导转录因子pbrwrky53；在本发明中所述pcr扩增获得梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的具体方法和步骤参见上述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的获得方法，在此不再赘述。
本发明在获得梨干旱诱导转录因子pbrwrky53，将所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53与载体连接获得重组载体，在本发明中所述载体优选的为pmv载体，在本发明中所述重组载体的构建方法具体包括以下步骤：
将获得的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53与载体分别进行双酶切获得酶切片段和酶切载体；然后将所述酶切片段与所述酶切载体连接获得重组载体。
在本发明中，所述双酶切所用的酶优选的为kpni和sali。在本发明中所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53双酶切的温度优选的为36～38℃，更优选的为37℃，所述双酶切的时间优选的为10～14h，更优选的为12h；所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53酶切的双酶切体系总体积优选的为20μl，包括梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的pcr的纯化产物10μl，10×g缓冲液2μl，kpni和sali各1μl，双蒸水6μl。在本发明中，所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53双酶切后，回收纯化酶切产物获得酶切片段。在本发明中，所述载体双酶切的温度优选的为36～38℃，更优选的为37℃，所述载体双酶切的时间优选的为10～14h，更优选的为12h；所述载体双酶切反应体积优选的为20μl，包括所述pmv载体8μl，10×m缓冲液2μl，kpni及xhoi各1μl，双蒸水8μl。本发明在所述载体双酶切后，回收纯化酶切产物获得酶切载体。
本发明在获得所述酶切片段和酶切载体后将所述酶切片段与所述酶切载体连接获得重组载体。在本发明连接反应中，所述酶切片段与所述酶切载体的摩尔比优选的为(2～4)：1，更优选的为3:1。在本发明中所述连接反应的总体积优选的为10μl，包括10×buffer1μl，t4dna连接酶1μl，双酶切回收酶切片段4ul，双酶切回收酶切载体2μl，双蒸水2μl。在本发明中，所述连接反应的温度优选的为14～18℃，更优选的为16℃；所述连接反应的时间优选的为14～16h。本发明在所述连接反应结束后收集所述连接反应的产物获得重组载体。
本发明在获得重组载体后，优选的将所述重组载体转化大肠杆菌菌株dh5α，进行菌落pcr测序验证所述重组表达载体是否构建成功；在本发明中所述菌落pcr测序验证的方法采用本领域常规的菌落pcr测序验证方法。
本发明在获得重组载体后，将所述重组载体转入根癌农杆菌中获得重组根癌农杆菌；在本发明中，将所述重组载体转入根癌农杆菌的方法优选的为冻融法，在本发明中具体冻融法的方法步骤(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。
本发明在获得所述重组根癌农杆菌后，将所述重组根癌农杆菌侵染烟草，获得过表达梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的烟草。在本发明中，所述重组根癌农杆菌侵染烟草的方法为：用所述重组根癌农杆菌的菌液浸泡侵染烟草叶片后进行共培养，筛选获得过表达梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的烟草。本发明将所述重组根癌农杆菌经液体扩大培养后获得菌液，所述菌液的od600优选的为0.4～0.6，更优选的为0.5。在本发明中所述浸泡侵染的时间优选的为8～10min，所述浸泡侵染过程中伴随震荡；所述震荡的转速优选的为200～300rpm，更优选的为250rpm。本发明中所述浸泡侵染时菌液的量优选的为能够完全浸泡烟草叶片。
在本发明中，所述共培养的培养基优选的为添加6-ba和naa的ms培养基；本发明中所述共培养培养基中6-ba的添加量优选的为1.5～2.5mg/l，更优选的为2.0mg/l，所述naa的添加的量优选的为0.25～0.35mg/l，更优选的为3.0mg/l。本发明中所述共培养的时间优选的为1～3d，所述共培养的温度24～26℃，所述共培养优选的为暗培养。
本发明在所述共培养结束后，优选的进行过表达梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的烟草筛选。在本发明中所述筛选优选的利用添加卡那霉素和头孢霉素的筛选培养基进行，能够在添加卡那霉素和头孢霉素的筛选培养基中生长的烟草即为过表达梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的烟草。
本发明在获得所述过表达梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的烟草后优选的进行所述过表达梨转运体基因pbralmt9烟草的生根培养和移栽获得转基因烟草株系。本发明中所述生根培养和移栽采用本领域常规的方法即可。
本发明在获得所述转基因烟草株系后，优选的还进行了转基因阳性植株的检测验证。在本发明中所述检测优选的为利用梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的特异引物进行pcr扩增检测。本发明中所述pcr扩增检测的反应程序及体系分别见表3、表4。在获得的烟草株系中，能扩增出预期大小的片段，则表明为阳性转基因株系。
在本发明中，当所述植物为梨时，优选的为秋子梨。所述植物为秋子梨时，所述应用采用瞬时转化方法将所述梨干旱诱导转录因子pbrwrky53转入秋子梨中。在本发明中所述瞬时转化方法具体包括以下步骤：将上述重组根癌农杆菌注射到秋子梨叶片上侵染秋子梨植株，然后将所述侵染后的秋子梨植株继续培养获得瞬时转化的秋子梨。本发明中所述重组根癌农杆菌的od600值优选的为1.2～1.8，更优选的为1.5；在本发明中被侵染的秋子梨优选的为人工培养的4～6周的秋子梨植株，所述人工培养的设备优选的为人工气候培养箱。所述重组根癌农杆菌在侵染秋子梨叶片之前，优选的用乙酰丁香酮溶液悬浮，所述乙酰丁香酮溶液中乙酰丁香酮的浓度优选的为150～250μm；所述乙酰丁香酮溶液优选的还包括8～12mmmes(ph5.6)和8～12mmmgcl2。
下面结合实施例对本发明提供的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53及其在提高植物抗旱能力方面的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
梨pbrwrky53基因全长cdna的克隆
通过筛选梨全长cnda文库筛选到一个干旱诱导转录因子pbrwrky53，根据pbrwrky53基因的序列和primerpremier5.0设计引物，用rt-pcr方法从杜梨上扩出其全长。详细步骤如下：
研究材料杜梨种植在南京农业大学国家梨工程中心，其苗龄为65天。挑选生长势健壮的杜梨幼苗，随机称取0.3g样品，立即用液氮进行速冻。采用ctab法提取rna，具体方法如下：
实验前的准备：用10％depc水处理实验所需的各类枪头、1.5ml离心管、2ml离心管、50ml冻存管、研钵以及研棒。所需实验用品均要提前处理12h以上，高温高压灭菌，烘干以备用。
(1)称取0.2g杜梨叶片，在研钵中迅速倒入液氮，将样品迅速地研磨成粉末状，注意要充分研磨，适量倒入液氮研磨3到4次，次数不宜过多，以防止样品反复冻融而损坏rna结构，然后加入1mlctab提取液(含β-巯基乙醇20-40ul/ml)，置于室温解冻，并转入2ml离心管中，最后用ctab提取液配平；
(2)将样品放在浮板中，于65℃水浴锅水浴30min，每隔5-10min颠倒摇匀一次，然后4℃，12000rpm，离心20min；待离心后，将上清液用移液枪转移至新的已提前预冷的2ml离心管中，最后用ctab提取液找平；
(3)在通风橱内用移液枪加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，于涡旋仪上剧烈震荡5min，然后4℃，12000rpm，离心20min；用移液枪将上清液吸取至另一新的已提前预冷的2ml离心管中(吸取上清液时不要吸到蛋白层，防止蛋白污染)；于通风橱中，加入与其等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，剧烈震荡5min，4℃，12000rpm，离心20min；
(4)用移液枪吸取上清液到另一个新的已提前预冷的1.5ml离心管中；然后向其内加入2/3体积的氯化锂，用涡旋仪颠倒混匀即可；于-20℃冰箱中反应6-10h；
(5)4℃，12000rpm，离心30min；加入1ml已提前预冷的75％无水乙醇洗涤沉淀，后充分混匀洗1-2min，4℃，12000rpm，离心2-3min，去掉上清液；重复洗涤3-4次，去掉上清液；4℃，12000rpm，空管离心2-3min，用移液枪将每管多余的液体吸出；然后将离心管的盖子打开，放置于超净工作台里用无菌风吹干；
每管中加入适量的depc水溶解(可以离心溶解，4℃，12000rpm，离心2-4min)，4℃放置5-10min，最后后立即于-80℃超低温冰箱中保存以备用。取1-2ul琼脂糖凝胶电泳，用nano-drop仪进行检测，检测其浓度为350ng/ul。
将0.5g杜梨样品用液氮研磨，吸1mltrizon试剂进行提取rna，接着将1μg总rna样品经1u的dnasei37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μl50mmedta65℃处理10min后立即置于冰上。cdna第一链的合成参照toyobo反转录试剂盒的操作手册进行。所得的第一链cdna用于pbrwrky53基因的扩增。pcr按以下程序完成：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。扩增完成后产生单一条带的pcr产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒按照使用说明提取步骤，回收特异目的条带。回收纯化的溶液与pmd19-t载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为3:1连接。反应总体积是10μl，其中5μlbuffer，4.5μl的pcr纯化的产物，0.5μl载体。16℃连接过夜，采用热击法转化到大肠杆菌感受态dh5α中，以目的基因序列引物进行pcr验证(与上述基因扩增时的pcr程序一致)并测序(由上海英潍捷基公司完成)。
实施例2
不同逆境条件处理下梨干旱诱导转录因子pbrwrky53基因的qrt-pcr分析
为了分析杜梨中pbrwrky53基因对脱水(图2a)，低温(图2b)和脱落酸(图2c)的响应模式，使用real-timepcr技术对pbrwrky53基因的表达模式进行分析。采用ctab法提取rna，cdna第一链的合成参照toyobo反转录试剂盒的操作手册进行。在20μl的反应体系中有：10ul2×mix，0.1ulcdna，5μl引物(以ubiqutin为内参引物，长度为208)，4.9ul水。定量pcr的程序如下：
表1定量pcr程序
当对植株进行脱水处理时，如图2a所示，pbrwrky53基因的转录水平在植物受到脱水处理后转录水平逐渐上升，在6h的时候达到最高，是未处理时的4倍多，表明了pbrwrky53基因对脱水有强烈的响应。当对植株进行4℃低温处理时，如图2b所示，pbrwrky53基因的转录水平1h有缓慢降低，然后逐渐地升高至6h，从6h到72h没有明显的变化，是未处理的1倍多，说明pbrwrky53基因对4℃低温响应不明显。当对植株进行aba处理时，如图2c所示，pbrwrky53基因的转录水平在植物受到aba处理后转录水平逐渐上升，在120h的时候达到最高，是未处理时的2倍多，表明了pbrwrky53基因aba有强烈的响应。
实施例3
梨干旱诱导转录因子pbrwrky53基因的亚细胞定位
根据pbrwrky53基因的核苷酸序列和pjit166-gfp载体图，在基因序列前后分别加入ncoi和bstpi酶切位点。酶切位点的序列如下所示：
ncoi：ccatgg
bstpi：ggtgacc
将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物扩增，所用pcr程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。酶切位点的引物序列如下所示：
d-f1：ggccatggctcagcttacccttctcacaaatctg(seqidno.5)
d-r1：ttggtgacccctcaccttctgtgttgtgggagcc(seqidno.6)
基因3′去除了终止密码子tag，目的是让基因与gfp融合。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。回收纯化的扩增片段克隆到pmd19-t载体中，转化到大肠杆菌感受态dh5α中。将转化后的菌液用pcr检测，pcr鉴定呈阳性的菌液送去测序，提取测序结果正确菌液和pjit166-gfp载体的质粒。将两者均用sali和bamhi进行双酶切，分别纯化回收酶切过后的产物pbrwrky53基因和pjit166-gfp载体。两者经t4-dna连接酶连接，16℃过夜，转化大肠杆菌感受态dh5α，将得到的重组载体命名为pjit166-gfp-pbrwrky53。
采用原生质体转化的试剂和方法，所用试剂：拟南芥原生质体酶解液(提前一天晚上配好，4℃保存)：0.4m甘露醇；1％纤维素酶；0.1％离析酶；5mmmes；0.1％果胶酶。
方法：在55℃水浴中加热10min，使各种蛋白酶失活，同时增强纤维素酶等的溶解性，然后冷却到室温，再加入以下两种试剂：0.15％bsa和8mmcacl；mamg溶液：0.4m甘露醇；0.1％mgcl；4mmmes；w5溶液(现配现用，培养时注意加羧苄抗生素)：154mmnacl；125mmcacl；5mmkcl；2mmmes；pegsolution(40％，v/v)：4gpeg4000(sigma-fluka，#81240)溶于4ml水中；0.72868g甘露醇加入到3ml水中，加入1ml1mcacl溶解，如不溶解的话，可以放到65℃助溶。将两者混到一起，完全混匀后，定容到10ml，最后用koh调ph到7.5-8.0。
通过将pbrwrky53-gfp和对照空载35s-gfp的质粒转化到拟南芥的原生质体中，通过检测原生质体中的gfp荧光的位置来确定pbrwrky53蛋白定位的定位情况，结果如图3所示，其中图3a为对照空载体的定位，绿色荧光布满整个细胞；图3b为pbrwrky53-gfp在拟南芥原生质体中的瞬时表达，绿色荧光分布在细胞核上，而未在其他地方发现绿色荧光。结果表明，pbrwrky53基因定位在细胞核，是一个核蛋白。
实施例4
梨干旱诱导转录因子pbrwrky53在提高烟草抗旱性中的应用
1.植物转化载体构建
根据pmv载体(切除gus基因的植物二元转化载体pbi121中)的多克隆位点和pbrwrky53基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用primerprimier5.0软件设计出扩增基因整个编码区的上、下游pcr引物(该引物对就是扩增pbrwrky53基因cdna序列的引物对)。以pbrwrky53基因的克隆子为模板进行pcr扩增。pcr扩增的退火温度为58℃，pcr反应体系及扩增程序与pbrwrky53基因克隆相同。在扩增过后进行双酶切，双酶切体系总体积为20μl，其中：pcr的纯化产物10μl，10×g缓冲液2μl，kpni及sali各1μl，双蒸水6μl。酶切在37℃中进行，酶切过夜后做胶纯化回收。pmv载体双酶切反应体积为20μl，其中：有pmv的载体质粒8μl，10×m缓冲液2μl，kpni及xhoi各1μl，加双蒸水8μl。同样放置于37℃酶切过夜后纯化回收。在连接反应体系中加入pbrwrky53基因与载体pmv的摩尔比为3:1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer1μl，t4dna连接酶1μl，双酶切回收的pbrwrky53基因4ul，双酶切回收的pmv载体产物2μl，双蒸水2μl，在16℃反应14-16h得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌dh5α，在含有50mg/l的卡那霉素的lb固体平板中培养。将筛选出的阳性克隆，调点后摇菌，抽提质粒进行酶切及pcr鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为pmv-pbrwrky53重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pmv-pbrwrky53导入到农杆菌gv3101中。
2.农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：
(1)农杆菌培养：取超低温冰箱(-80℃)中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/l的lb的平板培养基上划线，刮取划线菌斑，加入液体ms基本培养基中，28℃，500转/min振荡培养，待菌液浓度达到od＝0.6-0.8时作浸染。
(2)浸染：取未转基因的烟草叶片，切成0.5×0.5cm大小，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8-10min，期间不断振荡。
(3)共培养：取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上(叶背面向上)，25℃暗培养2天。
(4)筛选培养：经共培养2天后的烟草叶片，用500mg/l浓度的头孢霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗次5-6次，再转移入添加了100mg/l卡那霉素和500mg/l头孢霉素的筛选培养基中。
(5)生根培养：待筛选培养基上的不定芽长到1-2cm左右时，切下并转入添加了100mg/lkm和500mg/lcef生根培养基上。
(6)烟草苗转入土培：待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。烟草转化苗所用培养基见表2。
表2烟草转化苗所用培养基配方
3.转基因阳性苗的的筛选
按照上述方法得到转pbrwrky53基因烟草，把每株烟草提取dna，设计引物并进行pcr扩增鉴定阳性苗。
3.1烟草叶片dna提取
(1)取0.2g的烟草幼嫩叶片放入1.5ml离心管中，加液氮，用研磨棒充分研磨成粉末状；然后加入600μl65℃预热的dna提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵(简称ctab)，配方：100mmtris-hcl(ph8.0)，1.5mnacl，50mmedta(ph＝8.0)溶液加1％聚乙烯吡咯烷酮，2％(体积)ctab，65℃水浴充分溶解备用，用前在65℃水浴预热后，加入1-4％(体积)巯基乙醇，混匀；
(2)65℃温浴60-90min，隔15min取出上下轻轻颠倒混匀；10000g室温离心10min；取上清液500-600μl，加入等体积的氯仿异戊醇(氯仿：异戊醇体积比为24:1)，颠倒混匀抽提5min；
(3)10000g离心10min；取上清450μl(注意勿吸取蛋白层，导致蛋白污染)，加入900μl-20℃预冷无水乙醇，34μl5mnacl，颠倒混匀后，-20℃冰冻30min。
(4)10000g，离心10min；弃上清后，用1ml70％的乙醇洗涤3次后，空管离心三分钟，放到超净工作台吹半小时，直至dna呈无色透明状，加适量双蒸水，放置于65℃烘箱中溶解15min，做胶检测。
3.2阳性转基因植株检测
采用引物基因特异引物进行pcr扩增。反应程序及体系分别见表3、表4。釆用35s+基因右侧内引物进行pcr，选取的转基因株系中，有转基因株系能扩增出预期大小的片段，表明这它们为阳性转基因株系。
表3pcr反应程序
表4pcr反应体系
4、pbrwrky53转基因阳性植株抗旱功能的检测
提取移栽成活的5株转基因阳性苗的rna，通过跑胶检测其结构完整，如图6所示，利用nanodrop测定其浓度后(浓度均在200-600ng/ul)，将rna总量调整为3ug后进行反转录成cdna，再用烟草的ubiqutin作为内参进行扩增。ubiqutin引物核苷酸序列为：
ubiqutin正向引物：5’-agctacatgacgccatttcc-3’(seqidno.7)ubiqutin反向引物：5’-ccctgtaaagcagcaccttc-3’(seqidno.8)
用ubiqutin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cdna浓度相同，后再用pbrwrky53特异引物作为模板扩增目的条带，pbrwrky53引物核苷酸序列为：
pbrwrky53正向引物：5’-ccaaggttgcagcagaagat-3’(seqidno.9)
pbrwrky53反向引物：5’-tgtcaccacaatggaaagga-3’(seqidno.10)
根据pbrwrky53特异引物扩增出来的目的条带的亮度大小，可以判断出pbrwrky53基因在阳性转基因烟草中的表达量，选择亮度高的2和3，即表达量高的两个超表达株系命名tg2和tg3作为单独的转基因株系，然后分别作为收种子的母本植株。
为了鉴定pbrwrky53转基因烟草是否和抗旱胁迫有关，将对照系和转基因系进行短时间的干旱胁迫和长期的干旱逆境处理。同一批次收到的pbrwrky53转基因系(tg2，tg3)烟草种子和野生型(wt)种子灭菌处理后分别播于ms筛选培养基和常用的ms无抗培养基上，待幼苗长到2-3片子叶时，取叶片呈现绿色的幼苗移栽于营养钵中(蛭石:营养土＝1:1)，在温室中培养其幼苗，培养温度为22℃。取每个系45天大的整盆幼苗放在室温下干旱处理14天后，观察其表型，并分别测其组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。结果表明，在处理过程中，2个转基因系(tg2，tg3)的植株明显比野生型(wt)表现更抗旱(图6)。
4.在转基因烟草株系中，电导率较低和成活率高表明他们可能具有比wt有更强的抗ros的能力。那么通过鉴定植株中ros的积累量便成为必要。将材料在室温下干旱处理后，观察其表型，取样，并分别测其组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。如图8(a-c)所示，将烟草干旱胁迫14天之后，测定了其组织中的过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，野生株系型的过氧化氢含量和丙二醛含量均显著地高于2个转基因株系，且两个转基因株系组织中的抗超氧阴离子自由基含量高于对照系。这些证据表明，转基因烟草株系在受到干旱胁迫后体内所积累的活性氧残留量较对照系少，细胞损伤更小。进而表明，过表达的pbrwrky53基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。
实施例5
梨干旱诱导转录因子pbrwrky53在提高秋子梨抗旱性中的应用
瞬时转化梨干旱诱导转录因子pbrwrky53的秋子梨株系的制备，具体方法如下：
1.选取在人工气候室中生长5周左右的秋子梨(pyrusussuriensis)用于农杆菌侵染。
2.于lb培养基(含50mg/lkanamycin+100mg/lrifampicin+50mg/lgentamycin)划线培养带有目的质粒的gv3101农杆菌，挑取农杆菌克隆于5mllb培养基中28℃培养过夜。
3.测定农杆菌菌液od600值之后，3000rpm离心10min收集菌液，弃上清。用乙酰丁香酮(acetosyringone)溶液[10mmmes(ph5.6)+10mmmgcl2+200umacetosyringone]悬浮，调整至od600大约为1.5左右，室温静置3h。
4.将含有目的质粒的农杆菌用于秋子梨叶片的注射。
5.用1ml注射器(去掉针头)，在梨叶片背面注射，标记好注射过的叶片。
6.将注射过的梨植株放回人工气候室培养6-7天，即可观察瞬时转化的结果。
2.瞬时转化pbrwrky53基因秋子梨的抗旱分析
为了鉴定瞬时转化pbrwrky53基因的秋子梨是否和抗旱胁迫有关，将对照系和瞬时转化系进行干旱处理，干旱处理采用自然控干法，将实验所需材料放在26℃日光灯培养室，光照强度为20500lx，空气温度是44.0％，让其自然干旱控水，待其出现表型时拍照并取样。将pbrwrky53基因瞬时转化的秋子梨株系(oe1和oe2)及野生型植株(wt)，在室温下干旱处理14天后的表型和生理指标测定。其中：图7a是室温下干旱处理14天后的表型。图7b是室温下干旱处理14天后电导率测定。图7，c-d是室温下干旱处理14天后叶绿素测定(图7c)及叶绿素提取(图7d)。结果表明，在处理过程中，2个瞬时转化株系(oe1和oe2)的植株明显比野生型(wt)表现更抗旱(图7)。
3.组织中活性氧残留量测定与分析
5.在转基因株系中(烟草/秋子梨)，电导率较低和成活率高表明他们可能具有比wt有更强的抗ros的能力。那么通过鉴定植株中ros的积累量便成为必要。将材料在室温下干旱处理后，观察其表型，取样，并分别测其组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。如图8(d-f)，将秋子梨干旱胁迫14天之后，测定了其组织中的过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，野生株系型的过氧化氢含量和丙二醛含量均显著地高于2个转基因株系，且两个转基因株系组织中的抗超氧阴离子自由基含量高于对照系。这些证据表明，表明转基因系在受到干旱胁迫后体内所积累的活性氧残留量较对照系少，进而表明，过表达的pbrwrky53基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。
由上述实施例可知，本发明提供的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53，经生物学功能验证具有提高植物抗旱能力的作用，过表达所述的梨干旱诱导转录因子pbrwrky53能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。烟草和秋子梨的转基因超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升，烟草的转基因超表达株系中过氧化氢(h2o2)及丙二醛(mda)的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>南京农业大学
<120>梨干旱诱导转录因子pbrwrky53及其在提高植物抗旱能力方面的应用
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