一种磁珠法提取DNA的试剂盒及提取方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法产菌核真菌dna提取试剂盒，以及特异性强快速提取产菌核真菌dna的方法。

背景技术：

菌核是由菌丝紧密连接交织而成的休眠体，其功能主要是抵御不良环境。常见的产菌核真菌有菌核属和丝核菌属真菌，该类真菌含有大量的胞外多糖。而真菌胞外多糖具有高吸附高粘稠特点，是困扰产菌核真菌分离提取高纯度dna的难点之一。分子生物学手段目前已是真菌鉴定必不可少的技术之一，而dna的分离纯化是进行分子生物学研究的基础。目前传统的ctab法是提取的真菌dna较常见的方法，其主要原理为ctab是一种阳离子去污剂，可与蛋白质形成络合物，沉淀蛋白质物质，达到分离纯化核酸的目的，再经过酚、氯仿等物质的纯化离心、洗涤、洗脱等步骤后实现对dna的提取工作。但是针对多糖含量较高的产菌核真菌的dna提取无法达到理想的效果。并且好使较长，使用溶剂对人体伤害较大。

后来，柱式法真菌dna提取试剂盒的发展大大提高了dna提取的便利性。其主要原理为利用包埋有纯化填料的纯化柱对dna分子的吸附作用，在提取过程中将dna有效吸附在过滤膜中，再经离心、洗涤、洗脱等步骤后实现对dna的提取工作，操作速度加快，dna浓度增加。当前，柱式法回收dna应用广泛，但也有其自身缺陷，对于多糖物质含量较高的真菌在过滤网时常常会引起滤网的堵塞，使大量dna片段无法吸附在过滤网上，最终导致dna提取浓度低或者失败。

近年来，因纳米磁性氧化铁的特殊性，磁珠法在真菌dna提取应用中越来越受到关注。其原理为磁珠表面修饰有特殊化学基团或者依靠巨大的表面能，可在不同条件下对dna分子形成特异性吸附和解吸附作用，吸附在磁珠内的dna分子在外加磁场作用下可与磁珠分离，简单便捷的完成dna的提取工作。虽然磁珠法大部分真菌dna提取的操作简便，其不足之处也是无法排除多糖物质对dna吸附的影响。

另外，对于生物体的dna提取，虽然具有很多经典的方法，但是，这些传统的方法不能日益满足一些测试的需要，有些测试需要纯度很高的dna，而不希望含有任何其它杂质，例如蛋白、肽链、rna、多糖或者其它非dna的物质，因为这些物质会对测试产生干扰。有时候，尽管样本中具有dna，但是仍然不能检测到目的dna，这可能是含有的杂质对测试系统干扰造成的，虽然这些杂质含量很少，但是仍然会对检测结果造成干扰，有的时候，甚至让检测失败。这就需要对传统的方法进行改进，期望获得高纯度的dna而不含有杂质。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种磁珠法产菌核真菌dna提取试剂盒。该试剂盒可以有效除去样本溶液中的杂质而特异吸附dna，使获得的dna的纯度达到99.5％以上。特别的，对磁珠采用特殊试剂进行处理，可以让磁珠只特异吸附dna，而不会吸附其它杂质，例如蛋白碎片、多肽、rna或者其它杂质。这里所说的特异是可以吸附99.9％的dna，而不会或者几乎很少吸附其它非dna的物质，例如rna，蛋白或者多肽，或者多糖。

这种处理磁珠的试剂包括双甘膦溶液和异硫氰酸胍溶液，然后再用处理过的磁珠来吸附样本中的dna，意外的发现dna的纯度可以显著提高。双甘膦是属于常用的一种农药，他的处理，可能对磁珠的表面能增加，增强吸附能力，异硫氰酸胍是一种常用的蛋白变性试剂，这两种试剂对磁珠进行了处理，可以显著提高dna的纯度，相对传统的常规提取dna的纯度，具有显著的提高。

在一些方式中，本发明提供一种磁珠法产菌核真菌dna提取试剂盒，其特征在于包括：溶液ⅰ、溶液ⅱ、溶液ⅲ、溶液ⅳ、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；

所述磁珠悬浮液：磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为1.2-2mm；所述溶液ⅰ由葡萄糖，tris-hcl和edta组成，ph值为8.0；

所述溶液ⅱ为无水乙醇和醋酸钾溶液；

所述溶液ⅲ为sds溶液(氢氧化钠溶液稀释)；

所述溶液ⅳ包含盐酸胍和醋酸钾，ph值为3.5～4.5；

所述洗涤液为乙醇溶液；

所述洗脱液为去离子水；

其中，所述的磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：磁珠在双甘膦溶液进行浸泡5-10小时后用pbs缓冲液(ph＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入异硫氰酸胍溶液5-6小时，pbs缓冲液冲洗5-8次后备用。

作为优选的方案，所述的所双甘膦溶液的浓度为5mol/l，异硫氰酸胍溶液的浓度为8mol/l。

另一方面，一种磁珠法产菌核真菌dna提取的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，用液氮进行冷冻研磨；加入250μl溶液ⅰ，再加入50μlrnasea，充分混匀；

步骤二：加入50μl蛋白酶k，充分混匀后60℃恒温水浴20min。12000rpm离心5min，取上清至新管中；

步骤三：加入150μl溶液ⅱ，轻轻上下翻动5-6次；12000rpm离心5min，取上清至新管中；

步骤四：加入350μl溶液ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。12000rpm离心5min，取上清至新管中；

步骤五：加入350μl溶液ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，室温静置2min；

步骤六：加入50μl磁珠悬浮液，轻轻上下翻动后静置2min；

步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；

其中，所述的磁珠悬浮液经过如下处理步骤处理：磁珠在双甘膦溶液进行浸泡5-10小时后用pbs缓冲液(ph＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入异硫氰酸胍溶液5-6小时，pbs缓冲液冲洗5-8次后备用；

所述溶液ⅰ中葡萄糖浓度为50mmol/l，tris-hcl浓度为25mmol/l，edta浓度为10mmol/l；

所述溶液ⅱ中醋酸钾溶液浓度为8mol/l；

所述溶液ⅲ中naoh溶液浓度为0.2mol/l，sds浓度为1-1.5％；

所述溶液ⅳ中盐酸胍浓度为3.0-4.5m，kac浓度为0.75m。

优选的，所述的所双甘膦溶液的浓度为5mol/l，异硫氰酸胍溶液的浓度为8mol/l。

优选的，所述的双甘膦溶液与异硫氰酸胍溶液的体积比为1:1。

优选的，其中，还包括对步骤七之后的对磁珠的洗涤和洗脱步骤：将含有已吸附dna磁珠的离心管中加入500μl无水乙醇洗涤dna，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μl去离子水，静置2min后使用移液器将含有dna的溶液至新管。

在一些优选的方式中，对样本中颗粒较大的物质进行过滤去除，或者对一些含量高的物质，例如多糖，较大的蛋白物质进行初步去除，然后再加入处理过的磁珠进行吸附，发现该磁珠仅仅吸附样本中的dna，而不会吸附样本中的其它物质，例如蛋白碎片、多肽、rna或者其它杂质。

沉淀多糖物质及吸附dna，使产菌核真菌dna浓度提高80％以上，可直接应用于测序、连接、pcr扩增等下游分子生物学实验。

本发明的目的之二在于提供了一种磁珠法对产菌核真菌dna快速提取的方法。配合由双甘膦溶液、异硫氰酸胍溶液和磁珠组成的磁珠悬浮液完成。该试剂盒可以提高磁珠对dna分子的特异性吸附能力，使产菌核真菌dna纯度提高90％以上。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种磁珠法产菌核真菌dna提取试剂盒。包括溶液ⅰ、溶液ⅱ、溶液ⅲ、溶液ⅳ、洗涤液、洗脱液和磁珠悬浮液；

所述磁珠悬浮液：磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为1.2-2mm；

所述溶液ⅰ由葡萄糖，tris-hcl和edta组成，ph值为8.0；

所述溶液ⅱ由无水乙醇和醋酸钾组成；

所述溶液ⅲ为sds溶液(氢氧化钠溶液稀释)；

所述溶液ⅳ包含盐酸胍和醋酸钾，ph值为3.5～4.5；

所述洗涤液为无水乙醇溶液；

所述洗脱液为去离子水；

所述磁珠悬浮液浓度为40-50mg/ml；

所述溶液ⅰ中葡萄糖浓度为50mmol/l，tris-hcl浓度为25mmol/l，edta浓度为10mmol/l；

所述溶液ⅱ中醋酸钾溶液浓度为8mol/l；

所述溶液ⅲ中naoh溶液浓度为0.2mol/l，sds浓度为1-1.5％；

所述溶液ⅳ中盐酸胍浓度为3.0-4.5m，kac浓度为0.75m；

其中，。

上述试剂盒快速提取产菌核真菌dna方法，包括以下步骤：

步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于500mg，用液氮进行冷冻研磨。加入250μl溶液ⅰ，再加入50μlrnasea，充分混匀。

步骤二:加入50μl蛋白酶k，充分混匀后60℃恒温水浴20min。12000rpm离心5min，取上清至新管中。

步骤三：加入150μl溶液ⅱ，轻轻上下翻动5-6次。12000rpm离心5min，取上清至新管中。

步骤四：加入350μl溶液ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。12000rpm离心5min，取上清至新管中。

步骤五：加入350μl溶液ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，室温静置2min。

步骤六：加入50μl磁珠悬浮液，轻轻上下翻动后静置2min。

步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液。

步骤八：加入500μl洗涤液洗涤dna，充分震荡后弃溶液。

步骤九：打开离心管盖，室温静置3-5min后加入50μl洗脱液，静置2min后取溶液至新管，放置于-20℃备用。

本申请创新性的提出针对产菌核真菌的多糖物质进行有效的沉淀，使其dna浓度提高，减弱了产菌核真菌胞外多糖对dna浓度的影响，可以避免传统dna提取中出现浓度低而导致下游试验失败的现象。

本发明的有益效果：

(1)dna提取率较高，浓度可达到200ng/μl以上。该方法基于醋酸钾和无水乙醇溶液可沉降多糖物质，在缓冲液的环境中对dna去除真菌的胞外多糖，使dna分子提取时减少多糖物质的干扰，dna提取率高，提取的dna浓度可达到200ng/μl以上。

(2)dna纯度较高，rna和蛋白质含量少。该方法基于双甘膦溶液和异硫氰酸胍溶液裂解rna和溶解蛋白质，在缓冲液的环境中磁珠对dna的特异性吸附能力增强，使rna和蛋白质无法吸附到磁珠上，dna纯度升高，od260/280值为1.80-1.90。

(3)操作便捷、省时、安全。该方法基于磁珠法再配合试剂盒溶液ⅰ、溶液ⅱ、溶液ⅲ、溶液ⅳ、洗涤液和洗脱液的使用可大幅度提高工作效率，操作方法简介高效，完成一次dna提起仅需约10-30分钟。

具体实施方式

实施例1：磁珠法产菌核真菌dna提取试剂盒

1.1.磁珠法产菌核真菌dna提取试剂盒包括(a7-a8样品)：

步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌(酵母)的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于500mg，用液氮进行冷冻研磨。加入250μl溶液ⅰ，再加入50μlrnasea，充分混匀。

步骤二：加入50μl蛋白酶k，充分混匀后60℃恒温水浴20min。12000rpm离心5min，取上清至新管中。

步骤三：加入150μl溶液ⅱ，轻轻上下翻动5-6次。12000rpm离心5min，取上清至新管中。

步骤四：加入350μl溶液ⅲ，轻轻上下翻动，使菌液充分裂解成透明的溶液。12000rpm离心5min，取上清至新管中。

步骤五：加入350μl溶液ⅳ，轻轻上下翻动，直至有白色絮状物形成，室温静置2min。

步骤六：加入50μl未经过处理的磁珠悬浮液(购买自上海羧菲生物医药科技有限公司，专门用于提取dna的纳米羟基磁珠,批号：fe10001,平均粒径为500nm,)，轻轻上下翻动后静置2min。

步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液。

步骤八：将含有已吸附dna磁珠的离心管中加入500μl无水乙醇洗涤dna，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μl去离子水，静置2min后使用移液器将含有dna的溶液至新管。

溶液ⅰ中葡萄糖浓度为50mmol/l，tris-hcl浓度为25mmol/l，edta浓度为10mmol/l；

溶液ⅱ中醋酸钾溶液浓度为8mol/l；

溶液ⅲ中naoh溶液浓度为0.2mol/l，sds浓度为1-1.5％；

溶液ⅳ中盐酸胍浓度为3.0-4.5m，kac浓度为0.75m。

1.2传统ctab法提取法(a1-a3样品)：

步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌(酵母)的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于500mg，用液氮进行冷冻研磨。加入500μl预热的ctab溶液充分混匀之后65℃水浴50min。

步骤二：冷却至室温后加入500μl酚·氯仿·异戊醇，充分混匀之后，12000rpm离心15min，取上清至新管中。

步骤三：再加入500μl酚·氯仿·异戊醇，充分混匀之后，12000rpm离心15min，取上清至新管中。

步骤四：加入500μl异戊醇和50μlnaac，轻轻转动离心管，使管内液体充分混匀，放入-20℃冰箱内冷冻2h。

步骤五：12000rpm离心15min，弃上清。

步骤六：晾干加入50μl去离子水溶解dna。

1.3axygen柱式提取法(a4-a6样品)：

步骤一：在无菌条件下将培养好的真菌(酵母)的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于500mg，用液氮进行冷冻研磨。加入500μl预热的ctab溶液充分混匀之后65℃水浴50min。

步骤二：冷却至室温后加入500μl酚·氯仿·异戊醇，充分混匀之后，12000rpm离心15min，取上清至新管中。

步骤三：再加入500μl酚·氯仿·异戊醇，充分混匀之后，12000rpm离心15min，取上清至新管中。

步骤四：加入500μl异戊醇和50μlnaac，轻轻转动离心管，使管内液体充分混匀。

步骤五：将混匀的溶液倒入含有dna吸附膜的过滤柱中，5000rpm离心2min，无水乙醇洗涤3次。

步骤六：晾干加入50μl去离子水溶解吸附膜中的dna，后将溶解的dna产物5000rpm离心2min至新管中。

od值检测：使用721紫外分光光度计对9份dna产物样品进行了od值检测(见表1)。检测结果显示使用本试剂盒对产菌核真菌提取的dna产物浓度较高并且纯度良好。

表1：实施例1中从100mg产菌核真菌中提取的dna产物的od值及浓度检测结果

(a1-a3：传统ctab法；a4-a6：axygen柱式法；a7-a9：本试剂盒)

由表1中采用未经处理的磁珠对产菌核真菌的dna提取结果可以看出，采用本发明的试剂盒提取的dna浓度最高，均能达到200ng/μl以上，而传统ctab法和axygen柱式法提取的dna浓度明显较低，该结果表明本发明的试剂盒可以有效的去除产菌核真菌的多糖物质，避免其对dna提取的干扰。但是三种方法提取的dna样本液所测得的od值均偏低，有蛋白、rna等杂质干扰的情况，样本液中dna纯度并没有有效改善。因此，本发明也对吸附dna的磁珠进行了一定的处理，因为高纯度的dna，一般od读数在1.8-2.0之间，小于1.8的大多含有rna，高于2.0的，大多含有蛋白。从以上实验结果可以看出，采用直接购买的磁珠进行dna提取，虽然可以提高浓度，但是含有杂质，特别是rna比较多，dna纯度不符合要求，有时候，不能用于特定用途的dna检测或者其它高要求的需要。

实施例2：利用处理的磁珠对样本的dna提取

按照实施例子1所描述的提取过程，其区别是：在采用磁珠进行dna提取前，对购买的磁珠进行处理，采用处理后的磁珠对dna进行提取，其它方法和试剂的实用与实施例子1中的磁珠提取方法一样步骤一样。

对磁珠进行处理，处理的方法如下：

磁珠购买自上海羧菲生物医药科技有限公司(与实施例子1是同一个批号)，专门用于提取dna的磁珠，对该磁珠进行处理，用双甘膦溶液(5mol/l)和异硫氰酸胍溶液(8mol/l)进行浸泡。处理的方法如下：取2g磁珠在10毫升双甘膦溶液进行浸泡5-10小时后用pbs缓冲液(ph＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入10毫升的异硫氰酸胍溶液5-6小时，pbs缓冲液冲洗5-8次后备用。用处理的磁珠来吸附dna，最后用去离子水洗脱磁珠，获得目标dna。

当然，磁珠的数量多少或者重量与需要的用双甘膦溶液和异硫氰酸胍溶液的浓度有关系，这个可以根据本发明的精神做任意调整，例如2克本发明的磁珠可以用10毫升双甘膦溶液和10毫升的异硫氰酸胍溶液进行处理，这个根据磁珠的直径大小可以做有限实验的调整。处理过的2克磁珠可以吸附大约200-250ng/μl的dna，一般放入的磁珠都是过量的，当溶液中的dna浓度很低的时候，可以放入过量的磁珠，过量的磁珠可以吸附dan，这样起到富集的作用，从而获得高浓度的dna，同时这种富集是具有特异选择性的，只是富集dna，而不会富集ran或者蛋白，从而获得高纯度的dna。

未经过处理的磁珠作为对照(和实施例子1中磁珠提取方法一样)。

检测结果显示使用本试剂盒中发明的磁珠对产菌核真菌提取的dna产物浓度较高并且纯度良好，可使提取的dna含量提升80％以上。

表2：实施例2中处理和未处理的磁珠提取dna产物中的od值检测结果

由表2中处理和未处理的磁珠提取dna产物中的od值检测结果可以看出，本发明的磁珠提取的dna产物中的od值均在1.80-1.90之间，具有较高的纯度，而未处理的磁珠提取的dna产物中的od值明显低于1.80，其中混有杂志，纯度较低，经过方差分析，本发明的磁珠提取dna的纯度显著(p<0.01)高于不用处理过的磁珠的纯度。因此，采用本发明的磁珠可以显著的提高dna的纯度。

实施例3：利用处理的磁珠对dna吸附能力测定

使用超声波细胞破碎仪对待测细菌(金黄色葡萄球菌)进行细胞壁破碎，破碎具体方法如下：

刮取细菌并用蒸馏水配制成悬浮液(10⁷个/ml),后将盛有悬浮液的烧杯放置于破碎仪内，将破碎仪的探头放入烧杯插入孢子悬浮液中，在冰浴环境下设置破碎时间为10min，细胞破碎后取出样品进行磁珠吸附dna检测。

向破碎好的样品液体中加入本发明的一定重量的磁珠(可是2-5克)(实施例子2中的处理过的磁珠)，将烧杯放在磁力架上进行dna的磁珠吸附，10min后取出磁珠，用洗涤液冲洗3遍，后加入50μl洗脱液洗脱磁珠上的dna，静置2min后使用移液器将含有dna的溶液至新管，获得dna样本并测定其od值及浓度，未经过处理的磁珠作为对照。

对磁珠洗脱的方法如下：

将含有已吸附dna磁珠的离心管中加入500μl无水乙醇洗涤dna，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μl去离子水，静置2min后使用移液器将含有dna的溶液至新管。

检测结果显示使用本发明的磁珠对细胞内的dna吸附能力较高，其产物浓度较高并且纯度良好，rna和蛋白干扰较少，可使提取的dna浓度达到200ng/μl以上。

表3：实施例3中处理和未处理的磁珠提取dna产物中od值及浓度检测结果

(a1-a3：本发明磁珠；a4-a6：未处理磁珠)

通过处理和未处理的磁珠提取dna产物中的od值检测结果可以看出，本发明的磁珠提取的dna样本液中的od值均在1.80-1.90之间，具有较高的纯度，可以很好的排除对rna和蛋白等杂质的吸附，并且其浓度可以达到100ng/μl以上，而未处理的磁珠提取的样本液中dna的纯度和浓度均较低。结果表明本发明的磁珠具有显著的吸附dna的特性。

实施例4：利用处理的磁珠对dna吸附能力测定(质粒dna的提取)

1.1传统的方法如下：

提取的质粒dna可直接用于酶切、pcr扩增、银染序列分析。方法如下：

1：接1％含质粒的大肠杆菌细胞于2mllb培养基。

2：37℃振荡培养过夜。

3：取1.5ml菌体于ep管(离心管)，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4：加0.lml溶液i(1％葡萄糖，50mm/ledtaph8.0，25mm/ltris-hclph8.0)充分混合。

5：加入0.2ml溶液ii(0.2mm/lnaoh，1％sds)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

6：加入0.15m1预冷溶液iii(5mol/lkac，ph4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.

7：以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新ep管

8：加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min.

9：以10，000rpm离心20min，弃上清。

10：用70％乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11：待沉淀干燥后，溶于50ulte缓冲液中(或60℃温育去离子水)。

1.2在步骤7之后(省略传统的8-11的步骤)，加入本发明的处理过的磁珠进行dna的吸附，以及加入不经过处理的磁珠进行dna的吸附，然后进行本发明的洗脱方法，

对磁珠洗脱的方法如下：

将含有已吸附dna磁珠的离心管中加入500μl无水乙醇洗涤dna，充分震荡后弃溶液，重复洗涤3次，将磁珠表面粘有的有机溶液尽量洗涤掉；打开离心管盖，室温静置3-5min，使磁珠表面的无水乙醇尽量挥发掉后加入50μl去离子水，静置2min后使用移液器将含有dna的溶液至新管。

表4：实施例4中处理和未处理的磁珠提取dna产物中od值及浓度检测结果

(a1-a3：本发明磁珠；a4-a6：未处理磁珠，a7-a9为传统的方法)

通过处理和未处理的磁珠提取质粒dna产物中的od值检测结果可以看出，本发明的磁珠提取的dna样本液中的od值均在1.80-1.90之间，具有较高的纯度，可以很好的排除对rna和蛋白等杂质的吸附，并且其浓度可以达到100ng/μl以上，而未处理的磁珠提取的样本液中dna的纯度和浓度均较低。结果表明本发明的磁珠具有显著的吸附dna的特性。

本文中用来描述方法的术语和表达方式并不是唯一不变的，并且我们没有任何意图使用这些术语和表达方式来排除描述本发明或者特征的任何相同意义的表达方式，我们认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此，我们认为尽管在本文中本发明已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来，但是改变本文中揭示的设计的表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士，并且这些改变要与本发明附带的声明一致。文章、专利、专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的电子化信息是结合在一起的，必须作为一个完整的内容来参考，发表其中任何一个部分都要特别指明这一点。申请者具有将任何和全部的这些文章、专利、专利应用或其它文档的信息和材料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。