本发明涉及一种副鸡禽杆菌抗原蛋白，含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物、制备方法和应用，属于兽药领域。
背景技术：
：副鸡禽杆菌(avibacteriumparagallinarum，apg)是一种引起鸡急性上呼吸道疾病的致病菌，有a、b、c三个血清型。该病首先发现于波兰和美国，发现后，确认在其他各国经常发生。1980年以来，我国也屡有本病的报道，目前3个血清型均为主要流行血清型。感染后的呼吸道疾病俗称鸡传染性鼻炎(avianinfectiouscoryza，ic)，临床上以面部水肿、鼻窦炎、流泪为主要特征，可引起产蛋鸡的产蛋量下降，育成鸡的生长受阻、开产期推迟，肉鸡增重率下降，给养禽业造成巨大的经济损失。apg3个血清型之间不具有交叉保护力，而且同血清型的不同分离菌株间的保护力也有较大差异。目前市场上用于预防该病的疫苗多为a型单价灭活疫苗，a、c型二价灭活疫苗以及进口的a、b、c型三价灭活疫苗，由于b型菌株的流行，导致单价苗或二价苗不能产生全面的保护作用，而进口疫苗因现在流行菌株与制苗株抗原的差异对该病的保护作用也不是十分理想。由于本病的发病特点是潜伏期短、传播迅速,短时间内便可波及全鸡群，因此提供一种具有预防甚至是治疗性质的疫苗组合物尤为必要。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明提供了一种副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白为seqidno.3所示序列编码。本发明的副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白具有良好的免疫原性，且能对副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白、副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白产生协同增效作用。本发明还涉及一种构建体，其中包含所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白基因。本发明还涉及一种重组细胞，其中，由所述构建体转化受体细胞而得；任选地，所述受体细胞选自细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。本发明还涉及一种鸡传染性鼻炎亚单位疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含所述副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白和药学上可接受的载体。本发明还提供一种含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有免疫量的副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白、免疫量的副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白、免疫量的副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白以及药学上可以接受的载体。本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物能对副鸡禽杆菌感染提供全面的保护，对各血清型的副鸡禽杆菌均能完全保护。作为本发明的一种实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白为seqidno.1所示序列编码，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白为seqidno.2所示序列编码，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白为seqidno.3所示序列编码。本发明含有特异性抗原的疫苗组合物，具有广谱的免疫原性，能对不同地域来源的不同血清型的副鸡禽杆菌提供完全保护。作为本发明的一种实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白含量为≥15μg/ml，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白含量为≥25μg/ml，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白含量为≥15μg/ml。作为本发明的一种优选实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白含量为15μg/ml～100μg/ml，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml～100μg/ml，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白含量为15μg/ml～100μg/ml。本发明所述的鸡传染性鼻炎亚单位疫苗组合物，其中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白含量可以任意选自15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml。本发明所述的鸡传染性鼻炎亚单位疫苗组合物，其中，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白含量可以任意选自25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml。本发明所述的鸡传染性鼻炎亚单位疫苗组合物，其中，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白含量可以任意选自15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml。本发明的疫苗组合物中的各抗原蛋白具有良好的免疫原性，当选择低含量的抗原量时，也能激发良好的免疫反应，对鸡只产生完全保护。作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml～100μg/ml，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白含量为50μg/ml～100μg/ml，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml～100μg/ml。作为本发明的进一步优选的实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白含量为15μg/ml，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白含量为15μg/ml。当本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中各抗原成分选择上述含量时，各抗原成分之间产生协同作用，其产生的免疫保护效果与含有更高剂量的相同抗原成分的单价疫苗相当。作为本发明的进一步优选的实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白含量为50μg/ml，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml。当本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中各抗原成分选择上述含量时，即能对不同地域来源的不同血清型的副鸡禽杆菌提供完全保护。作为本发明的一种实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、dda；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽、gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为quila、qs-21、gpi-0100；优选地，乳剂为spt乳剂、mf59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是l121))；优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974p、934p和971p；优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物ema；优选地，所述佐剂为白油佐剂，其用于制备油包水乳剂；所述佐剂的浓度范围是从5％到70％v/v，优选从30％到70％，更优选66％v/v。作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)和白介素2(il2)。为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。作为本发明的一种实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括下列抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病毒抗原、减蛋综合征病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、禽腺病毒抗原、滑液囊支原体、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、或鸡传染性喉气管炎病毒抗原。本发明的疫苗组合物可以含有多种抗原成分，以联合疫苗或或复合疫苗的形式免疫，以简化免疫程序。本发明的疫苗组合物还可以进一步包含其它病原组合使用以制备抵抗包括副鸡禽杆菌感染的各种疾病的复合疫苗。术语“复合疫苗”指细菌和病毒抗原制备的疫苗。例如，本发明的副鸡禽杆菌亚单位抗原可与新城疫病毒抗原组合。作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述新城疫病毒抗原为基因ⅶ型新城疫病毒灭活全病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述新城疫病毒抗原为基因ⅶ型新城疫病毒n7a株灭活全病毒抗原，所述新城疫病毒(基因ⅶ型)n7a株保藏号为cctccno：v201545。新城疫病毒(基因ⅶ型)n7a株(newcastlediseasevirus(genotypeⅶ),strainn7a)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：v201545，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学，公开于中国专利申请cn107281479a。作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述鸡新城疫病毒抗原为新城疫病毒(基因ⅶ型)n7a株灭活全病毒抗原，所述新城疫病毒(基因ⅶ型)n7a株保藏号为cctccno：v201545；所述新城疫病毒n7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0eid50/0.1ml～109.0eid50/0.1ml。作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物中，所述副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml，所述副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白含量为50μg/ml，所述副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白含量为25μg/ml，所述新城疫病毒n7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0eid50/0.1ml。本发明所述的联苗疫苗组合物中，药学上可接受的载体可以包括佐剂，所述佐剂可以具有本发明所述单价疫苗组合物同样选择范围。优选地，所述佐剂为白油佐剂，所述佐剂用量为体积比66％。本发明的含有副鸡禽杆菌抗原和新城疫病毒n7a株灭活全病毒抗原的疫苗组合物能针对副鸡禽杆菌和新城疫病毒产生完全保护，且对已感染的鸡只具有治疗效果。本发明还提供了一种制备所述含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)分别克隆、重组seqidno.1所示的副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白基因、seqidno.2所示的副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白基因、seqidno.3所示的副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白基因，得到重组的副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白表达载体、重组的副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白表达载体、重组的副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白表达载体；步骤(2)分别表达所述步骤(1)中所述重组的副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白表达载体、所述重组的副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白表达载体、所述重组的副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白表达载体，得到表达的重组副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白、重组副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白和重组副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白；以及步骤(3)按照含量比例混合所述步骤(2)表达的重组副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白、重组副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白、重组副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白；加入佐剂。作为本发明的一种实施方式，本发明制备所述含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物的方法中，所述步骤(2)所述表达的重组副鸡禽杆菌a型hmtp2102区抗原蛋白、重组副鸡禽杆菌b型hmtp2102区抗原蛋白以及重组副鸡禽杆菌c型hmtp2102区抗原蛋白为活性蛋白。本发明hmtp2102区抗原蛋白活性蛋白可以使用常规方法重组表达制备，制备的重组蛋白具有生物或生理活性，往往具有三级或四级空间结构。常规重组表达方法如原核表达体系的分泌性表达、原核表达体系表达可溶性蛋白、真核表达体系表达可溶性蛋白、酵母表达体系表达可溶性蛋白。也可以使用人工合成具有生物学活性蛋白；或者表达形成的包涵体经变性复性后的活性蛋白。本发明还提供了所述的含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物在制备预防和治疗副鸡禽杆菌感染导致的疾病的药物中的应用。本发明可以应用的副鸡禽杆菌相关疾病的非穷举性列表包括，如面部水肿、鼻窦炎、流泪、产蛋量下降，育成鸡的生长受阻、蛋鸡开产期推迟，肉鸡增重下降等。具体实施方式“疫苗组合物”指含有副鸡禽杆菌免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对副鸡禽杆菌的免疫反应。所述疫苗组合物包括免疫量的副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除抗原之外的其它成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如quila、qs-21(cambridgebiotechincorporation,cambridgema)、gpi-0100(galenicapharmaceuticalsincorporation，birminghamal)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(europeanpharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoidoil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其pluronic产品，特别是l121。参见hunter等编写的《thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants》(ed.bydesstewart-tull,johnwileyandsons,newyork,1995:51-94)和todd等编写的《vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用powellm和newmanm编写的《vaccinedesign,thesubunitandadiuvantapproach》(plenumpress,1995)第147页描述的spt乳剂及第183页描述的mf59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(carbomer，商品名carbopol)(phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利us2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphaticradical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenicallyunsaturatedgroup)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(bfgoodrich,ohio,usa)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974p、934p和971p，最优选使用卡波普971p。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物ema(monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理ph，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，ribi佐剂系统(ribiincorporation)、blockco-polymer(cytrx,atlantaga)、saf-m(chiron,emeryvilleca)、单磷酰脂质a(monophosphoryllipida)、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽、gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽或gel佐剂中的一种或几种。本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的重组病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。本发明所用术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的重组病毒可与鸡新城疫病毒、禽腺病毒病毒和/或大肠杆菌、滑液囊支原体混合或组合。本发明所用术语“活性蛋白”指的具有空间结构，生物学或生理上活性的蛋白，可以是重组蛋白，如采用原核表达体系的分泌性表达的可溶性蛋白、原核表达体系表达的可溶性蛋白、真核表达体系表达的可溶性蛋白、酵母表达体系表达的可溶性蛋白。也可以使用人工直接合成具有生物学活性蛋白；或者表达形成的包涵体经变性复性后的活性蛋白。本发明所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制鸡传染性鼻炎或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使副鸡禽杆菌感染引起的症状减轻或好转的所有行为。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明实例中所用的样品处理液为pbs缓冲液(ph7.4，0.02mol/l)，其1l体积pbs缓冲液配方示例为：na2hpo4·12h2o5.8g、nah2po4·2h2o0.59g，但不限于此配方；若无特殊说明，均用pbs缓冲液稀释。本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1副鸡禽杆菌hmtp2102区2区基因重组质粒的构建1.1引物设计根据apga型、b型和c型的hmtp2102区2区基因序列，利用primer5.0软件设计1对通用引物，上下游引物5’端分别引入bamhi、hindⅲ酶切位点及保护性碱基，用于扩增hmtp2102区2区基因全长序列，引物的序列见表1，其中画线部分为引入的酶切位点，引物由金唯智公司合成。表1引物序列1.2副鸡禽杆菌基因组dna的提取分别将apga型hn3株、b型hn5株及c型sd3株菌种划线接种于tsa平板，于37℃、5％co2培养箱培养24-36h，挑取3～5个典型菌落接种于含5ml鸡肉汤培养基的试管中，于37℃、180rpm振荡培养10-12h，获得的菌液用试剂盒分别提取apg不同血清型菌株基因组dna。1.3hmtp2102区2区基因pcr扩增pcr反应体系为：上下游引物各1.0ul，2×transstartfastpfupcrsupermix25ul，无菌双蒸水21ul，模板2ul；pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性20s，55℃复性20s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物使用1％凝胶进行电泳检测。结果：apga、b、c型菌株dna模板扩增目的基因大小理论上分别为1635bp、1611bp、1620bp，扩增出的目的基因大小与理论相符，分别将扩增出的a、b、c型目的基因片段送invitrogen公司测序，根据测序结果进行密码子优化，优化后的a、b、c型hmtp2102区2区基因序列分别如序列表seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3所示。1.4副鸡禽杆菌重组质粒的构建优化后的a、b、c型hmtp2102区2区基因送苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，并连接到pet-32a载体，连接体系如下：目的基因20μl、pet-32a载体0.5μl、连接酶缓冲液2.0μl、t4dna连接酶1.0μl、灭菌双蒸水8.5μl。连接反应条件为16℃，30min。1.5副鸡禽杆菌重组质粒的鉴定从-80℃冰箱取出e.colidh5α感受态细胞，置冰上缓慢解冻，待完全融化后，加入10μl连接产物，混匀后冰浴30min；42℃水浴锅加热45s后，冰浴1min，加入890μl的lb液体培养基，37℃振荡培养60min，将培养物接种含100μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂培养板，37℃培养过夜。挑典型菌落，接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，200rpm培养10h。取1ml菌液煮沸10min，12000rpm离心5min，取上清作为模板，进行pcr鉴定，pcr程序同实施例1.3；同时提取质粒，使用bamhi/hindⅲ进行双酶切鉴定，酶切产物经1％凝胶电泳检测，并回收目的基因片段。将pcr和酶切鉴定均为阳性的质粒送金唯智公司进行测序。经测序鉴定序列正确的重组质粒分别命名为pet-a、pet-b、pet-c。实施例2重组表达菌株bl21-a、bl21-b及bl21-c的构建2.1重组质粒转化e.colibl-21感受态细胞及重组蛋白表达实施例1中经测序鉴定序列正确的重组质粒转化e.colibl-21感受态细胞，分别得到重组表达菌株bl21-a、bl21-b、bl21-c，同时将空质粒pet-32a以同样的方法转化e.colibl-21感受态细胞，涂布含氨苄的lb固体培养基，37℃培养16h后挑取生长良好的单个菌落分别接种于10ml的含氨苄的lb液体培养基，37℃、200rpm振荡培养2h。待菌液od600值达到0.6～0.8时，分别取1ml未诱导的表达菌液和空质粒菌液作为诱导前样品，剩余菌液中加入终浓度为1.0mmol/l的iptg诱导表达3～4h，分别取1ml诱导后的表达菌液和空质粒菌液作为诱导后样品。2.2重组蛋白的sds-page检测将实施例2.1所取的1ml样品12000rpm离心1min，弃上清，在沉淀中加入0.5mlph值7.4pbs重悬，2～8℃冰浴超声波裂解后12000rpm离心30min，取出全部上清，沉淀用0.5mlph值7.4pbs重悬，分别取部分上清和沉淀各加入等体积的2×sdsloadingbuffer，混匀后于沸水中煮5～10min，离心后取10ul上清液进行sds-page电泳。结果：诱导后的bl21-a、bl21-b、bl21-c重组表达菌均在60kda附近出现条带，与预期的三种重组蛋白大小基本一致，表达产物均在裂解后的上清中，均为可溶性表达，未诱导的重组表达菌及诱导后的空质粒菌均没有出现目的条带。2.3重组蛋白的westernblot检测(1)诱导后的表达产物进行sds-page；(2)使用蛋白转膜仪转印至pvdf膜；(3)转印结束后，将pvdf膜用pbst洗涤后投入丽春红染色液中染色5～10min，当蛋白条带出现后，用pbst洗涤数次，直至洗去丽春红染色液；(4)将pvdf膜用含5％脱脂乳的pbst封闭液室温振荡封闭2h左右；(5)用pbst洗涤后，加入兔抗apga型hn3株或b型hn5株或c型sd3株多克隆抗血清，室温作用2h，使用pbst洗涤4次，加入1:2000稀释的hrp标记的羊抗兔igg-hrp，37℃作用2h后，进行显色。结果：重组bl21-a、bl21-b、bl21-c表达的p-a、p-b、p-c蛋白，可分别与兔抗apga型、b型、c型阳性血清发生特异性反应。2.4重组蛋白p-a、p-b、p-c的纯化按实施例2.1中的方法分别诱导表达bl21-a、bl21-b、bl21-c重组表达菌各500ml，离心收集菌体，重悬于50ml菌体裂解液中，室温作用30min，2～8℃冰浴超声波裂解后12000rpm离心30min，收集含有可溶性蛋白的上清液。上清经his亲和层析纯化重组蛋白，将纯化的重组蛋白装入透析袋中，用ph值7.4pbs于2～8℃搅拌条件下透析处理，收集透析后的重组蛋白进行sds-page检测及蛋白浓度测定，经分析纯化的p-a、p-b、p-c蛋白浓度分别为1.5mg/ml、1.0mg/ml、1.0mg/ml。实施例3鸡传染性鼻炎疫苗的制备3.1重组鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备将p-a、p-b、p-c重组蛋白按照一定比例组合，加入吐温-80制备成水相，再将水相与进口白油按1:2体积混合乳化制成含不同浓度三种重组蛋白成分的鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，每种疫苗中三种重组蛋白成分浓度见表2。表2不同疫苗蛋白含量实施例4鸡传染性鼻炎疫苗检验4.1安全检验取8周龄的spf鸡90只，分为9组，10只/组，免疫实施例3制备的鸡传染性鼻炎疫苗。各组腿部肌肉注射疫苗1.0ml/只，连续观察14日。结果显示上述各疫苗免疫spf鸡观察14日均未见不良反应，精神状态良好，采食、饮水正常，无死亡情况。疫苗注射部位剖检可见部分疫苗残留，但未见硬结、脓肿和溃烂等不良反应。证明本发明鸡传染性鼻炎亚单位疫苗对spf鸡具有较好的安全性。4.2效力检验取8周龄的spf鸡180只随机分成18组，10只/组，免疫实施例3制备的鸡传染性鼻炎疫苗。第1～6组分别免疫疫苗1～6，第7～9组免疫疫苗7，第10～12组免疫疫苗8，第13～15组免疫疫苗9，第16～18组不免疫作为对照。各免疫组注射疫苗0.5ml/只，对照组注射pbs0.5ml/只，免疫后28天，第1、2、7、10、13、16组，眶下窦注射a型hn3株菌液0.2ml(含活菌数约为2.0×104cfu)；第3、4、8、11、14、17组，眶下窦注射b型hn5株菌液0.2ml(含活菌数约为1.0×104cfu)；第5、6、9、12、15、18组，眶下窦注射c型sd3株菌液0.2ml(含活菌数约为1.0×104cfu)。连续观察7日，出现面部肿胀或流鼻涕任一项症状即判为发病，攻毒保护结果见表3。结果显示针对副鸡禽杆菌a型，疫苗1不能提供有效的免疫保护，疫苗2、疫苗7、疫苗8、疫苗9可提供完全的免疫保护；针对副鸡禽杆菌b型，疫苗3不能提供有效的免疫保护，疫苗4、疫苗7、疫苗8、疫苗9可提供完全的免疫保护；针对副鸡禽杆菌c型，疫苗5不能提供有效的免疫保护，疫苗6、疫苗7、疫苗8、疫苗9可提供完全的免疫保护；各攻毒对照组全部发病。表明本发明提供的副鸡禽杆菌a型重组蛋白具有良好的免疫原性，单价疫苗重组蛋白含量≥25μg/ml或三价疫苗重组蛋白含量≥15μg/ml时对同源菌株即可产生100％的免疫保护；副鸡禽杆菌b型重组蛋白具有良好的免疫原性，单价疫苗重组蛋白含量≥50μg/ml或三价疫苗重组蛋白含量≥25μg/ml时对同源菌株即可产生100％的免疫保护；副鸡禽杆菌c型重组蛋白具有良好的免疫原性，单价疫苗重组蛋白含量≥25μg/ml或三价疫苗重组蛋白含量≥15μg/ml时对同源菌株即可产生100％的免疫保护。进一步说明本发明提供的三价疫苗具有更好的免疫效果。本发明提供的三价疫苗较各自对应的单价疫苗在更低含量时具有相同的免疫效果，本发明的三价疫苗中三种亚单位抗原蛋白之间产生了协同增效作用，提高了各亚单位抗原蛋白的免疫效果。表3鸡传染性鼻炎疫苗的免疫保护结果实施例5鸡传染性鼻炎疫苗对异源菌株的交叉保护试验取8周龄的spf鸡240只随机分成24组，10只/组，免疫实施例3制备的疫苗8。第19组、21组、23组、25组、27组、29组、31组、33组、35组、37组、39组、41组为免疫组，第20组、22组、24组、26组、28组、30组、32组、34组、36组、38组、40组、42组为不免疫作为对照。各免疫组注射疫苗0.5ml/只，对照组注射pbs0.5ml/只，免疫后28天，第19、20组20只鸡，眶下窦注射早期分离株a型hpg-8株菌液0.2ml(含活菌数约为2.0×106cfu)；第21、22组20只鸡，眶下窦注射新近从中国河北省分离的a型hb2株菌液0.2ml(含活菌数约为2.5×105cfu)；第23、24组20只鸡，眶下窦注射新近从中国江苏省分离的a型js6株菌液0.2ml(含活菌数约为2.5×105cfu)；第25、26组20只鸡，眶下窦注射新近从中国广东省分离的a型gd11株菌液0.2ml(含活菌数约为2.5×105cfu)；第27、28组20只鸡，眶下窦注射新近从中国北京市分离的b型bj4株菌液0.2ml(含活菌数约为5.0×105cfu)；第29、30组20只鸡，眶下窦注射新近从中国江西省分离的b型jx16株菌液0.2ml(含活菌数约为2.5×105cfu)；第31、32组20只鸡，眶下窦注射新近从中国山东省分离的b型sd4株菌液0.2ml(含活菌数约为2.2×105cfu)；第33、34组20只鸡，眶下窦注射新近从中国浙江省分离的b型zj3株菌液0.2ml(含活菌数约为2.5×105cfu)；第35、36组20只鸡，眶下窦注射早期分离株c型hpg-668株菌液0.2ml(含活菌数约为2.0×106cfu)；第37、38组20只鸡，眶下窦注射新近从中国安徽省分离的c型ah1株菌液0.2ml(含活菌数约为2.0×105cfu)；第39、40组20只鸡，眶下窦注射新近从中国河南省分离的c型hn1株菌液0.2ml(含活菌数约为2.0×105cfu)；第41、42组20只鸡，眶下窦注射新近从中国gd省分离的c型gd12株菌液0.2ml(含活菌数约为2.0×105cfu)。连续观察7日，出现面部肿胀或流鼻涕任一项症状即判为发病，攻毒保护结果见表4。结果表明，对于异源菌株的攻毒，鸡传染性鼻炎亚单位疫苗可产生较好的免疫保护效果。表4鸡传染性鼻炎亚单位疫苗对异源菌株的交叉保护结果实施例6鸡传染性鼻炎亚单位疫苗与进口苗对spf鸡的效力比较取8周龄的spf鸡90只随机分成9组，10只/组，第43组、46组、49组免疫实施例3制备的疫苗8，第44组、47组、50组免疫进口鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗10(含a型w株，含量为灭活前≥6×108cfu/ml；含b型spross株，含量为灭活前≥6×108cfu/ml；含c型modesto株，含量为灭活前≥6×108cfu/ml)，第45组、48组、51组作为攻毒对照组。免后28日，第43组、44组和45组30只鸡，眶下窦注射a型hn3株菌液0.2ml(含活菌数约为2.0×104cfu)；第46组、47组和48组30只鸡，眶下窦注射b型hn5株菌液0.2ml(含活菌数约为1.0×104cfu)；第49组、50组和51组30只鸡，眶下窦注射c型sd3株菌液0.2ml(含活菌数约为1.0×104cfu)。连续观察7日，攻毒保护结果见表5。结果表明，疫苗8、进口苗疫苗10免疫组与攻毒对照组相比，免疫组与对照组保护率存在极显著差异，疫苗8免疫组保护效果优于进口苗，进一步说明本发明的亚单位疫苗具有较好的免疫保护效果。表5鸡传染性鼻炎亚单位疫苗与进口苗对spf鸡的效力比较结果实施例7新城疫基因ⅶ型n7a株抗原的制备ndvn7a株毒种用灭菌生理盐水稀释10,000倍，接种10日龄spf鸡胚20枚，每胚接种0.1ml，置37℃继续孵育。将接种后24h内死胚弃去，24h～120h死胚及时放4℃，120h收混合样，测定制苗毒的ha和eid50分别为9.6和109.5eid50/0.1ml。将测定好效价的新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％，37℃灭活16小时。实施例8鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗的制备取实施例2、7制备的副鸡禽杆菌p-a、p-b、p-c重组蛋白及新城疫基因ⅶ型n7a株抗原制备疫苗11，将四种抗原液根据联苗最终的抗原含量制备成混合抗原液，然后将抗原液与进口白油按1:2体积混合，800rpm搅拌40min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度不超过0.01％。疫苗11具体配方如表6。表6鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗成分及含量成分疫苗11p-a(μg/ml)25p-b(μg/ml)50p-c(μg/ml)25n7a株eid50(eid50/0.1ml)108.0白油佐剂(v/v)66％实施例9鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗的免疫效果试验1、新城疫部分选取30日龄spf鸡20只，分成两组，10只/组。第52组免疫实施例8制备的疫苗11，20μl/只，第53组作为对照组。免疫后21日，每只鸡采血，分离血清，测定hi抗体效价。同时免疫组和对照用新城疫病毒hn1101株105eid50/只的剂量肌肉注射攻击，观察14日，记录发病数、死亡数及保护率，结果见表7。可见，免疫鸡hi抗体效价的几何平均值均≥4log2，对照鸡hi抗体效价的几何平均值均≤2log2，符合效检标准。表7鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗新城疫部分效力试验结果注：hi抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数，标示为x±sd，x代表平均数，sd代表标准差。结果显示，疫苗11免疫组在免疫后21天能产生较高的抗体，与对照相比，可以完全保护新城疫强毒的攻击。证明了疫苗11能保护致死剂量的新城疫强毒攻击，疫苗含量不小于108.0eid50/0.1ml即可提供对鸡群的完全保护。2、鸡传染性鼻炎部分选取56日龄spf鸡60只随机分成6组，10只/组，第54～56组免疫实施例8制备的疫苗11，第57～59组为对照组。各免疫组注射疫苗0.5ml/只，免疫后28天，第54组、第57组眶下窦注射hn3株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)；第55组、第58组眶下窦注射hn5株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)；第56组、第59组眶下窦注射sd3株鸡肉汤12小时培养物稀释液0.2ml(约2万活菌)。观察7日，攻毒保护结果见表8。攻毒对照组鸡只全部发病(面部肿胀或流鼻涕)，免疫组鸡只全部保护。表8鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗鸡传染性鼻炎部分效力试验结果上述结果证明本发明的鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗符合制品要求，具有良好的免疫保护效果，能有效防止两种疫病的暴发。实施例10鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗对蛋鸡的应用试验从有鸡传染性鼻炎发病的鸡场选取1000只开产蛋鸡，鸡群中鸡只临床表现为开产期明显推迟，且伴随有部分鸡只面部肿胀、流鼻涕和结膜炎等症状发生，虽经抗生素紧急进行治疗，症状无明显改善，说明鸡群中感染的菌株为耐药菌株，后对发病鸡进行病原分离，可分离到副鸡禽杆菌病原，随机分为两组，500只/组，a组为疫苗接种组，b组为空白对照组。a组在试验开始当天(第0天)，接种实施例8制备的疫苗11，剂量为0.5ml/只。b组不接种疫苗作为空白对照。记录产蛋率，免疫后第12周终止试验。在试验初期，两组产蛋率相当，无差异。从第2周开始两组鸡只产蛋率已经出现显著差异，直至试验结束。与空白对照组相比，a组试验鸡只在免疫后，其产蛋率逐渐恢复，第8周左右恢复至正常水平。产蛋率统计结果见表9。表9鸡只产蛋率统计结果试验周数a组(平均值)b组(平均值)差值p值*164.9％64.4％0.5％0.34ns269.0％62.1％6.9％＜0.01372.1％60.1％12.0％＜0.01475.2％59.1％16.1％＜0.01578.8％60.7％18.1％＜0.01682.7％60.1％22.6％＜0.01786.8％61.5％25.3％＜0.01889.2％65.2％24.0％＜0.01988.5％64.0％24.5％＜0.011090.1％60.7％29.4％＜0.011191.0％60.5％30.5％＜0.011291.0％61.8％29.2％＜0.01*表示组间比较t检验之p值，ns表示差异不显著，p≤0.01表示差异极显著。上述田间实验证明了本发明鸡传染性鼻炎、新城疫基因ⅶ型二联灭活疫苗对感染鸡传染性鼻炎的鸡群有着良好的免疫保护作用，由于该鸡群已经感染了鸡传染性鼻炎，本发明的疫苗组合物具有针对鸡传染性鼻炎混合感染的减产具有治疗作用，能够缩短病程，减少损失。sequencelisting<110>普莱柯生物工程股份有限公司<120>一种副鸡禽杆菌抗原蛋白、含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物、及其制备方法和应用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1635<212>dna<213>副鸡禽杆菌a型hn3株(avibacteriumparagallinarumaserotype,strainhn3)<400>1gatggcaccattacctttaccaacattggcggcaccggtcaagctaccatccacgatgcg60attaacaacgttctgactaaaggtatctacctgaaagcggatcagaacgatccaaccggt120aaccaaggtcagaaagtggaactgggtaacgcaatcaccctgtctgcaaccaaccaatgg180gcgaacaacggcgtaaactataaaaccaacaacctgaccacttataactctcaaaacggc240accattctgtttggtatgcgtgaagatccatctgtaaaacaaattaccgcgggtacctat300aacaccaccggtgatgcgaacaacaaaaaccaactgaacaacaccctgcaacaaaccacc360ctggaagcaactggtatcacctctagcgtaggttctactaactacgcgggcttcagcctg420ggggcagacagcgttaccttctctaaaggtggtgctggcaccgtgaaactgtctggcgta480agcgatgccaccgccgacaccgacgctgccactctgaaacaagtgaaagaataccgcacc540accctggtgggtgataacgacatcaccgcagcagatcgttctggcggcaccagcaacggc600attacctacaacctgagcctgaacaaaggtaccgtttctgcaaccgaagaaaaagtggtg660tctggtaaaactgtttatgaagccattcgtaacgccatcaccggcaacatcttcaccatt720ggcctggacgataccaccctgaacaaaatcaacaacccggcggatcaagatctgtctaac780ctgtctgaatctggcaaaaacgccattaccggcctggtggatgtggtgaaaaaaaccaac840tctccgatcaccgttgagccgtctaccgatagcaacaagaaaaaaaccttcactgtaggc900gtggatttcaccgataccattaccgaaggtgacgcaaccgatgataaaaaactgaccact960tctaaatccgttgaaagctatgttaccaacaaactggcgaacttctctaccgatattctg1020ctgtctgatggtcgttctggtaacgcaaccaccgcaaacgatggtgtgggtaaacgtcgt1080ctgtctgatggctttaccatcaaatctgaaaactttaccctgggttctaaacaatataac1140ggctctgatagcctgggtgtaatgtatgacgatcaaaacggtgtttttaaactgagcctg1200aacatgaccgcactgaccacttctctggctaacactttcgcgaagctggatgcctctaac1260ctgactgatgatagcaacaaagagaaatggcgtactgcgctgaacgtgtattctaaaacc1320gaagtagatgcagaaattcaaaaatccaaggtaaccctgaccccagattcgggcctgatc1380ttcgcaaccaaacaagctggttctggtaacaacgcaggtattgatgctggtaacaagaaa1440atttctaacgttgccgatggtgatatttctccaacctctggtgatgtagtgaccggtcgt1500cagctgtacgccctgatgcagaaaggtattcgcgtgtatggtgatgaagtttctccaacc1560aagactcaaaccaccgcaccgaccaacgcaaacccaactgcgaccaccgcaccgaccgca1620tctagcactcaaggt1635<210>2<211>1620<212>dna<213>副鸡禽杆菌b型hn5株(avibacteriumparagallinarumbserotype,strainhn5)<400>2gatggcaccattacctttaccaacattggcggcaccggtcaagataccatccacgatgcg60attaacaacgttctgaccaaactgatctctctgtctgcaaccgaagaagaagtggtgtcg120ggtgagccggtgtacgaaccactgaaaggtgcaaaaccaaccgtttctgcagaagccaac180aaagacattactggcctggtggatgtggtgaaaaaagcaaactctccgatcaccgttgag240ccgtctaccgataacaacaagaaaaaaaccttcactgttggcctgatgaaagacattgaa300ggtgtaaacagcattacctttgataagtctggtcaagatccaaaccaagttaccggccgt360atgagctctgcgggtctgaccttcaaaaaaggcgacaccaccaacggttctaccaccact420tttgcagaagatggcctgaccattgatagcaccaccaactctgctcaaaccaacctggtg480aaagtatctcgtgatggcttctctgtgaaaaacggcagcgatgaaagcaaactggccccg540accaaactgtctatcggtgcggaaaacgcagaacacgttgaagtaactaaatctggcatc600gccctgaaagcggataacacctccgataaatctcgcatcaccctggcccaagatgcgatt660actctggcgggtaacgcaaccggtaccgcgattaaactgactggtgttgcagatggcaac720attaccgcaaactctaaagatgcggtaaacggtggtcagctgcgtaccctgctgggtgtt780gatagcggtgctaaaattggcggtactgagaaaaccaccatctctgaagccatttctgat840gtgaagcaagctctgaccgatgcgaccctggtatataaagcggacaacaaaaacggtaaa900accgttaaactgactgacggtctgaactttactagcaccaccaacattggcgcctctgta960gaagattctggtgtggtgaaattcaccctgaaagatcgtctgaccggcctgaaaactatc1020gtaactgagtctctgaacgcttctcaaaacattattgctggcggcaccgtaaccgtgggc1080ggcgagaccgagggcattgtgctgaccaaatctggctctggtaacgaccgcactctgtct1140ctgtctggtgcaggcaacgcagcaaccgatggcattaaagtttctggcgtgaaagcaggt1200accgcagacaccgatgcggtgaacaaaggtcagctggataaactgtttaaagcgatcaac1260gacgcactgggcaccaccgatctggcggtaaccaaaaacccaaaccaaacctctatcttt1320aacccgatcaacggcaccgctccaaccacctttaaagacgcggtggataaactgaccacc1380gctgtgaacaccggttggggttctaaggtaggtattctggcaaccggtattgatggtatt1440gatgctggtaacaagaaaatttctaacgttgccgatggtgatatttctccaacctctggt1500gatgtagtgaccggtcgtcagctgtacgccctgatgcagaaaggtattcgcgtgtatggt1560gatgaagtttctccaaccaagactcaaaccaccgcaccgaccgcatctagcactcaaggt1620<210>3<211>1620<212>dna<213>副鸡禽杆菌c型sd3株(avibacteriumparagallinarumcserotype,strainsd3)<400>3gatggcaccattacctttaccaacattggcggcaccggtcaagataccatccacgatgcg60attaacaacgttctgaccaaactgatctctctgtctgcaaccgaagaagaagtggtgtct120ggtgaagctgtttatgatgcactgaaaggtgcaaaaccaaccgtttctgcagaagccaac180aaaggcattactggcctggtggatgtggtgaaaaaagcaaactctccgatcaccgttgag240ccgtctaccgataacaacaagaaaaaaaccttcactgttggcctgatgaaagacattgaa300ggtgtaaacagcattacctttgataagtctggtcaagatctgaaccaagttaccggccgt360atgagctctgcgggtctgaccttcaaaaaaggcgacaccaccaacggttctaccaccact420tttgcagaagatggcctgaccattgatagcaccaccaactctgctcaaaccaacctggtg480aaagtatctcgtgatggcttctctgtgaaaaacggcagcgatgaaagcaaactggcctct540accaaactgtctatcggtgcggaaaacgcagaacacgttgaagtaactaaatctggcatc600gccctgaaagcggataacacctccgataaatctagcatcaccctggcccaagatgcgatt660actctggcgggtaacgcaaccggtaccgcgattaaactgactggtgttgcagatggcaac720attaccgtaaactctaaagatgcggtaaacggtggtcagctgcgtaccctgctgggtgtt780gatagcggtgctaaaattggcggtactgagaaaaccaccatctctgaagccatttctgat840gtgaagcaagctctgaccgatgcgaccctggcatataaagcggacaacaaaaacggtaaa900accgttaaactgactgacggtctgaactttactagcaccaccaacattgatgcttctgtg960gaagataacggtgtggtgaaattcaccctgaaagataaactgaccggcctgaaaactatc1020gcaactgaatctctgaacgcttctcaaaacatcatcgctggcggtaccgtaaccgtgggc1080ggcgagaccgagggcattgtgctgaccaaatctggctctggtaacgaccgcactctgtct1140ctgtctggtgcaggcaacgcagcaaccgatggcattaaagtttctggcgtgaaagcaggt1200accgcagacaccgatgcggtgaacaaaggtcagctggataaactgtttaaagcgatcaac1260gacgcactgggcaccaccgatctggcggtaaccaaaaacccaaaccaaacctctatcttt1320aacccgatcaacggcaccgctccaaccacctttaaagacgcggtggataaactgaccacc1380gctgtgaacaccggttggggttctaaggtaggtattctggcaaccggtattgatggtatt1440gatgctggtaacaagaaaatttctaacgttgccgatggtgatatttctccaacctctggt1500gatgtagtgaccggtcgtcagctgtacgccctgatgcagaaaggtattcgcgtgtatggt1560gataaagtttctccaaccaagactcaaaccaccgcaccgaccgcatctagcactcaaggt1620当前第1页12